蛋白純化方法

專利名稱：蛋白純化方法
技術領域：
本發明涉及組合化學、蛋白質化學和生物化學領域。具體 地，本發明描述了用在蛋白純化領域的方法和試劑盒。
背景技術：
對于生物技術行業來說，大規模和經濟地純化蛋白日益成為 重要問題。通常，蛋白是通過細胞培養產生，采用通過插入含有蛋白編 碼基因的重組質粒而工程化為生產目的蛋白的哺乳動物或細菌細胞 系。由于所使用的細胞系為活的生物體，它們必須用復雜的生長培養基 喂養，其中含有糖、氨基酸、蛋白和生長因子，其通常由動物血清制劑 來提供。在表達靶蛋白的同時也會表達很多其它的蛋白。將所需的蛋白 與提供給細胞的化合物混合物以及細胞自身副產物分離，達到足以用作 人治療劑的純度水平，提供了難以應對的挑戰。從細胞殘骸分離蛋白的方法主要取決于蛋白的表達位置。可 使一些蛋白直接從細胞分泌至周圍的生長培養基中；其它的則在細胞內 制造。對于后者，純化方法的第一步涉及裂解細胞，這可通過多種方法 來實現，包括機械剪切、滲透壓休克或酶學處理。這種破碎將細胞的整 個蛋白內容物釋放進勻漿液，甚至進一步增加了分離靶蛋白的難度。由 于細胞培養過程中細胞的自然死亡，對于直接釋放的蛋白，盡管其規模 較小，但是相同的問題也會出現。 —旦獲得了含有目的蛋白的澄清溶液，其與細胞產生的其它 蛋白的分離通常是企圖采用不同層析技術的聯合或相繼應用。這些技術 基于蛋白的電荷、疏水性程度、大小、或親和性來分離蛋白的復雜混合 物。對于這些技術中的每一種來說，可使用幾種不同的層析樹脂，使得 能為所涉及的特定蛋白精確制定純化方案。這些分離方法每一種的本質
5在于可以使得蛋白以不同的速率沿長柱向下移動，當它們進一步向下穿 過柱時獲得了增加的物理分離，或者有選擇的吸附在分離柱上而被不同 的溶劑差異洗脫。在一些情況下，當雜質特異地粘附于柱而目的蛋白不 粘附于柱，即目的蛋白存在于"流出液"時，所需的蛋白與雜質分離。 但是，通常經純化的含有目的蛋白的蛋白溶液也含有多種污染蛋白和其 它的不希望的雜質-盡管比用于純化的起始材料中含量低。目前克服這個
問題的努力通常涉及到所謂的精制步驟(polishing step)。這個步驟常常包 括凝膠過濾(例如當污染蛋白具有不同于靶蛋白的分子量時)、免疫親和 層析或離子交換層析。當存在于樣品中的所有污染蛋白都是已知的并且可獲得針 對這些污染蛋白的抗體時，免疫親和層析是最有用的。通常，隨后將抗 體固定至固體支持物并用作免疫吸附劑。但是，這種方法有很大的缺 點。很多情況下，污染蛋白是未知的，這種抗體方法不可行。此外，免 疫親和柱昂貴并且很少能完全特異于它們的靶。陰離子交換層析為一般方法，經常用于去除內毒素和外源 DNA, 二者都為相對酸性的分子。這種方法也結合其它的酸性分子，例 如某些蛋白。但是，這種方法對于除去性質類似于目的靶蛋白(例如相同 的凈電荷)的污染蛋白是無效的。因此，很經常地，性質未知的污染蛋白是非常不易除去的。 對于治療性蛋白溶液而言，甚至痕量的污染蛋白也可能對向其給予了該 治療性蛋白的患者具有災難性影響。這種作用包括嚴重的過敏或免疫反 應。通常這些作用由來自真核或原核細胞的污染蛋白所造成，這些細胞 被用于重組表達治療性蛋白。這些污染蛋白被稱為HCP(宿主細胞蛋白， Host Cell Proteins)。就定義而言，HCP是多種多樣的，采用現有技術的 方法不能在單一過程中去除。因此，對它們的去除依賴于一系列的步 驟，這也導致目的治療性蛋白總產率的降低。因此，相對于現有技術的 方法而言，所有的污染蛋白或雜質能在單一純化步驟中至少部分地，優 選完全地被去除的方法是優選的。
發明概述本發明的目的是從已經高度純化的樣品中除去盡可能多的 雜質。某些類型的結合部分庫優選用于實現這個目的。具體地，可通過使用大量不同結合部分的庫來最佳地實現這個目的，其中未就結合樣品 中特定分析物的能力對所述不同結合部分進行預選。這些庫在本文中被 稱為"非選擇性"庫。(這種庫中的一些結合部分的結合特異性可能在使 用該庫后變得明顯，但這一事實并不賦予該庫"選擇性"。)使用這類庫 增加了不加區分地捕獲整個群體中各種類的可能性。因此，例如每種抗
體針對已知結合配偶體的抗體庫將僅選擇每種抗體所針對的種類；與此 相反，相同規模的種系抗體庫不含有結合預選分析物的抗體。這種庫更 可能選擇未知存在于樣品中的種類。可通過采用組合化學或通過隨機組 裝化學部分來產生非選擇性庫。此外，通過增加庫的大小，無論是選擇 性庫還是非選擇性庫，人們可以增加在樣品中捕獲和檢測的不同分析物 種類(spedes)的數目。結合部分的非選擇性庫的實例包括種系抗體庫、 重組結合蛋白的噬菌體展示庫、染料庫、基于肽的組合庫、寡核苷酸、 寡糖以及成員的結合特異性未經預選的非組合庫、不同種類的組合庫及 其部分。也應注意到純化量取決于結合部分和樣品中污染物的相對量。 結合部分與污染物的相對量應足夠大，以至于結合部分能夠結合樣品中 大部分(即使不是全部)的污染物，但是不大到使大部分的靶蛋白也被結 合至結合部分。本發明的目的是提供純化目的蛋白的方法。在本發明的一個 實施方案中，提供了純化靶蛋白群(target protein group)的方法。這種方 法包括以下步驟(a)使包含至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋白的樣 品與具有至少100種不同結合部分的庫接觸，其中所述結合部分的量足 以結合污染蛋白和少量的(a minority of)耙蛋白群；(b)使污染蛋白和少量 的靶蛋白群與結合部分庫(library of binding moieties)結合；(c)使未結合 的靶蛋白群與結合至結合部分庫的污染蛋白和靶蛋白群分離；以及(d) 從所述樣品收集未結合的靶蛋白群。所收集的把蛋白群比樣品中的靶蛋 白群更純。在優選的實施方案中，結合部分庫的量足以結合大部分的污 染蛋白。在本發明優選的實施方案中，樣品包含至少98%靶蛋白群和 至多2%污染蛋白。在另一優選的實施方案中，樣品包括發酵液。在本發明優選的實施方案中，靶蛋白群由單一蛋白種類組成。
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在本發明優選的實施方案中，靶蛋白包括天然產生的蛋白。 在本發明另一實施方案中，靶蛋白群包括重組蛋白。在優選的實施方案 中，重組蛋白選自酶、激素、生長因子、受體、疫苗、免疫球蛋白和任 何前述蛋白的片段。在本發明另一優選的實施方案中，重組蛋白選自血 管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長 因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長 因子(IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、骨形態發生蛋白(BMP)、骨衍生的 神經營養因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神經生長因子(NGF)、人生 長激素(hGH)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素、組織型纖維蛋白溶酶原激 活劑(t-PA)、干擾素、白介素(IL)和赫賽汀。在本發明另外的實施方案中，所述庫包括至少1,000、至少 10,000、至少100,000、至少1,000,000、至少IO,OOO,OOO或至少100,000,000
種不同的結合部分。在本發明優選的實施方案中，所述庫為選自種系抗體庫、重
組多肽的噬菌體展示庫、染料庫、非組合庫、組合庫及任何前述庫的部 分的非選擇性庫。優選的庫包括組合庫的至少一部分。還優選的組合庫 包括選自多肽、多核苷酸、脂類、寡糖和小有機分子的結合部分。在另 一實施方案中，組合庫為六肽組合庫。優選的結合部分包括生物有機聚合物。結合部分選自染料、 多肽、抗體、核酸、適體(aptamers)和小有機分子。結合部分可結合至一個或多個固體支持物。優選的支持物或 多種支持物為小珠或顆粒的集合。所述一個或多個固體支持物可選自離 散顆粒(球形或不規則的)、小珠(beads)、纖維、濾器、膜和塊狀物 (monolith)。每種結合部分可被連接至不同的固體支持物。在另一優選的 實施方案中，多種不同的結合部分被連接至單一的固體支持物。在另一實施方案中，本發明的方法在步驟(a)之前還包括培養 產生靶蛋白群的細胞的步驟。所述細胞可為真核或原核細胞。靶蛋白群 可從多種樣品中純化。在本發明的一個實施方案中，樣品為細胞上清 液。在另一實施方案中，樣品為細胞提取物。在本發明的一個實施方案中，所述方法在步驟(a)之前還包括 步驟(i)使包含少于95%靶蛋白群和多于5%污染蛋白的在先樣品經歷至少一個純化步驟；以及(ii)收集包含至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋 白的樣品。在本發明的一個實施方案中，所述方法還包括步驟(e)通過使 所收集的靶蛋白群與藥物可接受的載體混合來制備藥物組合物。根據本發明的方法，可以多種方式來完成樣品與結合部分庫 的接觸。在優選的實施方案中，這個步驟在懸浮分批工藝中完成。在本 發明另 一優選的實施方案中，通過使所述樣品穿過裝填有連接至固體支 持物的所述結合部分庫的柱來完成樣品與結合部分庫的接觸。在另 一優 選的實施方案中，使樣品與結合部分庫接觸包括流化床工藝。本發明的另一目的是提供藥物組合物，其包含根據本發明的 方法制備的靶蛋白群；以及藥物可接受的載體。在優選的實施方案中， 靶蛋白群選自酶、激素、生長因子、受體、疫苗、免疫球蛋白和任何前 述蛋白的片段。在本發明另一優選的實施方案中，靶蛋白群選自血管內 皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子 (IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、骨形態發生蛋白(BMP)、骨衍生的神經 營養因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神經生長因子(NGF)、人生長激 素(hGH)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑 (t-PA)、干擾素、白介素(IL)和赫賽汀。本發明還提供了用于純化靶蛋白群的試劑盒。在優選的實施 方案中，該試劑盒包括(i)具有至少100種不同結合部分的結合部分庫； 以及(ii)通過使包含至少95%所述耙蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與 所述結合部分庫接觸來純化靶蛋白群的使用說明。本發明的試劑盒還包 括多個容納用于使樣品與結合部分庫接觸的孵育緩沖液的容器或分級 分離柱。本發明的其它試劑盒實施方案包括任選的功能性組分，其使 得本領域普通技術人員能進行本文描述的任何方法變體。
定義除非另有定義，本文使用的所有科技術語都具有本發明所屬 領域技術人員通常理解的含義。以下的參考文獻就本發明中使用的很多 術語為才支術人員才是供了 一 4殳定義Singleton ef ， D/c"o"(2廠少o/A^croZ /o/ogyA/o/ecw/w Sz'o/ogy(2nd ed. 1994); 7Tze C"m6hdge Z)/c"'ow" o/iS"c/.ewce朋J rec/wo/ogy(Walker ed., 1988); T7 e G7c^a^y Gew"/oy, 5th Ed., R. Rieger a/.(eds.), Springer Verlag(1991); 以及 Hale & Marham， Z7ze //a/77er Co〃z.ra D/c"'o腦7 Wo/ogy(1991)。 當用在 本文時，以下的術語具有歸于其自身的含義，除非另有說明。"結合部分(bindingmoiety)"指結合分析物的化學部分。"結合部分庫"指不同結合部分的集合。"抗體庫，，指成組的抗體，即能夠結合抗原上特定表位并且 在結構上被定義為包含特定氨基酸序列的分子，其中該特定氨基酸序列 被技術人員認定為衍生自免疫球蛋白編碼基因的框架區。就結構而言， 最簡單的天然產生的抗體(例如IgG)包含4個多肽鏈，兩個拷貝的重(H) 鏈和兩個拷貝的輕(L)鏈，都通過二硫鍵共價連接。結合的特異性存在于 H和L鏈的可變(V)決定區。抗體的主要結構區為恒定區(C)。術語"抗 體"包括完整抗體，該抗體的功能性片段、修飾物或衍生物。其也可為 經遺傳處理的產物，或雙特異性抗體或嵌合抗體，如人源化抗體。抗體 可以以多種形式存在，例如包括Fv(由抗體單臂的Vl和VH結構域組 成)、Fd(由Vh和Cm結構域組成)、dAB片段(由VH結構域組成；Ward W "/., Nature, 341: 544-546， 1989)、分離的互補決定區(CDR)、 Fab(由 VL， VH, CL，和CH1結構域組成)以及F(ab)2(包含在鉸鏈區通過二硫鍵 橋連接的兩個Fab片段的二價片段)，以及為單鏈形式。也可以使用單鏈 抗體(SCA),其中編碼重鏈和輕鏈的基因被組合進單一編碼序列。 一些 SCA為經遺傳改造的分子，包含通過適合的多肽接頭連接的輕鏈可變 區，重鏈可變區。"在先樣品"指包含少于95%目的靶蛋白群的蛋白部分或混 合物。優選的在先樣品包括但不限于例如發酵液、細胞上清液、細胞提 取物、動物提取物和纟直物纟是取物。用在本文中時，術語"蛋白"、"多肽，，和"肽"指氨基酸 殘基的聚合物。這些術語也指這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨 基酸殘基為相應的天然產生的氨基酸的人工化學模擬物，還指天然產生 的氨基酸聚合物，含有修飾的殘基的氨基酸聚合物以及非天然產生的氨 基酸聚合物。本發明的肽和蛋白包括具有各氨基酸殘基D和L亞型以及 其它氨基酸變體的氨基酸聚合物。通過組成分子一級結構的氨基酸殘基
10數量區別肽。出于本發明的目的，通常肽為包含至多50氨基酸殘基的 那些分子，而蛋白包含多于50氨基酸殘基。從包含耙蛋白群和一種或多種污染蛋白或雜質的樣品中"純 化"靶蛋白群指通過部分或完全地去除至少一種或多種污染蛋白或雜質 而增加靶蛋白群的純度。"重組蛋白"指在宿主細胞中產生的蛋白，該宿主細胞經該 蛋白編碼核酸轉化或轉染或由于同源重組而產生該蛋白。"樣品"指任何組合物，優選水溶液，其包含目的耙蛋白群 和污染蛋白，并且處于這樣的物理狀態，其使得存在于該樣品中的任何 目的靶蛋白群和污染蛋白能夠與結合部分庫接觸。樣品可以為任何來 源，其包含至少95%的靶蛋白群和至多5%的污染蛋白。"固體支持物"指任何不溶材料，包括顆粒(例如小珠)、纖 維、塊狀物、膜、濾器、塑料條等等。已公認蛋白能夠以幾種能夠共純化的(co-purified)形式存在 于樣品中。"靶蛋白群"指待純化的單一蛋白或相關蛋白的群組。這些 相關形式可起因于翻譯前和翻譯后修飾之一或二者。翻譯前修飾形式包 括等位變體、剪接變體和RNA編輯形式。翻譯后修飾形式包括由蛋白 水解切割(例如，母體蛋白的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、曱 基化、胱氨酸化、磺化和乙酰化導致的形式。包括特定蛋白和其所有修 飾的形式的蛋白集合在本文中被稱為"靶蛋白群"。因此，例如存在于 血清中的白蛋白和修飾形式的白蛋白為靶蛋白群。另外，蛋白可表達為 多聚體蛋白，例如二聚體蛋白。其實例為免疫球蛋白和胰島素。術語"靶 蛋白群"也包括這種。
附圖簡要說明

圖1顯示采用組合肽庫和本發明的方法純化革巴群蛋白(肌紅 蛋白，以血清蛋白污染)。SDS-PAGE顯示了以下的蛋白級分道"a，， 以血清蛋白污染的肌紅蛋白；道"b，，在流出物中收集的經精制的肌 紅蛋白；道"c":污染蛋白，包括少量的結合至組合肽庫的肌紅蛋白。圖2顯示采用組合肽庫和本發明的方法純化用5%大腸桿菌 (&c/zenc/z^ co")水才是取物污染的月幾紅蛋白。A.顯示MALDI質譜圖。 "a":以co"提取物污染的肌紅蛋白；"b，，在流出物中收集的經精制的肌紅蛋白。單箭頭指向肌紅蛋白，雙箭頭指向雙倍大小的帶電荷
的肌紅蛋白。B.顯示SDS-PAGE分析。SDS-PAGE顯示以下的蛋白級分 道"a":以co"提取物污染的肌紅蛋白；道"b":從流出物中收集 的經精制的肌紅蛋白；道"c" : Eco/Z污染蛋白，包括少量的結合至組 合肽庫的肌紅蛋白；道"d":五.co/z標準提取物。圖3顯示精制(除去污染物)在巴斯德畢氏酵母(尸/c/n'a / aWon'力中表達的重組人白蛋白。通過在含有lmL組合肽的柱上前沿分
析最初的提取物(96%純度白蛋白)來完成雜質分離。收集級分，每種通 過SDS-PAGE進行分析。如圖所示，包括級分3的最初級分含有"精制，， 的重組白蛋白，而最后的級分逐漸含有越來越多的污染物，這是由于組 合小珠被逐漸飽和。通過箭頭指出蛋白雜質洗脫的開始和包含蛋白雜質 的峰組分。
發明詳細說明本發明提供了方法和試劑盒，其使得本領域普通技術人員能 夠從包含靶蛋白群和未知污染蛋白的樣品中純化由不超過5種不同蛋 白，優選單種蛋白組成的靶蛋白群。本發明還提供了藥物組合物，其包 含根據本發明方法制備的靶蛋白群。本發明還提供了試劑盒，其包含使 得本領域普通技術人員能夠實施本文描述的任何方法的組分。
I.純化靶蛋白群本發明方法的 一般原理是基于這樣的假設，即結合部分庫如 組合庫包含各種結合部分，它們合起來能結合大批的分析物，尤其是樣 品中大批的蛋白污染物。在本發明優選的實施方案中，結合部分庫如組合庫內各結合 部分的數目足夠大，以至于推定存在于樣品中的每種蛋白對各結合部分 中的至少一種具有親和力。通常，結合部分被附著在固體支持物上，例 如小珠。當包含進行純化的目的靶蛋白群和多種污染蛋白的樣品與這種 組合庫接觸時，各結合部分結合到蛋白結合配偶體(partner),包括靶蛋 白群和污染蛋白。組合庫的巨大多樣性提供了特異于樣品中每種蛋白， 即目的靶蛋白群和污染蛋白，的結合部分。但是，由于用于單一蛋白種 類的小珠的容量有限，將有極少量的靶蛋白群被結合并隨后從樣品中去除。理論上，如果結合到加入樣品中的小珠的各種組合庫的量被很好地 計算，則幾乎所有的污染蛋白應被去除，同時目的耙蛋白群的很少部分 被去除。未結合的靶蛋白群將保持在上清中，可通過過濾、離心或其它 手段與結合到結合部分庫的蛋白分離。分離后，收集耙蛋白群。該收集 的靶蛋白群比樣品中的靶蛋白群更純。盡管從包含目的耙蛋白群和污染蛋白的樣品純化靶蛋白群 是有利的，但是技術人員也應理解，本發明的方法也可被實施以從包含 靶蛋白群和非多肽污染物或雜質的樣品純化目的靶蛋白群。
A.靶蛋白群和污染蛋白本發明的方法和試劑盒尤其可用于從包含靶蛋白群和污染 蛋白的樣品純化靶蛋白群。在本發明優選的實施方案中，靶蛋白由單種蛋白組成。
1.靶蛋白群在本發明的一個實施方案中，被純化的靶蛋白群包括重組蛋 白。在本發明優選的實施方案中，該重組蛋白選自酶、激素、生長因子、 受體、疫苗、免疫球蛋白和任何上述蛋白的片段。
白，其缺失或機能失調與疾病或感染狀態，諸如一癌癥:病毒感染、寄生 蟲感染、細菌感染等相關。尤其關注的還有細胞應激標志物。表明動物 或人處于應激狀態的耙蛋白群為多種疾病狀態的早期指示物，包括某些 精神病、心肌梗塞和感染。在本發明的另 一 實施方案中，靶蛋白群包括治療性蛋白。"治 療性蛋白"是任何這樣的蛋白，其被給予患有疾病的患者以引發應答， 該應答至少部分地阻止或延緩該疾病的癥狀或并發癥。通常，治療性蛋 白通過重組制備，即其為重組蛋白。在本發明另一優選的實施方案中，該重組蛋白選自血管內皮 生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子 (IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、骨形態發生蛋白(BMP)、骨衍生的神經 營養因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神經生長因子(NGF)、人生長激素(hGH)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑 (t-PA)、干擾素、白介素(IL)和赫賽汀(herceptin)。治療性蛋白可以為抗體，例如IgA， IgD， IgE, IgG或IgM。 該抗體可以為單克隆或多克隆的。本發明的方法適合鼠、嵌合和人源化 抗體的純化。本發明的方法適合于純化多種靶蛋白群，包括但不限于，例 如，(i)凝血因子，例如抗纖維蛋白酶III、凝血因子VIIa、凝血因子VIII 和凝血因子IX; (ii)抗凝劑，例如組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、鏈激 酶和尿激酶；(iii)罕見先天性疾病的酶，例如卩葡萄糖腦普脂酶、a-D-半乳糖苷酶、a-半乳糖苷酶A、 aL-艾杜糖苷酸酶、a-l,4-糖苷酶、芳香 基碌u酸酯酶B、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、腺苷脫氨酶、人脫氧核糖核酸酶 I(hDNase-I)以及人活化蛋白；(iv)胰島素和遺傳修飾的胰島素；(v)生殖 激素，如人卵泡刺激素、絨毛膜促性腺激素和促黃體激素；(vi)其它激 素，如人生長激素(Somatotropin)、人骨形態發生蛋白2、奈西立肽 (nesintide)和曱狀旁腺激素;(vii)生長因子,例如促紅細胞生成素(包括 促紅細胞生成素oi、促紅細胞生成素卩、Darbepoetin a)、角質化細胞生 長因子、角質化細胞生長因子-2、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞 -巨噬細胞集落刺激因子(Gm-CSF); (iix)千擾素，例如a干擾素(包括聚 乙二醇化的a干擾素和利巴韋林、聚乙二醇化的干擾素a-2a和 copegus)、卩干擾素(例如干擾素卩-la、干擾素卩-lb)以及y干擾素；(ix) 白介素，例如IL-1拮抗劑、IL-2、白介素-10、白介素-11和白介素-12; (x)輩巴向白細胞受體的單克隆抗體，例如a4整合素拮抗劑、抗胸腺細胞 球蛋白、CD2拮抗劑、CD3拮抗劑、CD4拮抗劑、CDlla拮抗劑(例如 依法利珠單抗(efalizumab))、 CD20拮抗劑、(Rituxan, Tiuxetan, Zeevalin, Bexxar)、 CD22拮抗劑、CD33拮抗劑(吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin))、以及CD52拮抗劑(阿侖單抗(alemtuzumab)); (xi)革巴向細 胞因子的單克隆抗體，例如趨化因子拮抗劑、IL-2拮抗劑、IL-4拮抗劑、 IL-5拮抗劑、IL畫6拮抗劑、IL-12拮抗劑、選擇素拮抗劑、TNF-a拮抗劑; (xii)靶向癌細胞上受體的單克隆抗體，例如EGFR拮抗劑、HER-2拮抗 劑(例如赫賽汀)、MUC-1拮抗劑、VEGF拮抗劑；(xiiv)其它抗體，例如 rituximab(人源化的MAb)、補體抗體(例如C5抑制劑)、糖蛋白(GP)IIb/IIIa 拮抗劑、IgE拮抗劑(例如omalizumab)、以及呼吸道合胞體病毒F-蛋白拮抗劑、英夫利昔單抗(嵌合MAb)、阿達木單抗(Adalimumab)、以及依 那西普(etanercept)(抗體-Fc和p75-TNF受體蛋白的融合蛋白)；(xiv)用于 治療非何杰金淋巴瘤的基于蛋白的藥物，例如CD20拮抗劑、CD22拮 抗劑、以及IL-2拮抗劑；(xv)用于治療白血病的基于蛋白的藥物，例如 CD33拮抗劑、CD52拮抗劑和a干擾素；(xvi)用于治療實體腫瘤的基于 蛋白的藥物，例如單克隆抗體曲妥單抗(trastuzumab)(赫賽汀；人源化抗 HER-2 MAb ; 乳腺癌)、西妥昔單抗(cetuximab)、以及貝伐單抗 (bevacizumab)(EGFR 和 VEGR 承卩制劑 )、 pemtumomab 和 oregovomab(MUC-l抑制劑)；(xvii)用于治療貧血的蛋白治療劑，例如促 紅細胞生成素；(xiix)用于治療充血性心力衰竭的蛋白，例如奈西立肽； (xix)用于治療心臟病發作和中風的蛋白，例如阿替普酶、鏈激酶、尿激 酶、GPIIb/IIIa受體抑制劑和補體抑制劑；(xx)用于治療血友病和von Willebrand病的蛋白，例如凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子VII、 以及van Willebrand，s因子；(xxi)用于治療中性粒細胞減少癥的蛋白， 例如G-CSF、 G-CSF-PEG偶聯物和Gm-CSF; (xxii)用于治療血小板減少 癥的蛋白，例如血小板生成素；以及(xxiiv)用于治療肺病(例如嚢性纖維 化、肺氣腫、特發性肺纖維化)、傳染性疾病(例如乙型肝炎(包括乙型肝 炎病毒的包膜蛋白)、丙型肝炎、敗血癥和RSV)、免疫疾病(例如哮喘、 類風濕性關節炎、多發性硬化癥、急性移植排斥、克羅恩病和潰瘍性結 腸炎、牛皮癬(例如alefacept)、牛皮癬性關節炎和SCID)、皮膚和骨病(骨 折、骨質疏松癥和創傷)、以及其它疾病(例如，溶酶體貯存病、不育(例 如促濾泡素a)以及糖尿病)的蛋白，以及以上列出的任何蛋白的片段、 嵌合蛋白或融合蛋白。根據本發明方法可被純化的其它生物學相關靶蛋白群包括 腎素；生長激素釋放因子；曱狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；前胰島素；促卵胞激素；降 釣素；促黃體激素；胰高血糖素；抗凝血因子如蛋白質C;心房利鈉因 子；肺表面活性物質；纖維蛋白溶酶原激活劑，如人尿或組織型纖維蛋 白溶酶原激活劑(t-PA);蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因 子-a和-(3;腦啡肽酶；RANTES;人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-l-alpha); 血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制性物質；松弛素A鏈；杉> 弛素B鏈；前松弛素；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，例如卩內
15酰胺酶；DNase; IgE;細胞毒性T細胞相關抗原(CTLA),例如CTLA-4; 抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子受體；蛋 白A或D;類風濕因子；神經營養因子如骨衍生的神經營養因子 (BDNF)、神經營養因子-3、 -4、 -5、或-6(NT-3， NT-4, NT-5,或NT國6)、 或神經生長因子如NGF-p;血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細胞生 長因子如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉化生長因子(TGF)如 TGF-a和TGF-卩，包括TGF-卩l, TGF-卩2， TGF-卩3， TGF國卩4或TGF+5; 胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II); des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰 島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白如CD3, CD4， CD8, CD19和CD20; 促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP);超 氧化物岐化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原， 例如AIDS被膜的一部分；運輸蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白； 整合素，如CDlla, CDllb， CDllc， CD18， ICAM， VLA畫4和VCAM; 腫瘤相關抗原，如EGFR， HER2, HER3或HER4受體；和任何以上列 出的蛋白的片段、嵌合蛋白或融合蛋白。此外，特定的目的靶蛋白群包括抗體。優選抗體的列表可見 于美國專利申請2003/0036095(Tchaga)，通過參考將其整體并入本文。
2.污染蛋白通常，樣品含有目的靶蛋白群和污染蛋白，污染蛋白不同于 靶蛋白群，人們希望將其從樣品中除去。污染蛋白可以為任意數目的不 同蛋白。但是，在本發明優選的實施方案中，污染蛋白在樣品中的濃度 至多為5%。在本發明另一優選的實施方案中，污染蛋白在樣品中的濃 度為至多2%。由于本發明的方法和試劑盒提供了結合部分庫，因而人們不 需要污染蛋白身份或來源的任何信息。在靶蛋白群在宿主細胞中通過重 組產生的情況下，污染蛋白通常來自產生該靶蛋白群的宿主細胞或來自 用于培養該宿主細胞的細胞培養基。它們可為不同種類，例如胞質溶膠 蛋白、結構蛋白、核蛋白、膜蛋白、酶，尤其是蛋白酶。用于產生重組 靶蛋白群的合適的宿主細胞包括動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、酵母 和原核細胞。也可4吏用無細胞系統。
優選的用于產生重組把蛋白群或耙蛋白群的各種蛋白的真 核宿主細胞包括，但不限于，例如脊推動物細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO) 細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎CV1細胞(例如COS7細胞)、骨髓瘤 細胞、人胚腎細胞(293細胞或用于懸浮培養的293細胞亞克隆)、人宮 頸癌細胞(HELA)、人肺細胞(例如W138)、人肝細胞(例如HepG2)、 3T3 細胞、小鼠Sertoli細胞(例如TM4)、非洲綠猴腎細胞(例如VERO-76)、 犬腎細胞(例如MDCK)、水牛大鼠肝細胞(例如BRL3A)。優選的為CHO 和BHK細胞。因此，存在于來自CHO或BHK細胞的樣品中的污染蛋 白包含CHO細胞蛋白或BHK細胞蛋白。可用于表達重組靶蛋白群或靶蛋白群各蛋白的其它真核宿 主細胞為以重組酵母表達載體轉化的酵母細月包(e.g., S"cc/^tow少cm
/ aston's， iVewos/wra 。才艮才居本發明的方法還適合的純4b為在用重
組病毒表達載體轉染的昆蟲(例如Sp。(io; ^ra/n^gZ/ enia,爿etfes1 aegy/ "， 」et/es "/Zw/ z'"z^， Z)rayo/ /h/a / eAa770g"Wer， 以及Bow6>a wo力)纟田胞中表 達的靶蛋白群。在植物細胞中表達的靶蛋白群也可通過使用本發明的方 法來純化。用于產生耙蛋白群或靶蛋白群各蛋白的優選的原核宿主細 胞包括，4旦不限于，例如E. co/《例如co/z'294， co/zB, co/zX1776 co/z W3110), Enterobacter, Erwinia,克雷白桿菌屬(Klebsiella)，變形 菌屬(Proteus)，沙門氏菌屬(例3口 iSa/wowe〃a (y/ /7/附wrz'wm),沙雷氏菌屬(例
賀氏菌屬，桿菌(例如凡to6"7^ , S. /z'c/2em/orm^),々支單月包菌屬(例^口尸.aen^gz力os1(3),和《連霉菌屬。^f尤選的原 才亥纟田月包為co/i和及sw6"/is。 因jt匕,存在于來自co//或5. sw6〃7/s的 樣品中的污染蛋白包括E. co/z'細胞蛋白或B. sw&z7w細胞蛋白。
B.適合的樣品樣品包含至少95%耙蛋白群和至多5%污染蛋白，其在本文 中也被稱為分析物。在靶蛋白群包括多種不同蛋白的樣品中，存在于樣品中的耙蛋白群的合并總量至少為95%。例如，當三種不同的目的蛋白 (即靶蛋白群)存在于樣品中時，第一種蛋白可以以至少25%存在，第二 種蛋白可以以至少30%存在，并且第三種蛋白可以以至少40%存在。在 本發明另一優選的實施方案中，樣品包含至少98%靶蛋白群和至多2% 污染蛋白。適用于本發明的樣品包括氣體、粉末、液體、懸浮液、乳液、 可滲透的或可粉碎的固體，等等。樣品優選為液體。最優選的樣品為水 溶液。樣品可以直接從來源取得并用在本發明的方法中，無需任何預備 處理。優選的樣品包括但不限于例如細胞懸浮液和細胞提取物。當表達的靶蛋白群被分泌時，其可以從生長培養基或細胞上 清液中純化。因此，在本發明優選的實施方案中，根據本發明的方法從 中分離靶蛋白的樣品為細胞上清液。本發明的方法也可應用于不被分泌的靶蛋白群，即靶蛋白群 一旦在宿主細胞中被表達，其就保留在宿主細胞中，從這里純化。當被 表達的靶蛋白群不從宿主細胞分泌時，優選破碎宿主細胞并讓靶細胞群 被釋放進水提取物中。在本發明另一優選的實施方案中，根據本發明方 法從中純化把蛋白的樣品為細胞提取物。或者，將包含少于95%目的靶蛋白群的在先樣品以下文描述 的各種方式進行處理，以改善其性能并獲得包含至少95%靶蛋白群的樣
卩
口口 o在先樣品可以為取自生物源的生物樣品，包括生物液體，例 如全血和血書f生物、血清、血漿、尿、前列腺液、眼淚、口腔液、唾液、 精液(semen)、精液(seminal fluid)、粘液、糞便、痰、腦脊液、骨髓、淋 巴液、胎兒液、羊水、乳和汗液。在先樣品還包括生物組織樣本、細胞 提取物、發酵液和細胞上清液。生物樣品也可通過擦、刮、手術或通過 皮下針抽取，等等。在各種情況下，收集方法很大程度上取決于生物源 和情形，很多備選的合適收集技術對本領域技術人員來說是公知的。通 常，來自發酵液或來自生物液的靶蛋白可通過常規的分級分離和純化方 法被純化至至少大約95%,這些方法例如為過濾、沉淀、層析或電動方 法。通常， 一旦把蛋白群在宿主細胞中被表達，其就被分泌進細 胞培養基，其可以從這里被純化。因而，在先樣品可為發酵液。通常，
18發酵液包含表達把蛋白群的宿主細胞、細胞碎片和顆粒物。在先樣品可 以為已經經過例如pH調整、離子強度調整、溫度調整、水稀釋和/或一 種或多種固體/液體分離技術(例如絮凝、離心、過濾或微濾)處理的發酵 液。因此，發酵液可以進一步通過除去表達靶蛋白群的宿主細胞、細胞 碎片和顆粒物而澄清。存在于發酵液或澄清發酵液中的靶蛋白群可以在 應用本發明的方法前進一步濃縮。但是，澄清和/或濃縮并非必須步驟。
C.適合的結合部分純化把蛋白群的方法包括使包含至少95%靶蛋白群和至多 5%污染蛋白的樣品與結合部分庫接觸的步驟，其中該結合部分庫具有至 少100種不同的結合部分，其量足以結合污染蛋白和少量的靶蛋白群。用在本發明中的結合部分庫包括至少100種不同的結合部 分。優選地，結合部分庫包括至少與樣品中分析物一樣多的不同結合部 分。因此，理想地，結合部分庫包括至少10, 50, 100, 1,000， 10,000, 100,000， 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 1,000,000,000結合部分。
優選地，每種結合部分識別不同的分析物。結合部分也可以為可溶組合分子。可溶組合分子優選包含接 頭部分。"接頭部分"使得結合部分偶合(coupledto)到包含互補接頭部 分的互補固體支持物。通常使可溶的組合分子與樣品接觸并讓其與目的
體支持物來分'i;到的復合物。或者，組合分子)l與樣品;妄觸之前被
偶合至固體支持物。結合部分庫可以存在并與使用本發明可檢測的分析物相互 作用，該分析物可為任何與形成分子相互作用相容的物理狀態，包括氣 態的、水懸浮液和有機懸浮液以及乳液，最優選為液體狀態。通常并如以下詳細描述的，結合部分庫被偶合至不溶固體支 持物或顆粒材料。每種固體支持物或不溶顆粒優選帶有幾個拷貝的相同 結合部分，每種顆粒類型偶合不同的結合部分。本發明的結合部分庫可以通過本領域技術人員已知的任何 技術來產生。例如，結合部分庫可以化學合成，從天然來源收集，或者 在結合部分庫是生物有機聚合物的情況下，采用重組技術產生。
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結合部分可以在購買時已預先偶合到固體支持物，或者可以 采用標準方法間接附著或直接固定到固體支持物之上(參見，例如 Harlow and Lane,爿w"/ 06to, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1988); Biancala " a/.， Letters in Peptide Science 2000, 7(291): 297; MacBeath ", Science 2000, 289: 1760-1763; Cass""/.， ed., 尸rocee(iz力g^/7ze TTz/Weew/Tz Jmen'caw尸ep"t/e 5ym/ os7'ww; Leiden, Escom, 975-979(1994);美國專利5,576,220; Cook "a/., Tetrahedron Letters 1994， 35: 6777-6780;以及Fodor"a/.， Science 1991， 251(4995): 767-773)。
1.組合庫在本發明的一個實施方案中，結合部分庫為組合庫或其部 分。組合化學庫為通過化學合成或生物合成，通過使多種化學"建筑塊 (building blocks)"以所有可能的組合進行組合而產生的化合物的集合。 例如，對于指定的化合物長度(即多肽化合物中的氨基酸數目)來說，完 全的線性組合化學庫如多肽庫是通過使一套化學建筑塊(氨基酸)以所有 可能的方式組合來形成。舉例而言，如果建筑塊的數目是5，并且構建 體由5個成員組成，則可能的線性組合數目為55或3,125個成員。這種 情況下，建筑塊(A， B, C， D和E)被線性組合，例如A-A-A-A-A; A-A-A-A畫B; A-A-A-A-C; A-A-A-B-A; A-A-A誦B曙B; A-A-A-B-C; ......j
A-A畫B-A-A; A-A-B匿A-B; A陽A-B畫A畫C; ......; E畫E-E-E-C; E畫E-E-E-D;
E-E-E-E畫E。另一種形式的組合庫為基于骨架的。這些構建體基于單一中 心分子或核心，包含可被建筑塊選擇性取代的位置。可舉出的實例為三 氯-三p秦(三個可取代的位置)，在其上可附著幾個取代基。如果取代基的 數目為3，則可能的組合數為10。也可以考慮每個取代基的相對位置； 這種情況下，組合的數目更大。
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作為第三水平，還可能將線性組合庫與基于骨架的庫組合， 其中后者的取代基為組合線性序列。成百萬的化合物可通過化學建筑塊的這種組合混合而合 成。對于肽結合部分，長度優選限于15, 10, 8, 6或4氨基酸。本發 明的核酸結合部分具有至少4個，更優選6， 8, 10， 15或至少20核苷 酸的優選長度。寡糖優選為至少5個單糖單位長度，更優選8， 10， 15, 20, 25或更多的單糖單位。組合庫可以是完全或不完全的。生物聚合物的完全組合庫為
的代表。不完全庫則對于給定的聚合物長度來說缺少 一種或多種可能的 單體排列。肽結合部分為要求保護的發明的優選實施方案。產生適用于
開、偶合和再結合，，方法(參見，例如Furkaetal.， Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493(1991); Houghton et al., Nature 354: 84-88(1991); Lametal., Nature, 354: 82-84(1991);國際專利申請WO 92/00091;以 及美國專利5,010,175， 5,133,866,和5,498， 538)或者現有技術中已知 的其它方法。肽庫的表達在Devlin etal.， Science, 249: 404-406(1990) 中也有描述。
骨架
建筑塊
如
ABC
+
5
S3
現有技術中公知的組合和合成化學技術可生成含有數百萬 成員的庫(Lametal., Nature 354: 82-84(1991)和國際(PCT)專利申請WO 92/00091),每種都具有獨特的結構。例如，以18種天然氨基酸制備的 線性六聚體配體庫含有34 x 106種不同的結構。當還包括進氨基酸類似 物和異構體時，潛在結構的數目實際上是無限的。此外，這種庫的每個 成員可能具有結合不同分子的能力。組合庫的成員可在固體支持物上合 成或被偶合到固體支持物，如小珠，每個小珠在其表面基本上具有數百 萬拷貝的庫成員。由于不同的小珠可以被偶合到不同的庫成員并且用于 偶合庫成員的小珠的總數巨大，所以能夠結合至小珠偶合的庫成員的不
同分子的可能數目是龐大的。 Hammond et al., US 2003/0212253(2003年11月13日)沿以
下的線路描述了組合庫。肽結合部分庫可以由相對于天然氨基酸提供了 增加的穩定性的氨基酸合成。例如，半胱氨酸、曱硫氨酸和色氨酸可以 從庫中剔除，并包括進非天然氨基酸，例如2-naphylalanine和正亮氨酸。 N末端氨基酸可以為D-異構體或可以被乙酰化以在氨基-肽酶存在下提 供更大的生化穩定性。結合部分密度必須足以為靶分子提供足夠的結 合，但是不能過高以至于結合部分自身相互作用而不是與耙分子相互作 用。結合部分密度為0.1 |nmole-500 pmole每克支持物干重是令人期望 的，并且優選結合部分密度為10 iLimole-100 pmole每克支持物。6-mer 肽庫被合成在Toyopearl-AF Amino 650M樹脂上(Tosohaas ， Montgomeryville, Pa.)。樹脂小珠的大小為每小珠60-130 mm的范圍。 通過偶合Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH( 1:3.8摩爾比)的混合物實現起始 樹脂的最初取代。偶合后，Boc保護集團被純TFA全部去除。然后，得 到的脫保護的氨基基團被乙酰化。肽鏈經由樹脂小珠上保留的Fmoc-Ala-OH位點組裝。采用了標準的Fmoc合成策略。在一個典型實驗的實 施方案中，6克的Fmoc-Ala-(Ac-Ala-)Toyopearl Resin用20。/o哌咬/DMF(2 x 20 min)脫保護，然后用DMF洗滌(8次)并等分至18個單獨的反應容 器。在每個單獨的容器中，使單一的Fmoc-氨基酸偶合至樹脂 (BOP/NMM, 5-10倍過量)，進行4-7小時。洗滌各樹脂，并采用"分開 /混合"庫技術組合(Furka et al.， Int. J. Peptide Protein Res.， 37, 487-493(1991); Lametal., Nature, 354， 82-84(1991);國際專利申請WO 92/00091(1992);美國專利5,010,175;美國專利5,133,866;以及美國專利5,498,538)。重復脫保護和偶合循環，直至完成氨基酸序列(對于六聚 體庫是6個循環)。采用20。/。哌口定/DMF在獨立的反應容器在最后的偶合 循環中從肽樹脂去除最后的Fmoc。用TFA處理(TFA:H.sub.20:Pheno1， 90:5:5)2小時除去側鏈保護基團。充分洗滌樹脂并在真空下干燥。所獲 得的肽密度通常在0.06-0.12 mmol/g樹脂的范圍。確認肽配體-樹脂小珠復合物的序列和肽組成，通過在 Commonwealth Biotechnologies, Inc., Richmond, Va.的定量氨基酸分沖斤 計算樹脂的取代程度。測序在Protein Technologies Laboratories, Texas A&M University采用Hewlett PackardG1005A通過Edman降解進行。用于制備組合庫的裝置為可購得的(參見，例如357 MPS， 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY， Symphony, Rainin, Wob誰，MA, 433A Applied Biosystems， Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore， Bedford, MA)。此外，多種組合庫本身就是可購得的(參見， 例i口 ComGenex, Princeton, N.J.， Tripos， Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton， PA, Martek Biosciences, Columbia, MD， etc.)。
2.小有機分子在本發明優選的實施方案中，所述方法包括使樣品與結合部 分庫結合的步驟，其中該庫為小有機分子的組合庫。因此，可考慮將小分子作為結合部分庫用于在本發明的方法 和試劑盒中使用。通常，小分子有機分子具有這樣的性質，它們使得能 與分析物有離子、疏水或親和相互作用。小有機分子庫包括通常用在層 析過程中的化學基團，例如單-、二-和三-曱基氨基乙基基團，單-、二-和三-乙基氨基乙基基團，磺酰基，磷酰基，苯基，羧曱基基團，等等。 例如，庫可以使用苯并二氮萆(參見，例如Bunin w ， Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 4708-4712)和peptoids(例如Simon et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 9367-9371)。在另一實施方案中，結合部分為染料 或三。秦衍生物。這種列舉絕非是窮盡的，因為本領域技術人員會很容易 地識別出數千種化學功能基團，其離子、疏水或親和性質與用作本發明 方法中的結合部分庫相符。
在本發明優選的實施方案中，小有機分子的組合庫被共價附 著至固體支持物，優選多個小珠。如下文進一步說明的，將小有機分子 的組合庫附著于固體支持物可以是直接的或者經由接頭。
3.生物聚合物在本發明優選的實施方案中，所述方法包括使樣品與結合部 分庫^t妻觸，其中該庫為生物聚合物的組合庫。在本發明的一個實施方案中，生物聚合物選自多肽、多核苷 酸、脂類和寡核苦酸。對于本發明的結合部分的生物聚合物庫來說，線性長度優選 為4至50單體單元，特別是不超過15,不超過IO，理想地8， 7， 6， 5, 4或3個單體單元。對于肽庫來說，長度優選限于不超過15， 10， 8， 6 或4個氨基酸。核酸庫優選具有至少4，更優選至少6， 8， 10, 15或至 少20核苦酸的長度。寡糖優選具有至少5個單糖單位長度，更優選至 少8， 10， 15， 20, 25或更多的單糖單位。在本發明的一個實施方案中，生物聚合物被共價附著到固體 支持物上，優選多個小珠。如下文進一步描述的，將生物聚合物的組合 庫附著于固體支持物可以是直接的或者經由接頭。
a)肽在本發明優選的實施方案中，生物聚合物是肽。尤其優選的 結合部分庫包含具有不超過50， 40, 30， 25, 20, 15， 10, 8， 6或4 個氨基酸的肽，由于它們易于通過重組或固相化學技術產生。此外，結 合部分的肽庫可以通過使它們容易用于本發明方法的方式產生。例如， 肽可以作為噬菌體展示庫重組產生，其中該肽作為噬菌體外殼的一部分 提呈(參見，例如Tang"a/., J Biochem 1997, 122(4): 686-690)。就此 而言，肽會被附著到固體支持物，噬菌體。其它的用于產生適用于本發 明的肽結合部分庫的方法也是本領域技術人員熟知的，例如"分開、偶 合和再組合"方法(參見，例如Furka W , Int J Peptide Protein Res 1991 ， 37: 487-493; Fodorefa/.， Science 1991, 251: 767-773; Houghton " a/., Nature 1991， 354: 84-88; LamWa/., Nature 1991, 354: 82-84;國際 專利申請WO 92/00091;以及美國專利Nos 5,010,175, 5,133,866，和
245,498, 538，通過參考將它們的整體都并入本文)或現有技術中已知的其 它技術。肽庫的表達在Devlin " "/., Science 1990， 249: 404-406中也
有描述。肽結合部分庫可以從相對于天然氨基酸提供了增強的穩定 性的氨基酸合成。例如，半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸可以從庫中剔除， 并包括進非天然氨基酸，例如2-naphylalanine和正亮氨酸。N末端氨基 酸可以為D-異構體或可以被乙酰化以在氨基-肽酶存在下提供更大的生 化穩定性。庫密度必須足以為分析物提供足夠的結合，但是不能過高以 至于結合部分自身相互作用而不是與靶分子相互作用。庫密度為0.1 pmole-500 |timole每克固體支持物干重是合適的，并且更優選庫密度為 10 pmole-lOO pmole每克固體支持物。其它優選的范圍為10 iumole至100 )Limole每毫升固體支持物。在一些組合肽庫的實施方案中，所述肽被表達在重組噬菌體 的表面以產生大庫。采用"噬菌體方法"(Scott and Smith, Science 249: 386-390, 1990; Cwirla， ef a/. ， Proc. Natl. Acad. Sci, 87: 6378-6382， 1990; Devlin ""/ ， Science, 49: 404-406， 1990)，可構建非常大的庫 (106-108化學實體)。第二種手段是主要使用化學方法，其中的實例為 Geysen方法(Geysen e"/., Molecular Immunology 23: 709-715, 1986; Geysen W a/., J. Immunologic Method 102: 259-274, 1987;和Fodorefa/. 方';去(Science 251: 767-773， 1991)。 Furka e/1 14th International Congress of Biochemistry, Volume #5, Abstract FR: 013， 1988; Furka， Int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493， 1991)， Houghton(美國專利4,631,211, 1986 年12月授權)和Rutter"a/.(美國專利5,010,175，1991年4月23日授權) 描述了產生可被試驗為激動劑或拮抗劑的肽混合物的方法。在本發明優選的實施方案中，所述方法包括使樣品與結合部 分庫接觸的步驟，其中該結合部分庫包括抗體庫(參見，例如Vaughn" a/., Nature Biotechnology 1996， 14(3): 309-314; PCT/US96/10287)。在
本發明優選的實施方案中，所述方法包括使樣品與展示在噬菌體顆粒上 的抗體庫纟妄觸。
b)多核苷酸
核酸為另一優選的結合部分的生物聚合物庫。如同肽一樣， 核酸可以采用本領域技術人員公知的合成或重組技術產生。術語"多核 苦酸"、"核酸"以及"核酸分子"在本文中可互換使用，指脫氧核糖 核普酸、核酸核普酸和/或它們的類似物的聚合物形式，不論是單鏈形式 還是雙鏈螺旋。核酸分子也可以包含修飾的核酸分子，例如甲基化的核 酸分子和核酸分子類似物。現有技術中已知嘌呤和嘧啶的類似物。核酸 可以是天然產生的，例如DNA或RNA,或者可以是合成的類似物，如 現有技術中所已知的。由于其良好的穩定性，這些類似物可以優選用作 結合部分。天然結構中的修飾，包括骨架、糖或雜環堿基中的改變，已 被證實增加細胞內穩定性和結合親和性。骨架化學中有用的變化為硫代 磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中全部兩個非橋接氧都被硫替代； phosphoroamidites; ^t基^l酉臾三酉旨和;屑酉臾石岸酸酉旨(boranophosphate)。無手 性的磷酸衍生物包括3'-0'-5'-S-硫代磷酸酯、3'-S-5'-0-硫代磷酸酯、3'-CH2-5'-0-磷酸酯和3'-NH-5'-0-磷酰胺。肽核酸以肽鍵置換了整個核糖磷 酸二酯骨架。優選的核酸結合部分為至少4，更優選至少6， 8， 10, 15, 或20核香酸長度。核酸結合部分包括雙鏈DNA或單鏈RNA分子(例如 適體(aptamer)),它們結合特異的分子耙，例如蛋白或代謝物。
(1) 寡糖生物聚合物可為寡糖。由此，寡糖結合部分也被考慮用在本 發明的方法和試劑盒中。寡糖結合部分優選為至少5個單糖單位的長 度，更優選至少8, 10， 15, 20， 25或更多單糖單位的長度。
(2) 脂類生物聚合物可為脂類。用在本文中時，術語"脂類(lipid)" 指疏水或雙親部分。因此，脂類結合部分也被考慮用在本發明的方法和 試劑盒中。適合的脂類包括C14至C50的脂族、芳基、芳烷基、芳基烯 基或芳基炔基部分，其可以包括至少一個選自氮、硫、氧和磷的雜原子。 其它適合的脂類包括磷酸甘油酯、糖基甘油酯、鞘磷脂、固醇、磷脂酰 乙醇胺或磷脂酰丙醇胺。脂結合部分優選為至少5單元的長度，更優選 至少8, 10, 15, 20, 25， 50或更多單元的長度。
26D.結合部分向固體支持物的附著在本發明優選的實施方案中，所述方法包括使樣品與結合部
分庫接觸的步驟，其中，結合部分庫被附著到固體支持物。 1.固體支持物可接受的用在本發明中的固體支持物可以有很多種。固體支 持物可為多孔或非多孔的，但優選多孔的。其可為連續的或不連續的， 柔性的或非柔性的。固體支持物可由多種材料制成，包括陶瓷、玻璃、 金屬、有機聚合物材料或其組合。優選的固體支持物包括有機聚合物支持物，例如顆粒或小珠 支持物、紡織或無紡織網(例如纖維網)、微孔纖維、微孔膜、空纖維或 管。也可使用聚丙烯酰胺和礦物支持物，例如硅酸鹽和金屬氧化物。紡 織和無紡織網可以是規則的或不規則的表面物理配置。尤其優選的實施 方案包括球形或不規則形狀的小珠或顆粒形式的固體支持物。由于多孔材料提供了大的表面積，也是可用的。多孔支持物 可以是合成的或天然的，有機的或無機的。具有孔結構的適合的固體支 持物具有至少約1.0納米(nm)的直徑和至少約0.1立方厘米/克(cmVg)的 孔體積。優選地，孔直徑為至少約30nm，由于更大的孔對擴散限制更 少。優選地，對于更大的潛在容量而言，孔體積為至少約0.5cm3/g，由 于其更大的表面積圍繞著孔。優選的多孔支持物包括顆粒或小珠支持 物，例如瓊脂糖、親水聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、礦物氧化物和Sepharose, 包括球形和不規則形狀的小珠和顆粒。為了顯著的優勢，用于結合部分的固體支持物優選為親水 的。優選地，親水聚合物為水可溶脹的，以使得分析物更好地滲透。這 類支持物的實例包括天然多糖，例如纖維素、改性纖維素、瓊脂糖、交 聯葡聚糖、氨基改性的交聯葡聚糖、瓜兒膠、改性瓜兒膠、黃原膠、豆 角膠和水凝膠。其它的實例包括交聯的合成親水聚合物，例如聚丙烯酰 胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇(PVA)和改性聚乙二醇。另一種形式的固體支持物為噬菌體，如用在噬菌體庫中的一 樣。噬菌體展示庫從噬菌體形成，該噬菌體經重組處理以表達作為噬菌體蛋白外殼一部分的結合部分。采用噬菌體展示，可容易地構建結合部 分庫并用于本發明的方法。
2.微顆粒固體支持物本發明的優選實施方案使用小的、小珠形的微粒固體支持 物，它們直徑小于1000)am,優選小于IOO， 10， l或0.1pm。微粒固體 支持物是適合的，因為它們與更大的小珠相比具有較大的表面積體積 比。微粒固體支持物也降低了容納組合庫所必需的支持物的體積，由此 能使用更復雜和有效的支持物。但是，采用現有的設備，不容易在非常 小(<10^ )的小珠上合成組合庫，這是由于所使用的濾器系統在釉料尺 寸(frit size)方面的限制。為了克服這個問題，組合庫可以在小珠上成批 合成，它們隨后可以通過機械研磨、擠壓或聲波降解片斷化來形成粉末 或微粒集合。采用這些技術，可以產生偶合至不同結合部分的微粒固體 支持物。繼而這些又可被充分混合以形成相對于混合更大的或不同大小 的不同小珠而言更均一的組合物。表面上未反應的交聯基團可以與小化合物如巰基乙醇反應 以防止進一步的反應性。此外，表面可以被進一步處理以防止蛋白的非 特異性附著。微粒固體支持物也可以為磁性小珠，使得易于一步分離未結 合的靶蛋白群和結合到偶合至磁性小珠的結合部分的蛋白。通過包括質譜、SDS-PAGE、毛細管電泳在內的幾種方法或 通過等電聚焦，可對被洗脫的分析物(例如，少量的靶蛋白群和污染蛋白) 根據分子量分析蛋白組成。或者，微粒固體支持物可以與填充劑復合并被壓成小片形 式。為這種形式時，其可被直接加至樣品溶液，或者先在緩沖液中懸浮。微粒固體支持物可以被置于溶液如瓊脂糖或丙烯酰胺中，并 被交聯進凝膠自身或者通過交聯劑在纖維上彼此交聯以形成大塊材 料。或者，微粒固體支持物可以被固定到粘性物的薄膜上。
J^ ^i^ ^i^另一種方式是將微粒固體支持物俘獲進多孔基質中。這些基 質可以包括無紡纖維或織物，顆粒可能在噴熔階段并入。
28
微粒可被并入單層或層疊膜中，如為了獲得合適的所需結合
容量所需的，其中微粒固體支持物通過壓延(calendaring)或水纏結 (hydroentanglement)^^孚獲在各層之間。膜組合物可選自天然或合成來源，包括聚酯和聚丙烯纖維和 絲網。當然，本領域技術人員會意識到在這部分中描述的很多技術一般 也適用于本發明的其它實施方案。
3.將結合部分偶合至固體支持物在本發明優選的實施方案中，結合部分被偶合至一種或多種 固體支持物。將結合部分偶合至固體支持物可以通過多種機制來完成。通過使之前制備好的結合部分庫結合到固體支持物，固體支 持物可被完全制備的結合部分庫衍生化。或者，通過將前體分子結合至 固體支持物并隨后向通過第一前體分子結合至固體支持物的生長鏈添 加另外的前體分子，結合部分庫可以在固體支持物上形成。當結合部分 是聚合物，尤其是諸如多肽、多核苷酸或多糖分子的生物聚合物時，這 種在固體支持物上構建吸附物的機制尤其有用。采用本領域已知的方 法，可通過連續向結合至固體支持物的第一單體組分(monomeric component)添加單體組分(例如氨基酸、核苷酸或單糖)來提供生物聚合 物結合部分。參見，例如美國專利5,445,934(Fodor " "/.),在此通過參
考將其整體并入。少至1個，多至10， 100， 1,000， 10,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 1,000,000,000或更多的結合部分可以被偶合至單個固體支
持物。在優選的實施方案中，固體支持物為小珠形式，每個小珠結合有 單一的、不同的結合部分類型。例如，在肽結合部分庫中，代表一種可 能的氨基酸排列的肽被結合至 一種小珠，而代表另 一種可能的排列的肽 被結合至另一種小珠，以此類推。結合部分可以采用可逆或不可逆反應被偶合至固體支持
物。例如，可以采用包括至少一種任選地通過間隔基團化學結合至結合 部分的反應官能團(如羥基、羧基、巰基、或氨基)的支持物進行不可逆
反應。適合的官能團包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、磺酰酯、碘乙酰基、醛、 環氧、咪唑基氨基甲酸酯、以及溴化氰和其它卣活化的支持物。可通過 多種已知的技術來提供這些官能團。例如，玻璃表面可用氨基丙基三乙氧基曱硅烷以已知的方式衍生化。在一些實施方案中，結合部分在合成 過程中就被偶合至固體支持物，這是本領域技術人員所已知的(例如固相 肽和核酸合成)。或者，固體支持物和結合部分之間的可逆相互作用可以采用 與固體支持物和/或結合部分結合的接頭部分來進行。多種適用于本發明
的接頭部分為已知的，其中的一些在本文中討論。采用接頭部分偶合不 同的試劑對于本領域技術人員來說是已知的，只需常規實驗，他們就可 采用這種公知常識來形成適用于本發明的固體支持物/結合部分偶合。在某些實施方案中，每種不同的結合部分被偶合至不同的固 體支持物。例如，當采用分開池和重纟且方法(split-pool-and-recombine method)在小珠上構建組合庫時，就是如此。或者，結合部分的集合可以 被偶合至小珠池，以至于每個小珠附著有多種不同的結合部分。這例如 可通過在第一套支持物上創建組合庫、從支持物切下結合部分并將它們 重新偶合至第二支持物集合來完成。
a)接頭部分將結合部分偶合至固體支持物也可以例如通過采用接頭部 分來完成。在本發明的這種實施方案中，使樣品與結合部分接觸，該結 合部分包括接頭部分，其使得能使結合部分靶向和/或可逆偶合至固體支 持物，優選微粒固體支持物。"接頭部分"使得結合部分能被偶合至包 含互補接頭部分的互補固體支持物。示例性的接頭部分包括表位和his標簽，它們被連接至結合 部分如肽以形成融合蛋白。在這些情況下，可切割的接頭序列，如特異 于因子XA或腸激酶(Invitrogen, San Diego, Calif.)的那些可以任選地被 包括在肽和接頭之間，以幫助分離和/或分開融合分子的各組分。被設計 的配體特異識別的蛋白結構域也可以被用作結合部分(參見，例如 Deisenhofer, Biochemistry 20(1981)2361-2370)。很多其它的類似接頭部 分在現有技術中是已知的。參見，例如Hochuli, Chemische Industrie, 12: 69-70(1989); Hochuli, Gewe/7c ^EV g7力een力g,尸n力cZ/ /e aw<i A/e/7^(is1, 12 : 87-98(1990) , Plenum Press ， N. Y.; 以及 Crowe , W
30S"fem, QIAGEN， Inc. Chats worth, Calif.;將它們的整體通過參考并入 本文。被偶合至固體支持物的結合部分的抗原決定簇和其它特性 也可用作接頭部分標簽。示例性的標簽部分包括多組氨酸(多-his)或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽；流感HA標簽多肽和其抗體 12CA5(Field"a/., Mol Cell Biol 1988， 8: 2159-2165); c-myc標簽和其 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7和9E10抗體(Evan W a/., Mol Cell Biol 1985， 5: 3610-3616);以及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標簽和其抗體(Paborsky "a/., Protein Engineering 1990， 3(6): 547-553)。其它的標簽抗體包括 Flag肽(Hopp a/. ， BioTechnology 1988， 6: 1204-1210); KT3表位肽 (Martin""/., Science 1992， 255: 192-194); a-微管素表位肽(Skinner" a/., J Biol Chem 1991, 266: 15163-15166);以及T7基因10蛋白肽標 簽(Lutz-Freyermuth a/. ， Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6393-6397)。
E.使樣品與結合部分庫接觸并使樣品與其結合
本發明提供了純化靶蛋白群的方法。這些方法包括(a)使包含 至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與具有至少100種不同結
合部分的結合部分庫接觸，其中結合部分的量足以結合污染蛋白和少部 分的靶蛋白群，和(b)使污染蛋白和少部分的靶蛋白群與結合部分庫結 合。當引入含有多種分析物的樣品時，結合部分將結合樣品中的 各種污染物，例如污染蛋白。大量的分析物，例如目的輩巴蛋白群以遠遠 超出飽和它們各自的結合部分的量存在。因此，這些大量的分析物總量 的大部分將保持為未結合，僅少部分被結合至結合部分。與此相反，較 少量的微量分析物，例如污染蛋白，則意味著不會飽和所以它們可用的 結合部分。因此，起始量的絕大部分污染蛋白將結合至它們各自的結合 部分。在每種結合部分結合樣品中其對應的分析物條件下，使存在 于樣品中的分析物，靶蛋白群和污染蛋白，與具有至少100種不同結合 部分的結合部分庫接觸。通常，在使污染蛋白和少部分的靶蛋白群能夠 結合至結合部分的條件下使樣品與結合部分庫接觸。純化耙蛋白群的條件將隨多種參數變化，包括靶蛋白群的固有性質、污染蛋白的性質，等等。使樣品與結合部分庫接觸可通過多種方法來實現。例如，使 結合部分庫與樣品接觸可以通過混合二者、將樣品抹入結合部分庫、使 樣品流過在其上附著有結合部分庫的固體支持物以及其它對本領域普 通技術人員來說顯而易見的方法來完成。在本發明優選的實施方案中， 使樣品與結合部分庫接觸是在懸浮分批法中完成，在本發明另 一優選的 實施方案中，使樣品與結合部分庫接觸是通過使樣品穿過柱來完成，其 中柱中填充有連接至固體支持物的結合部分庫。在本發明另 一優選的實 施方案中，使樣品與結合部分庫接觸包括流化床過程。如上所推斷的，結合部分可以與樣品直接接觸，或者結合部 分可以首先結合至固體支持物。舉例而言，在一個優選的實施方案中， 結合部分包括接頭部分。在這個實施方案中，在使得存在于樣品中的分 析物(即靶蛋白群和污染蛋白)能結合至結合部分的情況下，使結合部分 直接與樣品接觸。經過足夠長的時間后，使包括互補接頭部分(互補于結 合部分的接頭部分)的固體支持物與樣品接觸。這使得結合部分與固體支 持物通過接頭部分偶合，同時保留有捕獲的分析物。例如，具有生物素 接頭部分的結合部分會與包含有偶合至其表面的抗生物素蛋白或鏈霉 親和素的固體支持物偶合。在本發明的一個實施方案中，結合部分庫在與樣品接觸前被 偶合至固體支持物。在該備選的實施方案中，讓固體支持物(帶有偶合的 結合部分)簡單地與樣品接觸足夠的時間以使得結合部分能結合分析 物，然后使固體支持物與經由在分析物和結合部分之間形成復合物而與 其結合的分析物 一起從樣品中取出。結合部分可以直接添加至包含耙蛋白群和污染蛋白的樣品 中。或者，為此可以添加任何適合的結合緩沖液。示例性的結合緩沖液 包括極低或極高離子強度的鹽水溶液、去垢劑溶液和有機溶劑，如下文 進一步討論的。竟爭結合結合部分的試劑的溶液和懸浮液也可以用在結 合緩沖液中，只要這些竟爭結合試劑不干擾隨后結合污染蛋白和少部分 的靶蛋白群。所選擇的結合緩沖液為應用-特異的并且可以容易地由本領
馬全進4亍鑒另ll(參見，例3口 B"j^ers1. J /or /Ve/ ofra"o" a"<i f7^e o/j5w,w j5/o/og/c"/ 5ywe/ w ， Gueffroy ， D. ， Ed. CalbiochemCorporation(1975) ; 5"co/ es ， 尸ro e/" 尸w〃/z'ca/7'o".. 尸n'"c;^/es aw<i尸rac"ce(1982); 以及Deutsche" 1990) "Gw/t/"o尸廣o她尸鵬77c加ow，，A^//2o<^ z力￡> z>wo/ogy vol. 182, 和該系歹寸中的其它巻)。典型地，在結合緩沖液中存在有樣品和結合部分。適合的結合緩沖液的非限定性實例包括含有50 mM磷酸鈉和0.15 M NaCl的溶液，pH7;含有50mM磷酸鈉和0.15MNaCl的溶液，pH 8;等等。適合的結合緩沖液包括例如基于Tris的緩沖液，基于硼酸的緩沖液、基于碌酸的緩沖液、味峻、HEPES、 PIPES、 MOPS、 MOPSO、 MES、 TES、醋酸、檸檬酸、琥珀酸等等。適合的結合緩沖液的實例包括改變分析物和/或結合部分表面電荷的那些，例如pH緩沖溶液。pH緩沖溶液優選為強緩沖溶液，足以維持溶液的pH在酸性范圍，例如在小于7，優選小于6.8, 6.5, 6.0，5.5, 5.0， 4.0或3.0的pH，或者在高于7，優選高于7.5， 8.0， 8.3, 8.5，9.0， 9.3， 10.0或11.0的pH。
適于從包含靶蛋白群和污染蛋白的樣品純化靶蛋白群的pH條件是約3.5至約1、約3.5至約11、約4.0至約10.0、約5.0至約9.0、約5.5至約8.5、約6.0至約8.0或者約6.5至約7.5。在本發明備選的實施方案中，結合緩沖液具有約6.5至約8.5的pH范圍。或者，可以使用不同鹽濃度的結合緩沖液。適合于從包含靶蛋白群和污染蛋白的樣品純化耙蛋白群的示例性NaCl鹽濃度在約0.01M NaCl至約3 M NaCl的范圍，約0.05 M NaCl至約1.5 M NaCl的范圍，約0.1 M NaCl至約1.0 M NaCl的范圍，或者約0.2 M NaCl至約0.5 MNaCl的范圍。優選的結合緩沖液具有約0M至約0.25M的范圍。在結合緩沖液中其它適合的鹽為KCl或NaHOAc。其它的適合于本發明的結合緩沖液包括以上提及的緩沖液組分的組合。由兩種或多種上述結合緩沖液組分制備的結合緩沖液能夠改變污染蛋白和結合部分之間分子相互作用的選擇性。本領域普通技術人員應理解的是，用于蛋白純化的溫度條件可以隨待純化的目的靶蛋白群的性質而變化。通常，適合于從包含靶蛋白群和污染蛋白的樣品純化靶蛋白群的溫度條件在約4°C至約40°C的范圍，約15t:至約4CTC的范圍，約2CTC至約37。C的范圍，或者約22。C至約25。C的范圍。典型的溫度條件在約4'C至約25。C的范圍。 一個優選的溫度是約4°C。
一段足夠長的時間，以便污染蛋白和二部分的靶蛋白結合至結合部分庫。典型地，結合部分庫和包含靶蛋白群和污染蛋白的樣品一起孵育至少約10分鐘，經常是至少約20分鐘，更經常是至少約30分鐘，更經常是至少約60分鐘。孵育時間也可以是幾個小時，例如多至12小時，但通常不超過l小時。當例如采用柱實施本發明的方法時，樣品與結合部分庫接觸的時間被稱為保留時間。典型的保留時間在約1分鐘至約20分鐘的范圍。 —旦分析物已被結合至結合部分，可能希望洗脫分析物用于其它分析。有效的洗脫緩沖液中包括描述在表1中的那些。它們可以單獨使用或按照預訂的順序使用(例如，首先是起離子交換作用的洗脫劑，然后是能夠解除親和相互作用的洗脫劑，等等)。
表h針對吸附至固相肽庫的蛋白的不同洗脫方案列表
洗脫劑組分解離的鍵
杜1M氯化鈉離子相互作用
乙二醇50%乙二醇水溶液中等的疏水結合
酸性pH200 mM甘氨酸-HC1 pH2.5氫4建，構象變化
解離-去垢劑2 M硫脲-7 M脲-4%混合模式，疏水結合，氫
CHAPS鍵
變性劑6 M胍誦HC1 pH6所有類型的相互作用
水-有機的乙腈(6.6)-異丙醇-(33.3)-三氟乙酸(0.5)-水(49.5)強的疏水結合
酸解離劑9 M脲，2% CHAPS,力口 檸檬酸至pH 3.0-3.5氬鍵、離子相互作用
石咸解離劑9 M脲，2% CHAPS,力口 氨至pH 11離子相互作用、氫4定本發明優選的洗脫緩沖液包括適用于質譜儀的基質材料。在緩沖液中包括基質材料，本發明的 一些實施方案可以任選地包括將分析
34物從結合部分直接洗脫至質譜探測器，例如蛋白或生物芯片。在本發明的其它實施方案中，可以在從結合部分洗脫后使該基質與分析物混合。
其它的實施方案包括將分析物直接洗脫至SEND或SEAC/SEND蛋白芯片，其包括預置在蛋白芯片上的能量吸收基質。在后面的這些實施方案中，不需要在稀釋緩沖液中存在額外的基質材料。
F.分離和收集靶蛋白群本發明提供了從樣品純化把蛋白群的方法。這些方法包括將樣品中未結合的靶蛋白群與結合至結合部分的污染蛋白和靶蛋白群分開的步驟。收集的靶蛋白群比樣品中的靶蛋白群更純。如之前所描述的，捕獲劑(capture agent)可在其與樣品接觸之前或之后被偶合至固體支持物。因此，通常，本發明的方法包括將未結合的靶蛋白群與結合至已偶合至固體支持物的結合部分結合的污染蛋白和靶蛋白群分開。這種分離可以以多種方式完成，包括但不限于例如離心、柱層析、使用接頭部分或使用磁性小珠。在一個實施方案中，將未結合的靶蛋白群與結合至已偶合至固體支持物的結合部分的污染蛋白和靶蛋白群分開是通過離心來完成。在離心包含靶蛋白群和結合至固體支持物的結合部分的樣品后，結合至結合部分的蛋白被沉淀。未結合的靶蛋白群將存在于上清液中，由此可^皮收集。在另一實施方案中，將未結合的靶蛋白群與結合至已偶合至固體支持物的結合部分的污染蛋白和耙蛋白群分開通過使用磁力來進
行。結合至結合部分/磁性小珠的蛋白將被牽引離開未結合的靶蛋白群。未結合的靶蛋白群將存在于上清液中，由此可被收集。通常磁性小珠包含鐵磁性氧化物顆粒，例如鐵》茲性鐵氧化物、f茲赤鐵礦、》茲鐵礦或錳鋅鐵氧體(參見，例如美國專利6,844,426)。在另一實施方案中，將未結合的靶蛋白群與結合至已偶合至固體支持物的結合部分的污染蛋白和靶蛋白群分開通過柱層析完成。在結合污染蛋白和少部分的靶蛋白群之后，將混合物上柱，該柱保留固體支持物和與其結合的蛋白。未結合的靶蛋白群將存在于流出物中，由此
可一皮收集。G.評估純化的耙蛋白群的純度采用本文描述的發明方法，靶蛋白被純化至所需的純度。應
用本發明的方法，通常導致收集的靶蛋白群比樣品中的靶蛋白群更純。
因此，靶蛋白群被進一步純化，至少96%純，至少97%、更優選至少98%，更優選至少99%純。評估采用本文描述的技術純化的靶蛋白群的純度或者以其它方式對其進行檢測、定量或表征可以采用本領域技術人員已知的任何適合方法來進行(也參見實施例)。例如，采用染料的比色測定是廣泛使用的。或者，可以通過光譜方法完成檢測。光譜檢測器依賴于折射率的變化；紫外和/或可見光吸收或以合適波長激發后的焚光來檢測組分。示例性的檢測方法包括熒光比色法、吸收、反射和透光光譜法。檢測的其它實例基于使用抗體(例如ELISA和Western印跡)。雙折射、折光率或衍射的變化也可以被用于監測復合物形成或反應進展。尤其有用的監測分子相互作用的技術包括表面等離子共振、橢圓偏光術(ellipsometry)、共振鏡像技術(resonant mirror technique)、光柵偶合的波導技術以及多極共振光譜法。這些以及其它技術是公知的，本領域技術人員無需過多的實驗就可將其應用于本發明。這些方法中的很多和其它方法可以在例如"Spectrochemical Analysis" Ingle， J.D. and Crouch, S.R. ， Prentice HallPubl.(1988)and "Analytical Chemistry" Vol. 72， No. 17中找到。另一優選的用于表征純化的靶蛋白群的方法為質譜法。質譜技術包括，但不限于，離子化(I)技術，如基質輔助激光解吸(MALDI)、連續或脈沖電噴霧(ESI)和相關技術(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)，或塊狀團簇沖擊(MCI);這些離子源可與檢測形式匹配，包括線性或非線性反射飛行時間(TOF)、單或多四極桿、單或多扇形磁場、傅里葉變換離子回旋加速器(FTICR)、離子陷阱以及組合(例如，離子陷阱/飛行時間)。對于離子化，可以采用多種基質/波長組合(MALDI)或溶劑組合(ESI)。例如，采用ESI(Valaskovic， G. A. (1996)Science273: 1199-1202)或MALDI(Li, L. , (1996)1 Am. Chem. Soc. 118:1662-1663)質譜法，Subattomole水平的分析物已被檢測。ES質譜法已由Fenn等人引入(J. Phys. Chem. 88, 4451-59(1984); PCT申請WO90/14148)，當前的應用總結在最近的綜述文章中(R. D. Smith""/., Anal.Chem. 62, 882-89(1990)和B. Ardrey， Electrospray Mass Spectrometry,Spectroscopy Europe, 4, 10-18(1992))。 MALDI-TOF質譜法已由 Hillenkamp等人引入("Matrix Assisted UV畫Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules," S/o/og/c"/ Mm* S/7ec;rowe/77(Burlingame and McCloskey, 編輯)，Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49-60， 1990)。采用ESI,在飛摩爾量的樣 品中確定分子量是非常精確的，由于多離子峰的存在可以被用于質譜計 算。優選的分析方法采用表面增強激光解吸附/離子化(SELDI)，例如在 美國專利6,020,208中所討論的。在本發明的一些實施方案中質譜法是 尤其優選的檢測方法，這些實施方案中使分析物直接捕獲進質譜探測器 或生物芯片，或者捕獲緩沖液含有基質材料或在從結合部分洗脫分析物 之后與基質材料混合。另一種廣泛使用的檢測和耙蛋白群表征的方法為基于目的 分析物的一種或多種物理性質的電泳分離。尤其優選的分析多肽和蛋白 分析物的實施方案為二維電泳。優選的應用在第一維度通過等電點分離 分析物，而在第二維度通過大小分離分析物。此外，純化的靶蛋白群和 結合至結合部分的蛋白可例如通過SDS-PAGE和隨后的染色來分析(參 見實施例)。分析物的電泳分析方法隨所研究的分析物而有相當大的變 化，但是鑒別適合于給定的分析物的特定電泳方法對本領域技術人員是 公知的。質譜分析通常在質荷比(m/z)的特定值處顯示蛋白峰。當用在 本文時，峰為相對于一個或多個m/z、層析保留時間或其它合適的變量 信號密度的局部最大值。通常，密度值或峰密度(高度、曲線下面積或其 它適合的密度衡量)為任意單位，其絕對值取決于多種因素，例如檢測器 設置。對樣品(即，包含至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋白)峰和包含 根據本發明純化收集的靶蛋白的溶液峰的測量和比較，提供了對所收集 的靶蛋白群的純度的評估。也可能例如使用Polaroid 665正/負即顯膠片 拍攝負片(negative photograph)并對負片進行光密度測量來對所收集的 靶蛋白群定量。從通過光密度評估每個蛋白帶而獲得的每個曲線下面積 開始，可計算所收集的靶蛋白群的純度。
H.純化靶蛋白群的其它歩驟
37
通常，本發明的方法可與用在耙蛋白群下游處理中的常規分 離方法聯合使用。
1.培養宿主細胞在本發明優選的實施方案中，所述方法包括在使包含靶蛋白 群的樣品與結合部分庫接觸之前培養產生靶蛋白群的細胞的步驟。在優 選的實施方案中，所述細胞為如上所述的宿主細胞。對于給定的宿主細 胞，優選的培養條件可以在科技文獻中找到和/或從宿主細胞來源如美國 典型微生物收藏所得到。培養的宿主細胞可為真核細胞或原核細胞。培養宿主細胞的 方法在現有技術中是已知的。用于產生靶蛋白群的真核宿主細胞可以在 多種培養基中培養。可購得的培養基如Ham's F10(Sigma)、最小必須培 養基((MEM)， (Sigma) 、 RPMI-1640(Sigma)以及Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)， Sigma)適于培養真核宿主細胞。此外，在Ham e, a/., Meth. Enz. 58: 44(1979)， Barnes " a/., Anal. Biochem.102: 255(1980)，美國專利4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655;或 5,122,469; WO90/03430; WO 87/00195;或美國專利Re. 30,985中描述 的任何培養基都可以用作宿主細胞的培養基。需要時，這些培養基中的 任何培養基都可以補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白 或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、 核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(如Gentamycin )、痕量元素(被定義為 通常以微摩爾范圍最終濃度存在的無機化合物)以及葡萄糖或等價能
^來。培養條'件，、例如溫度、:H等為^對表達所選的用于宿主纟:胞的 先前使用的條件，這對普通技術人員來說是已知的。培養原核細胞、表達重組蛋白和產生肽的方法在現有技術中 是已殺口的(參見,i"列々口 Sambrook " ， A/o/ecwAar C7om."g，」Z"6on2for少 M2簡"/(2nd ed. 1989); Kriegler ， Gewe 7><ms/er 朋J五x/^e柳'ow.' 爿 Z^ora/1(97 Mw認/( 1990); 以及Ausubel W , eds., O^rew/1尸raZocoAy z'w 楊/ecw/ar Bz'o/ogy, Greene Publishing Associates and Wiley interscience, N.Y.(1994))。2. 純化在先樣品在本發明的一個實施方案中，所述方法進一步包括在使樣品
與結合部分庫接觸之前使包含靶蛋白群和污染蛋白的在先樣品經過至 少一種純化步驟并收集包含耙蛋白群和污染蛋白的樣品的步驟，由此樣 品中的靶蛋白群比在先樣品中的靶蛋白群更純。包含少于95%目的耙蛋白群的在先樣品可以以多種方式進 行處理，以改善其性能并獲得包含至少95%靶蛋白群的樣品，其可被用 在本發明的方法中。對在先樣品的這種操作包括純化、除去某些分析 物、濃縮、磨碎、提取、浸濾、稀釋、過濾、篩濾，等等，它們提高目 的靶蛋白群的純度使其適用于本發明的方法。例如，固體樣品可以被微 粉化成粉末，然后使用水性或有機溶劑提取。來自粉末的提取物然后可 以用于本發明的方法。氣體樣品可以被鼓泡或濾過溶液以在液體中溶解 和/或濃縮氣體的組分，隨后將該液體用于本發明的方法。其它的純化步驟包括但不限于過濾、透析、沉淀(例如硫酸 銨沉淀、乙醇沉淀)；制備電動方法(例如電泳，等電聚焦)、液體層析(例 如陰離子或陽離子交換層析、羥基磷灰石層析、采用抗體的親和層析、 疏水相互作用層析(HIC)、反相HPLC、硅膠柱層析、色語聚焦以及凝膠 過濾)。
3. 制備藥物組合物根據本發明方法純化的靶蛋白群可以被用于制備藥物組合 物，該藥物組合物可被用于該耙蛋白群的已知的各種治療或其它用途。 因此，在本發明的一個實施方案中，所述方法還包括使所收集的靶蛋白 群與藥物可接受的載體混合制備藥物組合物的步驟。這種載體可為無菌液體，例如水和油，包括石油、動物油、 植物油或合成來源的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。當 藥物組合物通過靜脈給藥時，優選的載體為水。鹽溶液和含水葡萄糖以 及甘油溶液也可以用作液體載體，尤其是用于可注射溶液。適合的藥物 載體包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、淀粉、白堊、 硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、干燥脫脂奶粉、 甘油、丙二醇、水、乙醇，等等。
39
口服制劑可包括標準載體，例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀 粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等等。適合的藥物載體的實
例描述在E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。這
類藥物組合物將含有治療有效量的根據本發明純化的靶蛋白群，連同適 合量的載體，以便為向宿主給藥提供適當的形式。
II. 藥物組合物本發明還提供了藥物組合物。在優選的實施方案中，該藥物 組合物包含根據本發明方法制備的耙蛋白群以及藥物可接受的載體。藥物組合物的耙蛋白群可以是本文描述的任何蛋白或現有 技術中已知的蛋白。根據本發明的方法制備的靶蛋白與現有技術中已知 的靶蛋白群的區別在于包含所純化的靶蛋白群的最終溶液的純度和不 存在污染蛋白。如本文所述，通常即使是高度純化的蛋白制劑(參見實施 例l)也包含采用標準技術不能與目的靶蛋白群分離的污染蛋白。但是， 采用本發明的方法純化靶蛋白群，則污染蛋白能夠幾乎完全被去除。因 此，采用本發明方法純化的靶蛋白群特征在于其更好的純度，因而是更 令人期望的并且不同于通過其它技術純化的靶蛋白群。如果需要，本發明的藥物組合物還可含有小量的增濕或乳化
劑，或pH緩沖劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸
劑、粉末、緩釋制劑等等的形式。組合物可被制備為栓劑，含有傳統的 粘合劑和載體，如甘油三酯。
III. 試劑盒本發明還提供了用于純化靶蛋白群的試劑盒。該試劑盒含有 使得本領域普通技術人員能進行本文描述的方法的組分。在優選的實施 方案中，該試劑盒包括具有至少ioo種不同結合部分的結合部分庫和通
過使包含至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與給合部分庫接 觸來純化把蛋白群的使用說明。該使用說明可以以多種形式存在于所述試劑盒中，試劑盒中 可存在有一種或多種形式。使用說明可以作為適合的介質或基底上的印 刷信息而存在，例如一頁紙，在其上印刷有如何通過使包含至少95%耙 蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與結合部分庫接觸來純化靶蛋白群的信息。另一形式可能是計算機可讀形式的介質，例如CD或軟盤，在其
上記錄了如何通過使包含至少95%靶蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品
與結合部分庫接觸來純化靶蛋白群的信息。另一形式可能是網址，其可
被試劑盒的使用者使用，經由因特網訪問關于如何通過使包含至少95% 靶蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與結合部分庫接觸來純化靶蛋白群 的信息。在本發明的另一實施方案中，本發明的試劑盒還包括多個容 納有用于使樣品與結合部分庫接觸的孵育緩沖液的容器，或 一 個或多個 柱，例如分級分離柱。在本發明的一些試劑盒中，結合部分庫以結合至固體支持 物、優選不溶性小珠的形式被提供。在其它實施方案中，固體支持物和 結合部分庫被分開提供。當分開提供時，結合部分庫和/或固體支持物包 括結合部分和/互補接頭部分，它們使得本發明的實施者能夠在進行本文 描述的發明過程中將結合部分偶合至固體支持物。提供分開的結合部分 庫和固體支持物的試劑盒可以任選地包括其它的為進行結合部分庫向 固體支持物的偶合所需的其它試劑。此外，本發明的試劑盒可包括用于從在先樣品純化靶蛋白的 層析介質，便于隨后采用本發明的結合部分庫的精制。本發明的其它試劑盒實施方案包括任選的功能性組分,其使 得本領域普通技術人員能進行本文描述的任何方法變體。盡管前述的發明已經通過解釋說明和實例的方式出于清楚 和理解目的而進行了一定程度的詳細描述，但是對本領域普通技術人員 而言顯而易見的是，借助于本發明的指導可在不脫離本發明的精神和范 圍的情況下對其進行某些變動、修改、修飾和等價替換。結果，本文描 述的實施方案可經受各種修飾、變化等，而本發明的范圍僅通過參照所 附的權利要求來確定。本領域技術人員可容易地意識到多種非關鍵性的 參數可以改變、變動或修飾以得到基本上類似的結果。盡管本發明的每個要素在本文中都被描述為含有多個實施 方案，但是除非另有說明，應理解的是本發明給定要素的每個實施方案 能夠與本發明其它要素的每個實施方案一起使用，而每種這類使用旨在 形成本發明的不同實施方案。
從以上的公開內容可知的是，本發明具有多種多樣的應用。 本發明進一步通過以下的實施例來舉例說明，它們僅僅是說明性的而無 意以任何方式限制本發明的定義和范圍。
IV.實施例
實施例1:從純化的肌紅蛋白分離血清蛋白首先將純的肌肉肌紅蛋白(Sigma)用人血清蛋白污染，所得 到的混合物(包含95%的肌紅蛋白(即目的靶蛋白群)和至多5%的污染血 清蛋白)隨后采用連接到小珠的組合肽庫精制。該組合肽庫包含約 30,000,000結合部分。將肌紅蛋白以10 mg/ml的濃度溶解在25 mM磷酸緩沖液 (pH 7.4)中。向該溶液中加入5%去除了白蛋白的人血清蛋白(即污染蛋 白)。這對應于在溶液中存在至多5%的肌紅蛋白。隨后將400 pL蛋白溶 液與80 pL的連接至固相的組合肽庫混合。在室溫下將懸浮液輕輕晃動 60分鐘。然后，通過過濾將上清液(未結合的精制的肌紅蛋白)與結合至 連接到固相的組合肽庫的蛋白質分開。用磷酸緩沖液洗滌固相。結合到 組合小珠庫的蛋白(蛋白雜質)隨后被完全解吸附并收集用于分析。所得到的組分通過SDS-PAGE分析，并與起初的被污染的肌 紅蛋白進行比較(圖1)。在污染的肌紅蛋白中可清楚地看到幾種蛋白雜 質(道a)。它們為不同的分子量并代表約5%的總蛋白；它們中的大部分 來自所添加的血清，極少的其它蛋白為最初純的肌紅蛋白的一部分。道 b顯示精制的血紅蛋白。在采用組合肽庫精制之后，肌紅蛋白的最終純 度高于精制處理前(比較道"a"和"b")。總的回收率估計為約95%。結 合到組合肽庫并在精制后完全解吸附的蛋白顯示在道c。很多不同的血 清蛋白被組合肽庫捕獲，包括少量的肌紅蛋白。采用96.3%肌紅蛋白和3.7%污染血清蛋白重復這個實驗，得 到類似的結果。
實施例2:分離Eco"蛋白和純化的肌紅蛋白首先將純的肌肉肌紅蛋白(Sigma)用可溶的蛋白污 染，所得到的混合物(包含95%的肌紅蛋白(即目的靶蛋白群)和至多5% 的污染血清蛋白)隨后采用連接到小珠的組合六肽庫精制。
將100 mg的肌紅蛋白溶解在400 pL的25 mM磷酸緩沖液 (pHT4)中。向該溶液中加入5%可溶￡. co"蛋白(即污染蛋白)。隨后將 得到的溶液與80 jaL的連接至固相的組合六肽庫混合。在室溫下將懸浮 液輕輕晃動20分鐘。然后，通過離心將上清液(未結合的精制的肌紅蛋 白)與結合至連接到固相的組合六肽庫的蛋白質分開。用磷酸緩沖液洗滌 固相并分析收集的未結合的蛋白。通過SELDIMS(圖2A)和SDS-PAGE(圖2B)進行分析，并與 起初被污染的肌紅蛋白比較(圖2)。在包含被污染的肌紅蛋白的樣品中 幾種蛋白雜質清晰可見(道"a")。它們為不同的分子量并且代表約5% 的總蛋白。大部分的這些污染蛋白來自E co/z提取物，少數其它的為最 初純肌紅蛋白的一部分。圖2A和2B的道"b"顯示了精制的肌紅蛋白。 采用組合肽庫精制后的肌紅蛋白最終純度>99%,因而顯著高于精制處 理前(比較來自SDS-PAGE和SELDI MS分析的道"a"和"b";圖2)。 總回收率估計為約95%。結合到組合肽庫并在精制后完全解吸附的蛋白 顯示在圖2B道"c" (SDS誦PAGE)中。圖2B道"d"顯示最初的來自五. 的提取物，用于與解吸附的雜質進行比較。
實施例3:分離尸.p必勿n;y蛋白和純化的重組人白蛋白
將純化的重組人白蛋白(96%)和尸.paWw^蛋白(4。/o)的溶液 以10 mg/mL的濃度制備在磷酸緩沖鹽水(PBS)中。另外，填充1 mL的 固相組合六肽庫柱，用PBS平衡，并被連接至層析設備，該層析設備包 括泵系統和UV/pH檢測單元，用于在柱的出口記錄這兩種事件。將柱用重組人白蛋白/尸.蛋白溶液連續上樣，以50 cm/小時的線性流速精制。以幾個mL每級分收集流出物來分析固相支持 物除去蛋白雜質的能力，類似于前沿分析(frontalanalysis)。 一旦上樣結 束，PBS溶液被引入以洗滌過量的蛋白。然后通過SDS-PAGE和質譜分 析法來分析收集的級分。結果表明最初的三個級分含有純的白蛋白而剩 余級分逐漸含有越來越多的污染蛋白，這是由于組合小珠柱被飽和。圖 3顯示整個層析圖，以及某些級分的電泳分析。
實施例4:輩巴蛋白群的純化
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本發明的方法適合于從例如包含至少95%靶蛋白群和至多 5 %污染蛋白的2 5升樣品純化靶蛋白群，其中該溶液中污染蛋白以10 -6 M 至約10—12 M的濃度存在并且包含約40可檢測但未確定的各污染蛋白。 向該樣品中加入0.5升包括約30,000,000種肽結合部分的組合肽庫的小 珠，濃度為每ml小珠50 fxMol分析物。
通過參考并入通過參考將本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請 以其整體并入本文，如同每一所有出版物、專利或專利申請被明確和分 別地指出通過參考而并入一樣。
權利要求
1.一種純化靶蛋白群的方法，包括以下步驟(a)使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的樣品與包括至少100種不同結合部分的庫接觸，其中所述結合部分的量足以結合污染蛋白和少量的所述靶蛋白群；(b)使所述污染蛋白和所述少量的靶蛋白群與所述結合部分庫結合；(c)使未結合的靶蛋白群與結合至所述結合部分庫的所述污染蛋白和靶蛋白群分離；以及(d)從所述樣品收集所述未結合的靶蛋白群；由此所收集的靶蛋白群比所述樣品中的所述靶蛋白群更純。
2. 權利要求1的方法，其中所述樣品包含至少98%的所述靶蛋白群 和至多2%的污染蛋白。
3. 權利要求l的方法，其中所述樣品包括發酵液。
4. 權利要求l的方法，其中所述靶蛋白群由單一蛋白種類組成。
5. 權利要求l的方法，其中所述靶蛋白群包括重組蛋白。
6. 權利要求5的方法，其中所述重組蛋白選自酶、激素、生長因子、 受體、疫苗、免疫球蛋白和任何前述蛋白的片段。
7. 權利要求5的方法，其中所述重組蛋白選自血管內皮生長因子 (VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表 皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促紅 細胞生成素(EPO)、骨形態發生蛋白(BMP)、骨衍生的神經營養因子 (BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神經生長因子(NGF)、人生長激素(hGH)、 腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)、干 擾素、白介素(IL)和赫賽汀。
8. 權利要求l的方法，其中所述靶蛋白群包括天然產生的蛋白。
9. 權利要求1的方法，其中所述庫包括至少1,000、至少10,000、 至少100,000、至少1 ，000,000、至少10,000,000或至少100,000,000種不同的結合部分。
10. 權利要求1的方法，其中所述庫為選自種系抗體庫、重組多肽的噬菌體展示庫、染料庫、非組合庫、組合庫及任何前述庫的部分的非 選擇性庫。
11. 權利要求io的方法，其中所述庫包括組合庫的至少一部分。
12. 權利要求11的方法，其中所述組合庫包括選自多肽、多核苷酸、脂類、寡糖和小有機分子的結合部分。
13. 權利要求ll的方法，其中所述組合庫為六肽組合庫。
14. 權利要求l的方法，其中所述結合部分包括生物有機聚合物。
15. 權利要求l的方法，其中所述結合部分選自染料、多肽、抗體、核酸、適體和小有機分子。
16. 權利要求1的方法，其中所述結合部分被結合至一個或多個固體支持物。
17. 權利要求16的方法，其中所述一個或多個固體支持物為小珠或顆粒的集合。
18. 權利要求16的方法，其中所述一個或多個固體支持物選自小珠、纖維、濾器、膜和塊狀物。
19. 權利要求16的方法，其中每個結合部分被連接至不同的固體支持物。
20. 權利要求16的方法，其中多個不同的結合部分被連接至單個固體支持物。
21. 權利要求1的方法，其中所述結合部分庫的量足以結合大部分的所述污染蛋白。
22. 權利要求l的方法，在步驟(a)之前還包括培養產生所述靶蛋白群的細胞的步驟。
23. 權利要求22的方法，其中所述細胞為真核細胞。
24. 權利要求22的方法，其中所述細胞為原核細胞。
25. 權利要求22的方法，其中所述樣品為細胞上清液。
26. 權利要求22的方法，其中所述樣品為細胞提取物。
27. 權利要求l的方法，在步驟(a)之前還包括以下步驟(i) 使包含少于95%所迷靶蛋白群和多于5%所述污染蛋白的在先樣品經歷至少一個純化步驟；以及(ii) 收集包含至少95%所述靶蛋白群和至多5%所述污染蛋白的樣口口 o
28. 權利要求1的方法，還包括以下步驟(e)通過使所收集的靶蛋白群與藥物可接受的載體混合來制備藥物組合物。
29. 權利要求l的方法，其中步驟(a)在懸浮分批工藝中完成。
30. 權利要求l的方法，其中步驟(a)通過使所述樣品穿過裝填有連接至固體支持物的所述結合部分庫的柱來完成。
31. 權利要求1的方法，其中步驟(a)包括流化床工藝。
32. —種藥物組合物，包含(i) 根據權利要求1的方法制備的靶蛋白群；以及(ii) 藥物可接受的載體。
33. 權利要求32的組合物，包含選自酶、激素、生長因子、受體、疫苗、免疫球蛋白和任何前述蛋白的片段的靶蛋白群。
34. 權利要求32的組合物，包含選自血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促紅細胞生成素(EPO)、骨形態發生蛋白(BMP)、骨衍生的神經營養因子(BDNF)、集落刺激因子(CSF)、神經生長因子(NGF)、人生長激素(hGH)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)、干擾素、白介素(IL)和赫賽汀的靶蛋白群。
35. —種純化靶蛋白群的試劑盒，所述試劑盒包括(i) 具有至少100種不同結合部分的結合部分庫；以及(ii) 通過使包含至少95%所述耙蛋白群和至多5%污染蛋白的樣品與所述結合部分庫接觸來純化所述耙蛋白群的使用說明。
36. 權利要求35的試劑盒，還包括(iii) 多個容納用于使所述樣品與所述結合部分庫接觸的孵育緩沖液的容器。
37. 權利要求35的試劑盒，還包括(iii)分級分離柱。
全文摘要
本發明提供了純化靶蛋白群的方法和試劑盒。該方法包括以下步驟使包含至少95％靶蛋白群和至多5％污染蛋白的樣品與具有不同結合部分的結合部分庫接觸，使污染蛋白和少量的靶蛋白群與結合部分庫結合，使未結合的靶蛋白群與結合至結合部分庫的蛋白分離，以及收集未結合的靶蛋白群。所收集的靶蛋白比樣品中的靶蛋白更純。
文檔編號C12P21/06GK101495645SQ200680017901
公開日2009年7月29日 申請日期2006年3月22日 優先權日2005年3月23日
發明者E·博謝蒂, L·羅馬斯 申請人:生物-拉德實驗室公司