專利名稱：：多種系干細胞的分離的制作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞分離領域。本發明還涉及分離各種類型的干細月包或一且細月包的方法。
背景技術：
：已知骨髓含有造血干細月包和間充質干細月包以及一且細月包。造血干纟田胞(HSC)可產生各種類型的血液細胞[l]，而髓間質細月包(MSC)或間充質干細胞能夠分化成若千不同組織，包括軟骨、骨和脂肪[2,3，4]。MSC首先由Friedenstein和他的同事[5]基于它們對細月包培養皿的粘附性發現的。未分化的MSC在形態上是成纖維細力包狀，自我更新，并且能夠分化成主要為中胚層起源的結締組織，即庫欠骨、骨、和脂肪。還沒有確定的特異且唯一識別MSC的細胞表面蛋白。MSC相關的特性的多樣性可通過組織起源、分離方法和實-瞼室之間的培養條件的差異進行解釋[2,6,7，8]。盡管缺乏一致性，但是體內擴展的MSC表達CD29、CD44、CD73、CD105、CD106和CD166[9],Y旦缺少造血表面標記物如CDllb、CD14、CD31、CD34或CD45或者對于這些標記物是微弱陽性的。具有類似于來自不同源(主要包括骨髓、臍帶血和脂肪組織)MSC的特性的細胞種群是已知的。盡管由于缺少特性標記物而很難鑒別這些細胞是否屬于不同細胞類型，但是它們具有一些不同水平的表面標記物表達和各種分化能力，這可能是由于它們的不同分離和培養方法。MSC的分化的可能范圍是不^f義擴展至中胚層種系而且擴展至內胚層和/或外胚層種系。因此，術i吾"多種系千細月包或S且細胞(MLS/PC)"是指這些類型的干細胞或祖細胞，其能夠分化為中胚層、外胚層和/或內胚層種系。來源于成熟骨髓的MSC提供了打開一個新的醫學策略的可能性，這是因為它易于分離和培養、它們的表現型在體外的穩定性以及低的或沒有同種(異體)排斥。實際上，已經積累了MSC在人類和動物種的〗氐免疫原性的實—驗i正才居[10]。目前，已經在實施成熟自體同源或同種異體MSC的臨床應用，用于治療各種疾病，并且已經產生非常理想的結果[U]迄今，對于在培養基中分離和擴展MSC已經開發了若干方法。這些方法是基于利用密度梯度離心[12]、FACs篩選[13，14]、特異細胞表面抗體[12,15,17,18]、對昆布氨酸涂覆板的選擇性粘附[19]、Hoechest染料排除和尺寸篩選培養[24]的。依據臨床應用，這些方法潛在的缺點是培養細胞的異質性(不均勻性)、污染的高危險性、和/或生產的高成本。因此，對于臨床環境中應用，需要一種新的方法，在較低污染可能性和成本條件下分離高度同源(均勻)細胞種群。本申請7>開了一種新的分離方法，開發用于生產臨床應用中具有較低污染可能性和成本的高度同源MLSC種群。該方法不必需利用密度梯度離心、抗體選取、或FACS篩選，而是優選主要使用未涂覆的、骨膠原或多熔素涂覆的培養皿和細分級細胞培養基中的自然重力，以根據它們的細胞密度來分離粘附性骨髓細胞。分離了來源于單細胞源集落的MLSC系的若干不同的高度同質(均勻)種群并利用該方法乂人人類骨ft進4亍擴展。這些干細月包系是自我可更新的并且能夠分化成若干不同種系，如成軟骨種系、成骨(骨原)種系、成月旨肪種系、4申纟至原、寸生(neurogenic)種系和肝原寸生(hepatogenic)種系。
發明內容本發明提供成熟干細胞或祖細胞，其可用來治療疾病如移植物4元宿主病(graftversushostdisease)、骨關節炎、風濕'l"生關節炎、成骨不全和其他疾病，以及》f復組織如皮膚、軟骨、骨、月幾肉和神經。本發明涉及一種處理細胞的生物學樣品的方法，包括(i)使細胞樣品沉積在一個容器中；(ii)將上清液,人該容器轉移到另一個容器；以及(iii)從該上清液分離細胞，其在所述樣品中具有相對較低的密度。細胞的樣品可以與生長介質混合。此外，在上述方法中，步驟(i)和(ii)實施至少三次，并且從來自上清液的分離細胞可以在容器中擴展。容器可以具有平底，并且可以涂覆有細胞粘附劑。細胞粘附劑可以是帶正電荷或負電荷的分子。優選地，該細胞粘附劑可以是骨月交原、多熔素(聚賴氨酸，polylysine)、或其他帶電荷的氨基酸，如聚精氨酸(polyarginine)、聚天冬氨酸酯(鹽)(polyaspartate)、聚谷氨f復酯(鹽)(polyglutamate)或者它們的組合。細胞的樣品可以從骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、或細胞因子活化的外周血獲得，并且可以分離出多種系干細胞或祖細月包的單個集落。在一個方面，本發明涉及分離多細月包種系干細月包。該細月包可以是祖細月包。在一個實施方式中，所述分離方法可以不包括細胞樣品的離心步驟。在另一個實施方式中，細胞的生物學樣品可以在進^f亍任何離心之前獲得。而在另一個實施方式中，細月包的生物學才羊品可以在進行離心之后獲得，優選通過通常用于MSC分離的傳統密度梯度離心方法分離或分《及的單核細月包。在另一方面，本發明涉及一種制備內胚層、中胚層或外胚層細胞種系的方法，其中通過使適當誘導或轉化/分化介質與利用如本文描述的制備方法獲得的分離多種系干細胞進行4妻觸。才艮據本發明的以下描述、所附的參考附圖以及4又利要求書，本發明這些和其他目的將更充分地被理解。根據下文給出的詳細描述和附圖將更充分地理解本發明，附圖4義以舉例i兌明的方式給出，因此不是對本發明的限制，并且其中圖1示出了利用細分級培養方法(亞組分培養方法，subfractionculturingmethod)用于從人類骨髓分離多種系千細胞的總體流程圖。簡言之，將1ml的人類骨髓與15ml的DMEM-HG、DMEM-LG、或a-MEM(20%FBS)混合并鋪在10cm2細月包;咅養皿上。在2小時孵育之后，〗又將上清液轉移到新的培養亞。再重復一次。然后將上清液轉移到未涂覆的、骨月交原或多熔素涂覆的培養皿。乂人這個階—歐開始，爿夸細力包孵育l天兩次和2天一次。孵育最^^的上清液直至出現單個細月包集落。當單個細胞集落大到足以轉移到6孔一反時，將細胞擴展至更大玲反以用于進一步研究。圖2A-2D示出了,人骨髓分離的多種系干細胞的形態特性。(A&B)在骨髓細胞最后細分級之后三天的MLSC。細胞具有成纖維細胞狀的形態。放大(A)40X和(B)200X。(C)在第7天具有稠密和均勻形態的達到鋪滿的細胞。在分離的MLSC的六次傳代之后，相比于處于較早傳代的MLSC,小部分(少于2~3%)的MLSC的形態變成更寬和更大的形狀。分離和擴展MLSC的形態是紡4垂形^!犬，類似于已知的髓間質干細月包。圖3A-3D示出了四種已建立的來自骨髓的多種系干細胞系的形態。稱為A.D4(#l)、B.D4(#3)、C.D5(#1)和D.D5(#2)的四種已建立的多種系干細胞系(生長至約70~80%匯合)的照片。已建立的多種系干細胞系的形態是紡錘形并且這些干細胞生長如其他成纖維細爿包一才羊快。圖4示出了通過細分級i咅養方法來自骨髓的分離MLSC的纟田月包表面蛋白。流式細胞儀分析表明，MLSC對于典型MSC整聯蛋白(CD29)和基質受體(CD44和CD105)—貫是陽性。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville,MD,USA)細月包用作對照。已知典型MSC表達的細胞表面蛋白也在MLSC中被表達，表明MLSC可能具有MSC特性。圖5示出了在通過細分級培養方法乂人骨髓分離的MLSC上沒有觀察到造血干細胞表面蛋白。流式細胞儀分析表明，MLSC對于用于早期造血干細胞的HLA-DR和CD34標記蛋白是陰性的。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville,MD,USA)細月包用作對照。這些結果表明，分離的MLSC不具有造血干細胞表現型。圖6示出了在通過細分級培養方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細胞表面蛋白CD31(PECAM)表達的比較。D4(#1)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD31的表達通過FACS分析進4亍才企觀'J。已建立的MLSC系D4(弁3)對于CD31是樣l弱陽性，而其他MLSC系是陰性的。生長介質中的FGF增加D5(#2)的CDM的表達。這些結果表明，D4(#3)在分化能力和/或細胞功能上具有不同的細月包4爭性。圖7示出了在通過細分級培養方法/人骨髓分離的MLSC系上觀察到的細月包表面蛋白CD105(SH2)表達的比專交。D4(弁l)、D4(弁3)、D5(#2)禾口D5(#2)(具有FGF)的CD105的表達通過FACS分斗斤進行檢觀'J。已建立的MLSC系D5(#1)表現出中等水平的CD105表達，而其j也干細月包系表iE見出高水平的CD105。這些結果表明，D5(#1)在分化能力和/或細胞功能上具有不同的細胞特性。圖8示出了在通過細分級培養方法乂人骨髓分離的MLSC系上XC察到的纟田月包表面蛋白CD73(SH3,SH4)表達的比專交。D4(弁l)、D4(#3)、D5(#2)禾口D5(#2)(具有FGF)的CD73的表達通過FACS分析進行4全測。已建立的MLSC系D4(弁1)表現出非常低水平的CD73表達，并且D4(弁3)和D5(弁2)表現出中等水平，而D5(弁1)一點也不表達。這些結果表明，每一個千細胞系在分化能力和/或細胞功能上具有獨特的細"包特性。圖9示出了在通過細分級培養方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細月包表面蛋白CD34表達的比專交。D4(#l)、D4(#3)、D5(#2)和D5(#2)(具有FGF)的CD34的表達通過FACS分析進行檢測。已建立的MLSC系D4(#1)、D4(弁3)和D5(弁2)表現出低水平的CD34表達，而D5(#1)表現出沒有CD34表達。這些結果表明，每一個千細胞系在分化能力和/或細胞功能上具有獨特的細胞特性。圖10A-10D示出了分離MLSC的成軟骨分化。利用甲苯胺藍(Toluidine-blue)的組織化學染色表明，成壽欠骨分化的MLSC對于該染色是高度陽性的(在成軟骨i秀導后21天進4亍測試)。(A&B)在常身見介質(常*見血清《且，regularmedium)中生長的細月包團塊。(C&D)在成軟骨誘導介質中生長的細胞團塊。結果表明，在成軟骨誘導介質中生長的MLSC分泌高水平的蛋白聚糖(proteoglycans)并且可^皮分化成專欠骨細胞。圖11A-11D示出了分離MLSC的成骨分化。在成骨i秀導后21天，利用馮.科薩染劑(vonKossastain)的組織化學染色顯示出存在與成骨分化的MLSC中基質有關的礦物。(A&B)在常規介質中生長的細胞團塊。(C&D)在成骨誘導介質中生長的細胞團塊。結果表明，在成骨誘導介質中生長的MLSC可生成高水平的鈣并且可凈皮分4b成骨細月包。圖12A-12D示出了分離MLSC的成脂肪分化。利用油紅-O(Oilred-O)的組織化學染色表明，成脂肪分化的MLSC對于該染色是高度陽性的(在成脂肪誘導后21天進行測試)。(A&B)在常規介質中生長的細胞團塊。(C&D)在成脂肪誘導介質中生長的細胞團塊。結果表明在成脂肪"i秀導介質中生長的MLSC可產生中性脂類液泡并且可一皮分化成脂肪纟田月包。圖13A-13I示出了分離MLSC的神經原性分化。利用GFAP、Nestin(巢蛋白)、和NeuN抗體的免疫組織學染色表明，用FGF生長的神經原性分化的MLSC對于該染色是高度陽性的(在神經原性i秀導后7天和14天進4亍測試)。(A，D&G)在標準i咅養基中生長并用所述抗體孵育的MLSC。(B,E&H)在神經原性-漆導后7天用每一種抗體染色的細胞。(C,F&I)在神經原性誘導后14天用每一種抗體染色的細胞。結果表明，在神經原性誘導介質中生長的MLSC可分別合成神經月交質細胞特異性蛋白、月交質纖維酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神經細月包標i己蛋白、Nestin和NeuN，并且可^皮分化成一申經細月包。圖14A-14I示出了用FGF生長的分離MLSC的神經原性分化。利用GFAP、Nestin、和NeuN抗體的免疫組織學染色表明，用FGF生長的神經原性分化的MLSC對于該染色是高度陽性的(在神經原性-秀導后7天和14天進4亍測試)。(A,D&G)在標準培養基中生長并用所述抗體孵育的MLSC。(B,E&H)在3申經原性:秀導后7天用每一種抗體染色的細胞。(C,F&I)在神經原性諸導后14天用每一種抗體染色的細胞。結果表明，在具有FGF的神經原性誘導介質中生長的MLSC可分別合成神經力交質細月包特異性蛋白、月交質纖維酸性蛋白(GFAP)、早期和晚期神經細月包標記蛋白、Nestin和NeuN,并且可一皮分化成神經細月包。圖15A-15D示出了在肝原性-秀導介質中生長的分離MLSC的形態變化。在肝原性誘導介質中生長后14天觀察形態變化。(A)在標準培養基中生長的MLSC的形態。(B，C&D)在肝原性誘導介質中生長14天的MLSC的肝臟形態變化。結果表明，在肝原性i秀導介質中生長的MLSC可分化成肝細胞。圖16A-16F示出了通過RT-PCR分析觀察到的軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、肝細胞和神經細胞特異性基因表達。總RNA通過RT-PCR分析(A)II型骨膠原(成軟骨的，500bp)、(B)骨橋蛋白(成骨的，330bp)、(C)過氧化物酶體增殖子活化的受體(PPAR^2)(成脂肪的，352bp)、(D)神經絲分子(NF-M)(神經原性的，430bp)以及(E)曱胎蛋白(aFP)(肝原性的，216bp)的表達。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達用作內部對照。M:DNA分子大小標記物；N:未i秀導的；C:成4欠骨的；O:成骨的；A:成脂肪的；Ne:神經原性的；以及H:肝原性的。這些結果有力地表明，分離的MLSC可在每一種特定分化條件下表達細胞特異性基因并且可被分化成多種系。圖17示出了分離MLSC系的細月包因子分泌。利用Q廳tikine⑧H膽anTGF-(31、b-NGF、LIF、ILIO、HGF、IL2、TGF-a、和IL12，對MLSC培養物上清液的等分樣品通過ELISA進行分析。TGF-(31、LIF、TGF-a和IL10表現出高水平的分泌，而其他表現出低的或沒有分泌。通過分離MLSC的高水平TGF-pi分泌表明，這些干細胞可在抑制T細胞活化中起作用。而且，相對高7jc平的其他細月包因子如LIF、TGF-a和ILIO表明這些細刀包可以具有免疫調節活性。具體實施例方式在本申"i青中，"一個"和"一種"用來指單個和多個目標。如本文使用的，"體樣(身體樣品，bodilysample)"是指獲自哺乳動物的期望用來分離單個細胞型的任何樣品。這樣的體樣包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、和細胞因子活化的外周血。如本文使用的，"細胞的樣品(細月包樣品)"是指任4可沖羊品，其中包含不同類型細胞的混合物，包括骨髓樣品、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、和細胞因子活化的外周血。如本文使用的，細胞的"同源(均勻)"種群通常表明，相同類型的細胞存在于該種群中。基本上同源的可以表示約80%同源，或約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5。/。、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%同源。如本文使用的，"低密度細胞"是指具有比樣品中的其他細胞更低的密度并且是分離目標的細胞。低密度細胞包括但不限于多種系干細月包、-且纟田月包、其他髓間質細月包。如本文使用的，"MLSC"是指多種系干細胞。如本文使用的，"MLSC/PC"是指多種系干細胞或祖細胞。如本文使用的，"MSC"是指髓間質細胞或間充質干細胞(這些術語可互換4吏用)。細分級技術(subfractionationtechnique)本申請描述了一種新的方法，即細分級培養方法，用于乂人體樣或來源于如人類骨髓分離高度同源的多種系干細胞(MLSC)種群。從1ml的骨髓抽吸物建立了共16個骨髓細胞系。在這16個樣品中，對通過FACS分析表現出不同表現型的4個細胞系進一步表征。所有這些細胞系表現出多種系干細胞的特性，如自我更新能力和分化成中胚層、外胚層和內胚、層種系細月包的能力。已經知道，骨髓MSC很難在沒有污染的情況下通過造血細胞進行分離[20,21]。對于臨床環境中的應用，為了防止免疫原性問題并且為了正確地評價臨床效果，具有同源的MSC種群很重要。傳統地，MSC的同源種群的分離是通過MSC特異性抗體柱純化來實現的。然而，即4吏這種方法也是不足夠的，因為還沒有這樣完好的MSC特異性抗體是可利用的。用于乂人生物學樣品如骨髓樣品分離MLSC的本發明方法的原理是這樣的，多種系干細胞或祖細胞具有低細胞密度，因此它們可以以此為基礎A^樣品的其他細胞中分離出來。例如，成熟MSC比快速自我更新(RS)細胞更大[22，23]。已知RS細胞具有更大的對于多種系分化的能力。在另一方面，使用骨膠原或多熔素涂覆的培養亞，以便獲得更多粘附性千細胞。申請人已發現，相比于未涂覆培養i的表面，任何帶電荷的培養物表面(正或負)有助于千細月包附著至其。相比于未涂覆培養皿，更多細胞附著至骨膠原或多熔素涂覆的培養皿，分別大致為約2-3倍(數據未示出)。依據獲得單細胞來源的髓細胞集落，利用其他人類骨髓抽吸物和三種不同的小鼠骨髓樣品抹獲得相似結果(凄t據未示出)，表明這種方法與其他骨髓抽吸物是一致的，并且也可用來分離在其他物種中的MLSC。因此，在一個實施方式中，培養皿的底部可以涂覆正電荷的氨基酸如多熔素、聚精氨酸、或負電荷的氨基酸如聚天冬氨酸酯(鹽)、粘附至培養皿的底部。為了實施本發明的細分級培養方法，不必需采用^壬Y可類型的離心以從樣品中預除去任何類型的細胞如紅細胞或白細胞，因為大多凄t更重或更密實的細月包可第一、二的2小時孵育步吞聚中除去。因此，本發明體系的一個優點在于，可以避免傳統1吏用的梯度離心和單核纟田月包分纟及步備聚(其可^^夸〉'虧染對勿^口Picoll、Fiscoll或Ficoll陽Hypaque引入細胞培養物中。因此，本發明的細分級培養方法是一種簡單、有效和經濟的方案，用于,人體樣(優選為骨髓樣品)分離高度同源MLSC。可替換地，通過傳統的MSC分離的密度梯度離心方法分離/分級的單核細胞也可》支入Dl培養皿中以獲得單細月包源集落，然后分離千細胞或祖細胞的同源種群。因此，分級培養方法可利用通過傳統密度梯度離心分級的單核細胞來加以應用。本申請描述了在分離單細胞源干細胞系的細胞表面蛋白表達中的特性的多樣性，其表明在生物學樣品(尤其是骨髓樣品)中存在若干不同類型的多種系干細胞或祖細胞(都是示例性的)。分離的MLSC對于CD34、HLA-DR、CD73、CD31、CD166、HLAI類通常是陰性的或才莫糊陽性的，而對于CD44、CD29、CD105是高度陽性的。然而，來自D4和D5培養皿的一些細胞系表現出不同水平的表面蛋白，這表明在骨髓中可存在若干不同類型的多種系千細胞或祖細胞。Hung等人還推測，骨髓可能包括多族的MSC，其在表面標記物分析中不相同[24]。具有不同表面標記物的這些MSC可以代表不同的細胞分化潛力。因此，通過本發明的細分級培養方法分離單細胞源同源干細胞^f吏得有可能分離組織特異干細胞或定型祖細胞，只要這些族的細胞存在于骨髓或其他特異性分離的體樣中，并且培養條件在細胞表達期間不改變它們的潛力。MSC處理和細胞移才直過程的安全性和效力通過能夠用特異性質來表征細胞的亞種群而4尋以改進，如在本申i青中i正實的。本申"i青示出了一種新穎方法，用來從具有更新和多種系分化成外胚層、中胚層和內胚層種系細胞的能力的任何其他體樣(尤其是骨髓樣品)的來源于單細胞MLSC系的高度同源種群。通過消除密度梯度離心和單核細胞分級步驟以及無需使用抗體來分離干細胞，本發明的細分鄉及i咅養方法以簡單、有步丈和經濟的過禾呈產生更多的MLSC的同源種群以及對于治療情形更安全的應用。用于內胚層細胞種系的豫導、分化/轉4匕劑用于內胚層細胞種系的誘導、分化/轉化劑包括以下試劑千細月包生長因子、制瘤素-M(oncostatin-M)、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子-4、^5咸性成纖維細胞生長因子、胰島素、轉鐵蛋白(transferrin)、石西酉臾(seleniusacid)、BSA、亞油酉交、4元i不血酉吏2-磷酸酉旨(鹽)(ascorbate2-phosphate)、VEGF和地塞米松(dexamethasone),用于以下細月包型肝纟田月包、月t纟田月包、月夷&泉細月包、甲狀腺細胞和腸細胞。用于中胚層細自系的"i秀導、分化/轉化劑用于中胚層細胞種系的誘導、分化/轉化劑包括以下試劑胰島素、轉今失蛋白、硒酸、BSA、亞油酸、TGF-pi、TGF-(33、抗壞血酸2-磷酸酯(鹽)、地塞米松、P-甘油磷酸酯、抗壞血酸2-磷酸酯(鹽)、BMP。以及茚甲新(indomethacine),用于以下細月包型專欠骨細胞、骨細胞、月旨肪纟田胞、肌肉細胞和血細胞。用于內胚層細胞種系的+秀導、另S匕/轉化劑用于內胚層細胞種系的誘導、分化/轉化劑包括以下試劑聯丁酰基細胞周期蛋白AMP、異丁基曱基黃噤呤、人類表皮生長因子、石威性成纖維細月包生長因子、成纖維細月包生長因子-8、腦來源的神經營養因子、和/或其他神經營養生長因子，用于以下細胞型神經細胞、皮月夫細胞、月鹵纟田月包、和眼細月包。本發明不局限于通過本文描述的特定實施方式的范圍。事實上，除了本文描述的那些實施方式之外，對于本領i或的寺支術人員來說，才艮據前述和附圖，本發明的各種變形將變得顯而易見。這樣的變形落入所附權利要求的范圍內。以下實施例通過舉例J兌明本發明的方式提供，不用于限制本發明。實施例實施例1-MLSC和細胞培養物的分離在Inha大學醫學院IRB的知會同意和批準之后，將取自經歷骨髓才全查的患者的髏峰(iliaccrest)的1ml丟棄的人骨髓抽吸物與15ml的完全生長介質進行混合物，該完全生長介質為含有高或寸氐葡萄辟唐(GIBCOBRL，life-technologies,MDUSA)的Dulbecco改性的Eagle培養基(DMEM),具有20%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素，然后在100mm培養皿中孵育。如圖1所示，在37。C、5。/。C02孵育2小時后，僅將細胞培養物上清液轉移到未涂覆的、骨月交原或多熔素涂覆的培養亞并孵育2小時(Dl)。在將該上清液再次轉移到新的培養亞之后(D2)，將上清液轉移到新的培養皿，然后孵育1天(D3)。用1天和2天孵育(分別為D4和D5)重復兩次或更多次。將在D4或D5培養i中生長的單個集落首先轉移到100mm板，然后在更大培養瓶中保持擴展。在100mm板中通常10~14天之后，用0.25%月夷蛋白酶和1mMEDTA(GIBCO-BRL)收獲細胞，以lxl()6個細胞/ml懸浮在10%二曱基亞石風(DMSO)和40。/。FBS中，并在液氮中冷凍1ml等分樣品(第1代)。對于單個集落的分開和分離，利用無菌注射器使用胰蛋白酶/EDTA達1-2分4中。一旦細月包達到約80~90%4甫滿(confluence),則、夸它們利用月夷蛋白酶/EDTA回收并以50-100個細月包/cm2重新鋪》丈(r印late)。實施例2-流式細月包〗義分析從單細胞源集落分離和擴展的細胞通過流式細胞儀分析對一板細胞表面蛋白在第3代或第4代進行表征。通過胰蛋白酶/EDTA處理從75cm燒瓶收獲細胞并用PBS洗滌兩次。將細胞在具有0.1%羊血清的PBS孵育用于封閉，然后用洗滌纟爰沖'液(具有0.4%BSA的PBS)洗滌兩次。在4。C下，用異石克氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)-結合的#元體孵育該細月包40min。觀'Ji式的4兀y^、包4舌基質受體(CD13，CD14,CD105)、整聯蛋白(CD29)、PECAM(CD31)、ALCAM(CD166)、SH3和SH4(CD73)、Thy-l(CD90)和造血種系標記物(CD34,HLA-DR，HLA-1類)(BDBiosciencePharmingen，SanDiego,CA,USA)。然后將細胞混合物用洗滌緩沖液洗滌兩次，并利用熒光活化的細胞分選儀(FACS)(具有用于綠色FITC熒光的525nm過濾器并具有用于紅色PE熒光的575nm過濾器)進行分析。作為對照，使用人類的間充質干細胞(HMSC8292,CambrexBioScience,Walkersville,MDUSA)。實施例3_多種系分化的誘導利用第3代或第4代細胞，將團塊培養物分析用于成軟骨、成骨、成脂肪的分化實驗。將在0.5ml培養基中的2xl()S個細胞旋降以形成團塊。將在含有高葡萄糖和20%FBS的DMEM中以下上清液用于每一個種系，成軟骨分化介質6.25嗎/ml胰島素(SigmaChemicalCo,StLouis,MO，USA)、轉《失蛋白(Sigma)、6.25ng/ml竭酸(Sigma)/1.25mg/mlBSA(Sigma)、5.35昭/ml亞油酸(Sigma)、TGF-pl10ng/ml(R&DSystems,Minneapolis,顧，USA)和TGF-(3310ng/ml(R&DSystems,Minneapolis,MN，USA);成骨分化介質50pg/ml抗壞血酸2-石壽酸酯(Sigma)、10-8m地塞米爭》(Sigma)、和10mM(3-甘油磷酸酯(Sigma);成脂肪分化介質抗壞血酸2-磷酸酯(Sigma)、lO-8M地塞米松(Sigma)和50嗎/ml茚曱新(Sigma)。團塊培養物在37。C、5%C02下進行孵育并每3天更換介質。對于神經原性分化，在第3代的分離和擴展細胞利用基礎介質以1><104個細胞的濃度接種到6孔培養板中。在24小時之后，拋棄基礎介質并用神經元分化介質替換。細胞用lmM聯丁酰基細胞周期蛋白AMP(dbcAMP;Sigma,St.Louis,MO)、0.5mM異丁基甲基黃噤吟(IBMC;Sigma,St.Louis,MO)、20ng/ml人類表皮生長因子(hEGF;Sigma,St.Louis,MO)、40ng/ml石成性成纖維細月包生長因子(bFGF;Sigma,St.Louis，MO)、10ng/ml成纖維細月包生長因子-8(FGF-8;PEPROTECHINC，RockyHill,NJ)、10ng/ml腦源神經營養因子(BDNF;R&DSystems,Minneapolis,MN)進4亍i咅養。具有lxB27上清液(GIBCOBRL,Gaithersburg，MD)的NEUROBASAL介質(GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)是用于中4區一申經系統的海馬和其他神經元的長期存活性的無血清基礎介質。對于干細胞分化，在第4代的分離和擴展細胞以濃度1"04個纟田月包鋪入(4妻種于)60mm培養皿中。在24小時之后，細月包用分化介質處理，該分化介質含有20mg/ml干細胞生長因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生長因子(Sigma)、20ng/ml成纖維細胞生長因子-4(R&D)、10ng/ml石咸性表皮生長因子(Sigma)、50mg/mlITS+預混物(BectonDickinson;6.25嗎/ml胰島素、6.25嗎/ml轉鐵蛋白、6.25ng/ml石西酸、1.25mg/mlBSA、5.35mg/ml亞油酸)、0.1(iM抗壞血酸2-石粦酸S旨(Sigma)、1(T8M地塞米松(Sigma)。每3天更換介質。實施例4-組織化學染色和免疫組織化學染色組織化學染色和免疫組織化學研究在開始分化培養之后14天或21天進行。在移出分化介質之后，團塊用PBS洗滌兩次。將團i丸嵌入OCT4匕合物(SakuraFinetek,Torrance,CA,USA)并4奪6切片染色。組織用曱苯胺藍、馮.科薩染劑以及紅油-O染色，以分別顯示成軟骨分化、成骨分化和成脂肪分化。還對n型人類骨力交原實施免疫組織化學染色以i正實該組織的成專欠骨分化。為了神經元細胞的免疫細胞化學染色，接著將所有的孔都用99.9%乙醇固定并用小鼠抗-神經元細月包核抗原(NeuN,10jag/ml)IgG單克隆抗體(Chemicon,Temecula，CA)、小鼠抗-巢蛋白(nestin)(5ng/ml)IgG單克隆抗體(Chemicon,Temecula,CA)和單克隆抗-月交質纖維酸性蛋白(GFAP,1:400;Sigma,St.Louis,MO)在室溫下一示^己1小時。細月包用PBS漂洗，并利用Histostain-Plusi式劑盒(ZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco,CA)沖企觀'J免疫染色。DAB用作色原體(chromogen)。細胞用數碼相才幾拍照以評價神經元特異性標記物的陽性表達。實施例5_RNA提取和RT-PCR分析利用TRIZOL(InvitrogenCo,Carlsbad,CA,USA)試劑，乂人未分化的和分化的細力包纟是取總RNA。利用反轉錄系統試劑盒(Promega)，互補DNA用總RNA(1ng)進行合成。PCR利用設計用于以下每個種系的特異性引物來實施col-2(500bp)，正義(有義).5,一AAGATGGTCCCAA八GGTGCTCG-3'(SSI01-FSEQID緣l)和反義.5,—AGCTTCTCCTCTGTCTCC丁TGC-3'(SS10I-RSEQIDNO:2);骨才喬蛋白(330bp),正義.5'-C'TAGGCATCACCTGTG(:CATACC-3'(SS102-FStQIDNO:J)禾口反義.5'-CGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3畫(SS102陽RSEQIDNO:4);PPAR-y2(352bp)正義'5'-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3'(SS103—FSEQIDN():5)詳口反義.5,_ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3'(SS103-RSEQIDN():6);GAPDH(350bp),正乂詳口反義.5，_TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SS104-RSF,QfDNO:8);NF-M(430bp)正義.5,GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3'(SS105-FSEQIDNO:9)禾口反義.5,CAGCGAT'rrcTATATCCAGAGCC-3'(SS105-RSEQIDNO:10)-,以及aFP(216bp)正義-5:TCiCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'(SS()6-FSEQIDNO:l1)和反義，5、CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3'(SS106-RSEQIDNOd2)。PCR實施35個循環，其中每一個循環為在95。C變性1min,在56°C退火1min,以及在72。C伸長1min。擴增的DNA產物在1%瓊脂糖凝膠上運行。實施例6-結果實施例6.1-骨髓細胞集落的分離和擴展為了考察是否可能通過細分級培養方法分離人類骨髓干細胞或一且細月包，如圖l所描述的，將骨髓與i咅養介質混合并通過〗又轉移細胞培養物上清液到新的培養皿而保持分級。這種分級的原理是基于如下假設骨髓干細胞或祖細胞可能具有低的細胞密度。通常在Dl和D2培養亞中不可能獲得良好分離的單個集落。在Dl和D2培養i中乂見察到存在至少少凄t幾種具有不同形態和尺寸的不同細胞型，表明在骨髓源粘附單層培養物中的細胞異源性。D1或D2培養皿中的粘附細胞分別在從前一培養jnr轉移上清液后7~14天或1421天達到鋪滿。有可能在D3、D4和D5培養皿中獲得良好分離的單細力包源集落。最初粘附性紡《垂形細l包在/人前一i咅養皿轉移上清液后的14~21天之間呈現為單個集落。在D3、D4和D5培養皿中分別出現10個、3個和3個單細胞源集落。圖2示出了在骨髓細胞最終細分級后3天,人骨髓分離的多種系干細胞的形態學特性。細胞具有成纖維細胞狀形態。細胞在第7天達到具有稠密和同源(均勻)形態的鋪滿。在分離MLSC的六次傳代之后，相比于4交早傳代的細月包，少部分(少于2~3%)的MLSC的形態變為更寬和更大形狀。分離和擴展的MLSC的形態是紡名垂形，這類似于已知的髓間質干細胞。一旦大約200~300個細胞的集落形成，則將細胞以如正常成纖維細胞的細胞一樣快速進行增殖。在從D4和D5培養皿中的單個集落產生的6個細胞系之中，4個細胞系通過FACS分析表現出不同表現型并進一步加以表征。在培養皿中處于70-80%鋪滿的這些細胞系示于圖3中。實施例6.2-骨髓細胞系的表現型表征為了表征單細胞源骨髓細胞系的表現型，通過FACS分析對一板細胞表面蛋白進行分析，總結在表1中。表1:通過FACS分析測定的分離MLSC系的細胞表面蛋白表達的總結<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(N-陰性,L-低,I-中，H-高)結果表明，表面表達的總分布外形相似，例如，所有分離的細月包系老卩只于CD29、CD44、CD73(SH3,SH4)、CD90、CD105(SH2)、CD166和HLA-I類是明顯陽性的。然而，在測試的11個細胞表面蛋白中，在9個細胞表面蛋白表達和在CD44和CD90的類似水平的表達中，每一個細胞系具有相對獨特的表達外形。而且，D5(#l)細月包系對于CD31、CD34和HLA-DR是陰性的，并且D5(#2)對CD31、HLA-DR是陰性的，但對CD34是微弱陽性的，而D5(#3)對于CD31、CD34和HLA-DR是陽性的(圖4)。這些結果表明在人類骨髓中存在若干不同類型的干細胞。圖5顯示出在通過本發明的細分級培養方法從骨髓分離的MLSC上沒有^見察到造血干細月包表面蛋白。流式細月包4義分析表明，MLSC對于用于早期造血干纟田月包的HLA-DR和CD34標記蛋白是陰'f生的。HMSC8292(CambrexBioScience,Walkersville，MD,USA)細胞用作對照。這些結果表明分離的MLSC不具有造血干細胞表現型。至于在分離細胞種系上的若干代表性表面蛋白標記物CD31、CD105、CD73和CD34的表達，圖6-9示出了它們的對比結果。圖6示出了在通過本發明細分級培養方法從骨髓分離的MLSC系上觀察到的細月包表面蛋白CD31(PECAM)表達。D4(#1)、D4(#3)、D5(#1)、D5(弁2)和具有FGF的D5(弁2)的CD31的表達通過FACS分析進行才企測。建立的MLSC系D4(弁3)對于CD31是微弱陽性的，而其他MLSC系是陰性的。在生長介質中的FGF增加D5(弁2)的CD31的表達。這些結果表明，D4(弁3)在分化能力和/或細胞功能上具有不同的細胞特性。圖7示出了細胞表面蛋白CD105(SH2)表達的對比結果。建立的MLSC系D5(弁l)表現出中等水平的CD105表達，而其他干細月包系表現出高水平的CD105。圖8示出了細胞表面蛋白CD73(SH3，SH4)表達的對比結果。建立的MLSC系D4(弁3)表現出非常低水平的CD73表達，并且D4(弁3)和D5(弁2)表現出中等水平，而D5(弁l)根本不表達。圖9示出了細胞表面蛋白CD34表達的對比結果。建立的MLSC系D4(#3)、D4(弁3)和D5(弁2)表現出低水平的CD34表達，而D5(#l)沒有表現出CD34表達。以上結果表明，每一個干細胞系在其分化能力和/或細胞功能上具有獨特的細胞特性。實施例6.3-骨髓細胞系的多種系分化為了確定單細胞源骨髓細胞系的分化能力，在各個細胞特異性i秀導介質中，通過團塊培養系統測試成庫欠骨、成骨和成脂肪分化并通過標準細胞培養基測試肝原性分化。所有分離的細胞系能夠分化成成軟骨種系、成骨種系、成脂肪種系、神經原性和肝原性種系(表2)。4個分離的MLSC系表現出不同水平的分化能力。例如，D5(弁2)干細胞系能夠分化成軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、肝細胞和神經細胞，而其他在成軟骨、神經原性或肝原性種系上具有不同水平的分化能力。表2:分離MLSC系的分化能力的總結<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(N-陰性，L-低，I-中，H-高)實施例6.4-骨髓細胞系的成軟骨分化處于第3代或第4代的4個單細胞源骨髓細胞系在成軟骨分化介質(6.25|ag/ml月夷島素、轉!失蛋白、6.25ng/ml石西酉吏、1.25mg/mlBSA、5.35(ig/ml亞油酸、TGF-卩l10ng/ml、和TGF-(3310ng/ml)中進行團塊培養。成軟骨分化在處理后14~21天實現。通過免疫組織化學染色的陽性甲苯胺藍組織化學染色和富II型骨膠原胞外基質是明顯的(圖10)。相反在標準培養基中培養的細胞系表現出陰性染色。實施例6.5_骨髓細胞系的成骨分化處于第3代或第4代的4個單細胞源骨髓細胞系在成骨分化介質(50(ag/ml抗壞血酸2-石粦酸酯，ICT8M地塞米^N和10mM(3-甘油磷酸酯)中進行團塊培養。成骨分化在處理后14-21天實現。在成骨分化介質中生長的細胞中的陽性馮'科薩染劑染色是明顯的，而在標準培養基中生長的對照細胞是不明顯的(圖11)。實施例6.6_骨髓細胞系的成脂肪分化處于第3代或第4代的4個單細胞源骨髓細胞系在成骨分化介質(50|ig/ml抗壞血酸2-石岸酸酯，l(T7M地塞米+>,和50pg/ml茚曱新)中進行團塊培養。成脂肪分化在處理后14~21天實現。在成脂肪分化介質中的陽性紅油-O染色是明顯的，而在標準培養基中生長的對照細胞沒有檢測到染色(圖12)。實施例6.7-骨髓細胞系的神經原性分化處于第3代或第4代的4個單細胞源骨髓細胞系在神經原性分化介質(1mM聯丁酰基細胞周期蛋白AMP,0.5mM異丁基假黃。票口令，20ng/ml人類表皮生長因子，40ng/ml石威性成纖維細胞生長因子-8,10ng/ml成纖維細胞生長因子-8、10ng/ml腦源神經營養因子)中進4亍團塊培養。神經原性分化在處理后14~21天實現。在神經原性分化的細胞中的陽性GAFP、NeuN和巢蛋白染色是明顯的，而在標準i咅養基中生長的對照細胞沒有4全測到染色(圖13)。此夕卜，圖14示出了用FGF生長的分離MLSC的神經原性分化。用GFAP、巢蛋白、和NeuN抗體的免疫組織學染色表明，在神經原性誘、導后7天和14天進行一企測，用FGF生長的神經原性分化的MLSC對于該染色是高度陽性的。在具有FGF的神經原性誘導介質中生長的MLSC也可分別合成神經月交質細胞特異性蛋白(GFAP)早期和晚期神經細胞標記蛋白、巢蛋白和NeuN,并且可分化成神經細胞。這表明用FGF培養分離的細胞不改變神經原性分化能力。實施例6.8-骨髓細胞系的肝原性分化處于第3代或第4代的4個單細胞源骨髓細胞系在肝原性分化介質中進行培養，該分化介質含有20mg/ml干細胞生長因子(R&D)、10ng/ml制瘤素-M(R&D)、10ng/ml表皮生長因子(Sigma)、20ng/ml成纖維細月包生長因子-4(R&D)、10ng/ml石咸性成纖維細月包生長(Sigma)、50mg/mlITS+予貞混物(BeconDickinson;6.25jig/ml胰島素，6.25|ig/ml轉鐵蛋白，6.25ng/ml硒酸，1.25mg/mlBSA,5.35mg/ml亞油酸))、1.0抗壞血酸2-石粦酸酉旨(Sigma)、10-8M地塞米松(Sigma)。每3天更換介質(圖15)。實施例6.9-骨髓細胞系的軟骨、骨、月旨肪、神經元和干細胞特異性基因表達為了^f全測分化的單細胞源骨髓細胞系中的軟骨、骨、脂肪、神經元和干細胞特異性基因的表達，利用第4代或第5代細胞來實施RT-PCR分析。軟骨(II型骨膠原)、骨(骨橋蛋白)、脂肪(PPARy2)、神經元(NF-M)和干細胞(aFP)的種系特異性基因表達在分化的細胞中進行檢測(圖16)。相反，這些基因在未分化的對照細胞中不表達。GAPDH的表達用作內部對照。這些結果有力地表明，分離的MLSC可表達在各個特異性分化條件中的細胞特異性基因，并且可分化成多種系。實施例6.10-骨髓細胞系的細胞因子的表達圖17示出了分離MLSC系的細胞因子分泌。利用QuantikineHumanTGF-卩1、b-NGF、LIF、ILIO、HGF、IL2、TGF-a和IL12對MLSC培養物上清液的等分試樣(50~100pl)通過ELISA進行分析。TGF-卩1、LIF、TGF-a和ILIO表現出高水平的分泌，而其他表現出低的或沒有分泌。通過分離MLSC的高水平TGF-卩1分泌表明，這些干細胞可在抑制T細胞活化中起作用。而且，相對高水平的其他細胞因子如LIF、TGF-a和ILIO表明這些細胞可以具有免疫調節活性。本文述及的所有參考文獻通過引用將其全部內容結合于此作為參考。二8Ku寸f」06〖i661poolo...<Jmu3&MouAqpoip!.IS,s二一;9661syl!ss。sff.MOI.nsJisoq§iqOio5fs一一voJinsjduqiscjoUO一3SI:一J^OS140p一sUOJ貧Joq1一Bp3rL^S,SJPH*Hsasslw^pasp一-a,t二^60r，s一H)0e，一H口oJ).xdil一Ksni:一一jqjspou歸嘗一需XL一ilu一fht;」l一suy-{>Ifz"si-f》二o()z！!。sP3VAK〔一一一v,二l-duss一-ml、〈-puclsu〖jol一！5ndsk一nsuts一poJ2一5si一〕1np一Jslod一"一mujoL一一r、jJ。p歸LG-J5。一In！一5A一MS(>>1.w^i卜9EU人9i6f1香U3二dx丄-S亂JO〕一p一odo55tjiipJptuJ一puu"06CIIS「9二9961ASGloqdjo〖AJ1Rluolu!，Gdx3pn一3019〈qlun』cll"aHlof，s一一ooK寸，L1:寸K一6-6618gps-iq一BL5冗一2uxlpgstudflsos>jJ3nocl-當一JefJs>lgasv《5gwJ&IHflfplssao一ll3屮lddB一^3〖UJP:s〖pollslsJgsxq015ss.sf^t&3s一JJ、OJegpasA。ym一uv,ssnsxsp〖mjdsx一2tulql2一1joU0=ES1SSS>I〖s>}u5palaPS-1§!-!GMs/S城群每I.SSIS0890S〗4*vmVassdaerP,FallaN,SnoeckH4al,Cha腦cterizatbnandpurificationofosteogeniccellsfrommurinebo加marrowbytwo-colorcellsortingusing關ti-Sca4monoclonalantibodyandwheatgorm鄉hitiniruBood1994;84:753~763.15*SimmonsPJ,Torok-StortB，Wentificationofstromaledlprecursorsinhumanbonemarrowbyanovelmonoclonalamibody，STRO-l，Blood1991;78:55-62.16.LongMW、Rubin鄉JA，Ash咖fiEAeta〗，R，laUonofhumanbowi"arrow曙derivedosteoprogenitorcellsbyosteogenicgrowthfactors'JCHnnvest簡;95:,—887，17.Wa!krEK，01、veusJ，Lund陽Joh加senFetal-The"commonstemcclJ"h》[X)thesisreevaluated:humanfetalbonemarmwcontainsseparatepopulationsoflie，"at鄰(,ieticand軀"nalprogenitors,Blootll附；fE5:24'2'-2435.18.JoyncrCJ，BennettA，TriffittJT，Identificationandenrichmentofhuman《""c甲.ogc'uiiorcdbl)yusingdiflbrtmti:iUonstuge-spojilieruAbs.lhmuH所；21:1-6，19.Reyes\.1，LundT，LenvikTal.PurificationandexvivoexpansionofposlriaudhumanmtirruwniL'sodernaiprogeniUM'L'ens,B〗otxl2001;98:2615'262:5,2t),CkirkBR，Keating:A.Biologyofbonemarr(,wsiroma,AnnNYAeadSci1的5:77():70-7S,21,Phinnu〉,'L)(—i，Kopen.G，hiuicsun壯etal.Plastk'adherentsiromaleeHst'r鍾thebonemarrowofcommonl'vusedstrainsofinbredmice:variationsinyield，g'owlh,and(m-rerm"aLkm.JCdl脇el化m1卿;72:57()'掘，22,CohefDC,ClassR，DiGirolamuCJVIetal'Rapidexpansionofrecyclingstemcellsinculturesuf、，kisUddheraUcellsfromhuu纖bonemaraw.l.'roc.N欲tlAcadSciUSA2,;97:3213—32l乂21ProckopDJ、SekiyaI,andColterDC,lsotetionandch線r"oieriMtionofrapidSyst;〗l'-f加e、vmgs咖edbfron]culturesofhuman隱trowstromalcells.Cytotherapy2,;3(5):393"396.24.HungSC，ChenNJ,HihSLelal,kolalkmandcha隊ierizaUonofsize-sievedstemcellsfromhumanbonemanrow.S化mCells2002;20:249-258,23,SdwarzEJ，Alex肌cto'(、'M，Pr《)ekopUJal,Multijx麵tol歸rrt)ws咖滅lcellstr咖dut;ecltproduceL-DOPA:engmftraentinamimodelofParEdn咖di織s"HumG瘡Tl化rl柳;H):25,—5教26,Seh、var力EJ,RegerRL，AlexanderGMal,,咖irowstromalcdlsrapidlyIransducedwithasd〖二inactiv緣tingrdravirussynt'h€、si"L-DOPAv/化仏GeneTher2亂;S:l2i4-1223.27.KocON,GersonSL,CooperBWaLR錢pWhematopotatkrwoveiyaftercoinfusionofautoIogousWoodlstemcellsandculture《xpandedmarrowmesenchymalstemcdteinadvancedbreastcuncerpatientsreceivinghigW維chemothorapy.JClinOncol2000;18:307-316.28.HorwitzEM,ProckopDJ,F"zpatrickLAetal,Transplantabil.ifyandtlierapeul'iceffectsofbo加marrow-derivedmesenchymalcdisinchildren'withosteogenesisii，rt't'cta.Natfvkd19外;5:則-313.29.Honv'itz.EM,f'rockop1>J,GordonPLetal.ClinicalresponsestotonemarrowlrtinsplarU加i()ninchildrenwhh.severeosteogenesisimperfecta.Blood2QOI;97:1227—123L本領域的技術人員僅利用常規實驗將認知或者能夠理解本文中具體描述的本發明特定實施方式的許多等同替換。這樣的等同替換也涵蓋在本發明權利要求的范圍內。權利要求1.一種處理細胞的生物學樣品的方法，包括(i)使所述細胞的樣品沉積在一個容器中；(ii)將上清液從所述容器轉移到另一個容器中；以及(iii)從所述上清液中分離細胞，其在所述樣品中具有相對較低的密度。2.才艮據4又利要求1所述的方法，介質混合。3.根據權利要求1所述的方法,至少三次。4.根據權利要求1所述的方法，所述分離細胞進行擴展。5.根據權利要求1所述的方法,6.根據權利要求1所述的方法,劑。7.根據權利要求6所述的方法,帶電荷氨基酸的聚合物。其中，將所述細胞的樣品與生長其中，實施所述步驟(i)和(ii)其中，將v^人所述上清液分離出的其中，所述容器具有平底。其中，所述容器涂覆有細胞粘附其中，所述細胞粘附劑包括任何8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述細胞粘附劑是骨膠原、多熔素、聚精氨酸、聚天冬氨酸酯(鹽)、聚谷氨酸酯(鹽)、或者它們的組合。9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述細胞的樣品從骨髓、外周血、臍帶血、脂肪組織樣品、或細胞因子活化的外周血獲得。10.根據權利要求1所述的方法,單個集落,皮分離。11.根據權利要求1所述的方法,進行任何離心之前獲得。12.根據權利要求1所述的方法,進行任何離心之后獲得。13.根據權利要求1所述的方法,其中，多種系干細月包或3且細月包的其中，所述細胞的生物學樣品在其中，所述細胞的生物學樣品在其不包括離心所述細胞的樣品。14.根據權利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中的所述分離細胞與結締組織細胞轉化/分化介質相接觸，從而形成中胚層種系細月包。15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述中胚層種系細胞是結締纟且織細月包。16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述結締組織細胞是軟骨細胞，而所述轉化/分化介質是軟骨細胞轉化/分化介質。17.根據權利要求15所述的方法，其中，所述結締組織細胞是脂肪細胞，而所述轉化/分化介質是脂肪細胞轉化/分化介質。18.根據權利要求15所述的方法，其中，所述結締組織細胞是骨19.根據權利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中所述分離的細胞與外胚層組織細胞轉化/分化介質相接觸，從而形成外胚層種系細月包。20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述外胚層種系細胞是神經組織細胞，而所述轉化/分化介質是神經組織轉化/分化介質。21.根據權利要求1所述的方法，包括使步驟(iii)中所述分離的細胞與內胚層組織細胞轉化/分化介質相接觸，從而形成內胚層種系細月包。22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述內胚層種系細胞是肝原性組織細胞，而所述轉化/分化介質是肝原性組織纟田月包轉化/分化介質。全文摘要本申請公開了一種處理細胞的生物學樣品的方法，其中所述細胞包括多種系干細胞、祖細胞、其他髓間質細胞，該方法包括使細胞樣品沉積在容器中；將上清液從該容器轉移到另一個容器；以及從該上清液分離細胞，其在所述樣品中具有相對較低的密度。文檔編號C12N5/00GK101198691SQ200680021325公開日2008年6月11日申請日期2006年6月19日優先權日2005年6月17日發明者宋淳旭申請人:宋淳旭