在酵母中從d-葡萄糖生產抗壞血酸的制作方法

專利名稱：：在酵母中從d-葡萄糖生產抗壞血酸的制作方法
技術領域：
：本發明一般地涉及抗壞血酸生產的領域。更具體地，它涉及從酵母，包括重組酵母生產L-抗壞血酸的方法。
背景技術：
：L-抗壞血酸(維生素C)是一種強的水溶性抗氧化劑，其對于人的所有組織類型的生長與維持是極其重要的。抗壞血酸的一個重要作用是它參與膠原的產生，膠原是結締組織，肌肉，腱，骨，牙齒與皮膚的基本細胞組分。膠原也是血管，擦傷和骨折的修復所需要的。抗壞血酸有助于調節血壓，促進降低膽固醇含量，而且有助于從動脈壁除去膽固醇沉積。抗壞血酸也有助于葉酸的代謝，調節鐵的吸收，而且是氨基酸L-酪氨酸與L-苯丙氨酸轉變成去曱腎上腺素所需要的。色氨酸轉變成五羥色胺，其是負責睡眠，疼痛控制和健康的神經激素，也需要抗壞血酸的充足供應。缺乏L-抗壞血酸會削弱膠原的產生，而且導致關節疼痛，貧血，神經緊張和生長緩慢。其它的作用是降低的免疫反應和增加的感染易感性。最極端的抗壞血酸缺乏形式是壞血病，一種跡象為關節腫脹，齒齦出血，和皮膚表面下的毛細血管出血的疾病。如果不進行治療，壞血病是致命的。盡管腸很容易吸收抗壞血酸，但是它在攝取2到4個小時內排泄到尿中。因此，它不能在體內貯存。所有的高等植物和多數高等動物，但不是人，蝙蝠，一些鳥類和多種魚類的肝臟或腎臟都產生L-抗壞血酸。因此，人必須從足夠的飲食來源或增補來獲得足夠量的抗壞血酸，以保持最佳的健康狀態。抗壞血酸的食品來源包括柑桔類水果，馬鈴薯，胡椒，綠葉蔬菜，番茄和漿果。增補形式的抗壞血酸如丸劑，片劑，粉末，嚢劑和糖漿也是市場上可買到的。L-抗壞血酸由美國食品與藥品管理局批準用作營養增補劑和化學防腐劑，而且列在公認為安全的物質的FDA目錄上。L-抗壞血酸可用于軟飲料中，作為調味成分的抗氧化劑，用于肉類和含肉產品中，用于熟化和酸洗，用于面粉中以提高烘焙質量，用于啤酒中作為穩定劑，用于脂肪和油類中作為抗氧化劑，以及用于各種各樣的食品中以便抗壞血酸富集。L-抗壞血酸也可用于去斑劑，理發產品，塑料制造，攝影和水處理中。產生抗壞血酸的生物合成途徑的酶還沒有鑒定完全。目前了解的植物中生理途徑如圖1所示。已經報道了植物中抗壞血酸合成的兩個分立的途徑。在一個途徑中，L-抗壞血酸從D-葡萄糖經由L-山梨糖酮合成(LoewusM，W.等，1990，Plant.Physiol.94，1492-1495)。目前的證據表明，主要的生理途徑是從D-葡萄糖經由L-半乳糖和L-半乳糖酸-l，4-內酯到L-抗壞血酸(WheelerG.L.等1998，Nature,393，365-369)。最后兩個步驟由L-半乳糖脫氫酶和L-半乳糖酸-l，4-內酯脫氬酶催化。已經分離并表征了最后一個酶，而且已經克隆并測序了來自甘藍(5環s/a0/e潔ea)的基因(OstergaardJ.等1997，J.Biol.Chem.，272，30009—30016)。為了用作營養增補劑，可以從天然來源分離抗壞血酸或如Reichstein方法的改變，通過氧化L-山梨糖化學合成抗壞血酸(美國專利2，265，121)。仍然需要通過方便的過程生產抗壞血酸的方法。合成應該是對映選擇性的，因為只有抗壞血酸的L-對映體是具有生物學活性的。一種可能的方法是從微生物生產L-抗壞血酸。微生物可以是易于以工業規模生長的。盡管過去已經報道了從微生物和真菌生產L-抗壞血酸，但是最近的證據證明發現的是L-抗壞血酸類似物，而不是L-抗壞血酸(HuhW.K.等1998，Mol.MicroMoi.30，4，895-903,HancockR.D.等，2000，FEMSMicrobiol.Let.186，245—250，DumbravaV.A.等1987，BBA926，331—338,NickJ.A.等，1986，PlantScience,46，181-187)。已經報道了在酵母(假絲酵母和糖酵母屬的種)中生產赤型抗壞血酸(HuhW.K.等，1994，Eur.J.Biochem，225，1073-1079，HuhW.K.等，1998，Mol.Microbiol.30，4，895-903)。在這些酵母中，生理途徑建議從D-葡萄糖經由D-阿拉伯糖和D-阿拉伯糖酸-1，4-內酯到赤型抗壞血酸(KimS.T.等，1996，BBA，1297，1-8)。已經表征了來自白色假絲酵母以及啤酒糖酵母的酶D-阿拉伯糖脫氫酶和D-阿拉伯糖酸-1,4-內酯氧化酶。值得注意的是，L-半乳糖和L-半乳糖酸-l，4-內酯是這些體外活性的底物。已經通過給野生型假絲酵母細胞喂養L-半乳糖酸-l，4-內酯，獲得了體內L-抗壞血酸的生產(國際專利申請WO85/01745)。最近，已經表明當與L-半乳糖，L-半乳糖酸-l，4-內酯或L-古洛糖酸-l,4-內酯一起孵育時，野生型啤酒糖酵母細胞內積累了L-抗壞血酸(Hancock等，2000，FEMSMicrobiol.Lett.186，245-250，SpickettCM.等，2000，FreeRad.Biol.Med.28，183—192)。與L-半乳糖酸-1,4-內酯一起孵育的野生型假絲酵母細胞在培養基中積累L-抗壞血酸，表明該酵母具有釋放細胞內積累的L-抗壞血酸的生物學機制；實際上，L-抗壞血酸是一種復雜分子，它在培養基中的積累與簡單擴散過程不相關，而應該取決于易化或主動轉運是合理的。在高等真核生物(哺乳動物)細胞中鑒定和表征L-抗壞血酸轉運分子，支持了該結論(DaruwalaR.等，1999,FEBSLetters.460，480-484)。但是，L-抗壞血酸轉運分子在酵母屬當中還沒有描述。盡管如此，雖然生長于含有L-半乳糖酸-l，4-內酯的培養基中的假絲酵母細胞在培養基中積累L-抗壞血酸，但是，令人驚訝地，從未描述過野生型啤酒糖酵母細胞在培養基中積累L-抗壞血酸。一種用于大規模生產抗壞血酸的合乎需要的方法包括使用基因工程微生物(即，重組微生物)。原核與真核微生物現在都可以很容易而且成功地用于生產異源蛋白質以及用于生產異源代謝產物。原核生物當中，經常使用大腸桿菌與枯草桿菌。真核生物當中，經常使用啤酒糖酵母與乳酸克魯維酵母。0stergaard等在啤酒糖酵母中克隆了編碼來自花椰菜的L-半乳糖酸-l，4-內酯脫氬酶的基因(J.Biol.Chem.，1997，272，48，30009-30016)。雖然，在體外，作者在酵母細胞提取物中發現了L-半乳糖酸-1，4-內酯脫氫酶活性(細胞色素C測定，參見0stergaard等)，但是在體內證明沒有產生L-抗壞血酸。Berry等，國際專利申請W099/64618論述了抗壞血酸的植物生物合成途徑的潛在應用；特別強調了催化GDP-D-甘露糖轉變成GDPL-半乳糖的活性。但是，催化該步驟的酶的表征還沒有詳細描述。超表達的大腸桿菌同源物結果是無活性的。Smirnoff等，W099/33995，論述了使用L-半乳糖脫氫酶生產抗壞血酸。酶純化自豌豆苗，并確定了其N-末端蛋白質序列。Roland等，美閨專利4，595，659和4，916，068，論述了使用非重組假絲酵母菌株使L-半乳糖酸底物轉變成L-抗壞血酸。Roland等描述了負責的酶為L-半乳糖酸-l，4-內酯氧化酶。Ku歸r，W000/34502論述了在布藍克氏假絲酵母和迪門納隱球酵母中生產L-抗壞血酸，這些酵母在生產中能使用2-酮基-L-古洛糖酸作為唯一的碳源。Kumar明確地排除了通過涉及L-半乳糖酸內酯氧化酶的途徑或通過L-半乳糖酸前體的轉變來從酵母進行生產。之前，我們已經報道了通過用，尤其是L-半乳糖脫氫酶(LGDH)，D-阿拉伯糖酸-l，4-內酯氧化酶(ALO)或兩者轉化的并生長在含有一種或多種L-半乳糖酸-l，4-內酯，L-古洛糖酸-1，4-內酯或L-半乳糖的培養基中的啤酒糖酵母來生產L-抗壞血酸(美國專利6,630,330)。仍然需要通過方便的發酵工藝生產抗壞血酸的方法。從D-葡萄糖開始生產L-抗壞血酸的方法也是合乎需要的。　
發明內容在一個實施方案中，本發明涉及生產L-抗壞血酸的方法，包括a)獲得用編碼甘露糖差向異構酶(ME)的編碼區功能性轉化的重組酵母；b)在含有D-葡萄糖的培養基中培養重組酵母，從而形成L-抗壞血酸,和c)分離L-抗壞血酸。在另一個實施方案中，本發明涉及用編碼甘露糖差向異構酶(ME)的編碼區功能性轉化的重組酵母。在該方法和重組酵母的更進一步的實施方案中，酵母可以用編碼肌醇磷酸酶(MIP)的編碼區進一步地功能性轉化。本發明提供了通過方便的發酵工藝從D-葡萄糖生產L-抗壞血酸的方法。圖1顯示了從D-葡萄糖合成L-抗壞血酸的主要植物途徑。圖2顯示了在缺乏(圖2A)和存在(圖2B-2C)氧化脅迫時，BY4742和YML007w酵母在660nm處的光密度。Yaplp激活了響應氧化脅迫所需的基因；缺失該基因導致所觀察到的表型。圖3顯示了在存在氧化脅迫和添加抗壞血酸到培養基中時，BY4742wt與YML007w酵母在660nm處的光密度(圖3A-3B)。圖4顯示了存在氧化脅迫時，BY4742wt;表達ALO，LDGH與ME的YML007w;和表達ALO，LDGH，ME與MIP的YML007w酵母在660nm處的光密度(圖4A-4B)。圖5顯示了在缺乏(圖5A)和存在(2mM的仏02)氧化脅迫時，野生型GRFc;表達ALO，LDGH與ME的GRF18U;和表達ALO，LDGH，ME與MIP的GRF18U酵母菌林在660nm處的光密度。示例性實施方案的描述在一個實施方案中，本發明涉及生產L-抗壞血酸的方法，包括a)獲得用編碼甘露糖差向異構酶(ME)的編碼區功能性轉化的重組酵母；b)在含有D-葡萄糖的培養基中培養重組酵母，從而形成L-抗壞血酸，和c)分離L-抗壞血酸。"重組"酵母是這樣的酵母，其含有酵母中非天然存在的核酸序列或內源核酸序列的另外的單拷貝或多個拷貝，其中核酸序列通過人的行為被引入到酵母或其祖細胞中。重組DNA技術是公知的，如Sambrook等的分子遺傳學實驗手冊，美國冷泉港實驗室出版，其提施方案中，同源和/或異源基因的編碼區分離自具有該基因的生物體。所述生物體可以是細菌，原核生物，真核生物，微生物，真菌，植物或動物。的細胞中提取。此后，編碼區可通過任何適當的技術分離。在一種已知的技術中，編碼區是通過以下步驟分離的首先，制備基因組DM文庫或cDNA文庫，其次，在基因組DNA文庫或cDNA文庫中鑒定該編碼區，如通過用標記的核苷酸探針探測該文庫，該標記的核苷酸探針選擇為或假設為與該編碼區至少部分地同源，確定該編碼區的表達是否賦予含有該編碼區的文庫微生物可檢測的表型，或通過PCR擴增所需的序列。用于分離編碼區的其它已知的技術也可以使用。待轉化的酵母可以選自酵母的任何已知的屬和種。酵母是N.J.W.Rreger-vanRij,"TheYeasts",Vol.1ofBiologyofYeasts,Ch.2，A.H.Rose和J.S.Harrison,Eds.AcademicPress,London,1987描述的。在一個實施方案中，酵母屬于糖酵母屬(5^ccAsTO/z7/ces)，接合酵母屬(2ygosacc力sro邁7ces)，假絲酵母屬(Ca/^/cTa)，漢遜酵母屬(&/^e/m/a)，克魯維酵母屬(i7"7rero邁/ce51)，德巴利酵母屬("e6arc邁/ce》，拿遜酵母屬(^&o/n'a)，油脂酵母U&o/z77ce力，；求擬酵母屬(r。rw7o;^i力，克勒克酵母屬(r^ecirera),畢赤氏酵母屬(尸/c力2'a)，裂殖酵母屬(Sc力/zosaccAar(M7ces),三角酵母屬(7>/go/2o;s/s),酒香酵母屬(Sre〃細/z/戸力，隱球酵母屬(Cr/;^co歸力，絲孢屬(7y/c力os;oro")，短梗霉屬C4"reo6as/cT/M)，油脂酵母屬(Z/;o邁/cw),法夫酵母屬(/^a/Y7a),紅酵母屬0Aoc/otari//a)，耶羅威亞酵母屬(r"/^w7'a)或許旺酵母屬(Sc力w/7;7/咖/ce力，等等。在進一步的實施方案中，酵母可以是酵母屬，接合酵母屬或克魯維酵母屬。仍然在進一步的實施方案中，酵母可以是哞酒糖酵母(&cereWWae)，乳酸克魯維酵母7sc〃》或拜耳接合酵母種(Z6a/h7)。仍然在更進一步的實施方案中，酵母是啤酒糖酵母菌林GRF18U，W3031B,BY4742(船ra，'力/s》/eW,EuroScarf保藏號Y10000)或YML007w(BY4742AYapl)(船ra/7eW,""J,/s/]EuroScarf保藏號Y10569;拜耳接合酵母ATCC60483;或乳酸克魯維酵母PM6-7A。重組酵母用編碼甘露糖差向異構酶(D-甘露糖L-半乳糖差向異構酶；ME)的編碼區功能性轉化。ME是任何GDP-甘露糖-3，5-差向異構酶(5.1.3.18)，其指的是催化GDP-甘露糖轉變成GDP-L-半乳糖的酶。示例性的ME以SEQIDNO:1提供。在一個實施方案中，ME與SEQIDNO:1具有至少大約95%的同一性。在更進一步的實施方案中，ME與SEQIDNO:l具有至少大約98%的同一性。"同一性"可以通過使用CiustalW程序和它的缺省值進行的序列比對來確定，即DNA缺口打開罰分-15.0，DNA缺口延伸罰分-6.66，DNA矩陣-同一性，蛋白質缺口打開罰分-10.0，蛋白質缺口延伸罰分-O.2,蛋白質矩陣-Gonnet。同一性可以才艮據ClustalW文檔編制所描述的方法計算對于待比對的每對序列計算配對分數。這些分數呈現于結果的表格中。計算配對分數，除以所比較的殘基的數目(缺口位置除外)，作為最佳序列比對中的同一性數字。這些分數最初都是作為同一性百分比分數計算的，然后通過除以100并從1.0中減去以得到每個位點的差異數而換算成距離。我們沒有校正這些初始距離中的多個置換。因為配對分數的計算與所選擇的矩陣和缺口無關，所以對于特定的序列對它將始終是相同的值。仍然在更進一步的實施方案中，ME具有SEQIDN0:1。在一個實施方案中，重組酵母用編碼肌醇磷酸酶(MIP)的編碼區進一步地功能性轉化。MIP是任何肌醇磷酸酶(3.1.3.25),其指的是催化L-半乳糖-lP轉變成L-半乳糖的酶。例如，L-半乳糖-l-磷酸酶也催化L-半乳糖-IP轉變成L-半乳糖并且是根據這個定義的MIP。在一個實施方案中，MIP具有以SEQIDN0:2提供的序列。在一個實施方案中，MIP與SEQIDNO:2具有至少大約95%的同一性。在更進一步的實施方案中，MIP與SEQIDNO:2具有至少大約98。/。的同一性。仍然在更進一步的實施方案中，MIP具有SEQIDNO:2。在一個實施方案中，重組酵母用編碼選自L-半乳糖脫氫酶(LGDH)，L-半乳糖酸-l，4-內酯脫氫酶(AGD)，D-阿拉伯糖脫氫酶(ARA)，D-阿拉伯糖酸-l,4-內酯氧化酶(AL0)或L-古洛糖酸-l，4-內酯氧化酶(GL0)的酶的編碼區進一步地轉化。本發明不局限于已知用于在植物，酵母或其它的生物體中生產L-抗壞血酸中間體或L-抗壞血酸的途徑的酶。在另一個實施方案中，本發明涉及用ME或ME和MIP二者轉化的微生物，其是抗脅迫的或強健的。仍然在另一個實施方案中，該微生物可以用LGDH，AL0，ME或LGDH，AL0,ME和MIP轉化。該孩t生物可以是任何微生物，例如，細菌，酵母或另一種真菌(如絲狀真菌)，培養的動物細胞或培養的植物細胞。在一個實施方案中，該微生物是酵母。普遍認為脅迫會導致干擾微生物(酵母)的生物加工。脅迫可以是細胞(內部或胞內)來源的，環境(外部或胞外)來源的，或二者。內部來源的脅迫的經典例子包括蛋白質和代謝物的超量產生(以重量/體積計)和蛋白質與代謝物的超量生產率(以每單位時間的重量/體積計)，等等。外部來源的脅迫的例子包括高滲透性，高鹽度，氧化脅迫，高溫或低溫，高pH值或低pH值，有機酸的存在，有毒化合物的存在，以及常量和微量營養物饑餓，等等。脅迫一般是由脅迫物(或刺激)引起的。脅迫物是對細胞的消極影響，與缺乏脅迫物時所需要的相比其需要該細胞付出更大的努力來保持平衡。這種更大的努力會導致較高或較低的代謝活性，較低的生長率，較低的存活力，或較低的生產率，等等。脅迫物是物理，化學或生物性質的物質，其體現出對于任何給定生活型通常的胞內或胞外條件的改變。因此，盡管特定條件(例如，65。C的溫度)可能對通常在37。C生存的某個物種是脅迫的(或甚至致死的)，但是該溫度對嗜熱生物卻是最佳的。不考慮來源，脅迫可以具有不同的作用，包括較高或較低的代謝活性，較低的生長率，較低的存活力，或較低的生產率，等等。細胞或分子水平的作用可包括損害DNA，損害脂質，損害蛋白質，損害膜，損害其它分子和大分子，產生活性氧類別(ROS)，誘導凋亡(細胞程序死亡)，細胞壞死，細胞裂解，破壞細胞的完整性，以及削弱細胞存活力，等等。R0S可以通過胞內和胞外刺激產生。大多數內源性R0S是通過從線粒體電子傳遞鏈滲漏這些類別而產生的。此外，胞質酶系統，包括NADPH氧化酶，以及過氧化物酶體代謝的副產物也是R0S的內源性來源。R0S的產生也可以通過暴露于許多外源性物質和事件包括電離輻射(IR),紫外線，化療藥，環境毒素和過熱而發生。由胞內R0S引起的氧化性損傷可導致DNA堿基修飾，單鏈和雙鏈斷裂，以及形成脫嘌呤/脫嘧啶損傷，其中許多是有毒的和/或致突變的。因此，所產生的DNA損傷也可能直接導致有害的生物學后果(Tiffany,B.等，NucleicAcidsResearch,2004，Vol.32，No.12，3712-3723)。在工業過程中，其中生物體用作生產的手段，對生物體的脅迫一般導致較低或零產物生產，較低或零生產率，較低或零產物產量，或其中的二者或多者。因此脅迫是非常不受歡迎的現象，用于最小化脅迫的技術將是有用的。如用于該實施方案中的，"生產"指的是通過微生物制備一種或多種產物的過程。(微生物本身可以是產物，或通過微生物的代謝過程產生或修飾的化合物可以是產物，例如蛋白質，有機酸，維生素或抗菌素)。該過程開始之后，可以通過確定每重量或體積的維持微生物的生長和生存的培養基，或每重量或體積的微生物的生物質產生的產物的重量，隨時對生產進行定量。"生產率"指的是如上述在規定的一段時間內定量的生產的量(例如，如每小時g/L，每周mg/L,或每小時g/g的生物質的速率)。"產量"指的是根據轉變成產物的底物的量產生的產物的量。菌林的脅迫耐性，脅迫抗性，或強健性，如這里使用的，指的是樣t生物在生產過程中顯示較好的工業性能。這可以表現為下述之一較好的抵抗脅迫的能力，減少脅迫對生物體或生產率的消極影響，增加生長率或增加細胞密度，降低生產率抑制，減少細胞死亡率(增加存活力)，降低生長抑制，或防止由于脅迫條件所致的細胞失活。我們已經觀察到，與未用ME或ME和MIP二者轉化的酵母相比，用ME或ME和MIP二者轉化的酵母具有更大的脅迫抗性或強健性。這種抗性可以對抗許多脅迫物。這種更大的脅迫抗性可以表現為下列情況中一種或多種在培養中表達ME或ME+MIP的微生物更快的生長速率，在培養中表達ME或ME+MIP的微生物更大的細胞密度，在培養中表達ME或ME+MIP的微生物更大的存活率，在培養中表達ME或ME+MIP的微生物更大的生產能力。細胞存活率的量度是存活力(一般以相對于細胞總數的活細胞分數表示)。存活力可以確定為給定細胞在適當的瓊脂平板上形成集落的能力(繁殖能力)。而且如果細胞顯示代謝活性或如果它們的細胞膜是完整的，則可以認為它們是能存活的。應當理解，微生物的獨特群體可以描述為能存活的，而且從一種到另一種的直接推論是不可能的。例如，仍然具有代謝活性的細胞可能不再是可繁殖的(集落形成)。因此，可以應用不同的方法確定培養物的存活力，而得出不同的結果。典型的方法包括在瓊脂平板上鋪板，以確定集落形成單位的數目，用錐蟲藍染色并在顯微鏡下計數，藉此死細胞變藍，而活細胞由于完整的膜而著色較少。其它的方法包括流式細胞術，藉此細胞用不同的化合物包括碘化丙錠(完好的膜防止進入)，溴化乙錠(代謝活性細胞排斥染料)等等進行染色。雖然不想受理論的束縛，但是我們認為通過描述的實施方案實現的較大的脅迫抗性源于能提供較大的氧化脅迫抗性的微生物中抗氧化劑水平(具體地，L-抗壞血酸)的增加。我們認為這種較大的脅迫抗性使表達ME或ME+MIP的微生物(本身或用另外的編碼區轉化的)，特別適于在工業發酵中生產代謝產物。在另一個實施方案中，在發酵期間微生物如酵母的生產，生產率，或由其生產的產物的產量通過用編碼甘露糖差向異構酶(ME)的編碼區功能性地轉化該微生物而增加。在另一個實施方案中，在發酵期間，微生物如酵母的生活力，如由形成集落的能力，代謝活性或膜完整性所定義的，通過用編碼甘露糖差向異構酶(ME)的編碼區功能性轉化該微生物而增加。總之，本發明可以降低或消除一般在微生物生產過程期間遇到的脅迫的消極影響。也就是說，可以通過表達上述的酶確立或增加微生物的L-抗壞血酸含量，而增加微生物的生產，生產率，產量或存活力。因此，在孩i生物中表達ME，或ME以及下列酶MIP，AL0，或LGDH中的一種或多種是特別有用的，條件是該微生物將在滲透脅迫的條件下培養。滲透脅迫是一種狀況，其中微生物遇到不同于最佳滲透性的滲透性，該最佳滲透性對于相應的孩吏生物被限定為250mOsmol或更高，或特別地為500mOsmol或更高或者750mOsmol或更高。對于啤酒糖酵母，滲透性大于500mOsmol，或大于750m0smol，或大于1000mOsmol的狀況是脅迫的。此外，在微生物中表達ME，或ME以及下列酶MIP，AL0，或LGDH中的一種或多種是特別有用的，條件是該微生物將在pH脅迫的條件下培養。pH脅迫是這樣一種狀況，其中微生物遇到不同于最佳pH值的pH值，該最佳pH值為適于相應的微生物生產的pH值，其為超過1個，或超過2個，或超過3個pH單位。對于嘩酒糖酵母，用于進行生物加工的最佳pH值一般為5。小于4的pH，或小于3的pH，或小于2的pH，或大于6的pH，或大于7的pH,或大于8的pH是脅迫的，而且在本發明的上下文中，如果酵母在這樣的pH條件下用作生產宿主，則在酵母如啤酒糖酵母中表達所述的基因看來是有用的。在微生物中表達ME,或ME以及下列酶MIP，ALO,或LGDH中的一種或多種也是特別有用的，條件是該微生物將在溫度脅迫的條件下培養。溫度脅迫是這樣一種狀況，其中微生物遇到不同于最佳溫度值的培養溫度，該最佳溫度值為適于相應的微生物生長或生產的溫度值，所述的培養溫度與該最佳溫度值相差2'C或更高，相差5'C或更高，及至相差10。C或更高。對于啤酒糖酵母，32。C或32。C以上，35。C或35。C以上，40。C或40。C以上的溫度可能是脅迫的。對于細菌大腸桿菌，38。C或38。C以上，或4rC或41。C以上，或46。C或46。C以上的溫度可能是脅迫的。此外，在微生物中表達ME，或ME以及下列酶MIP,ALO，或LGDH中的一種或多種是特別有用的，條件是該微生物將在氧化脅迫的條件下培養。氧化脅迫是用于描述由活性氧類別(ROS)引起的細胞中氧化性損傷的穩態水平的通稱。這種損傷會影響特定分子或整個生物體。活性氧類別，如自由基和過氧化物，表示一類分子，其來源于氧的代謝而且固有地存在于所有的需氧生物體中。氧化脅迫源于促氧化劑的形成與中和之間的不平衡。動物細胞，以及其它例子中，在標準培養條件期間可暴露于顯著的氧化脅迫。因此，在動物細胞中表達ME,或ME和下列酶MIP，ALO或LGDH中的一種或多種看來是特別有用的。在微生物中表達ME,或ME以及下列酶MIP，ALO，或LGDH中的一種或多種也是特別有用的，條件是培養的微生物由于代謝產物或蛋白質的超量產生而受到脅迫。這種脅迫狀況的標志可以是與本領域已知的UPR(解折疊蛋白應答)相關的基因的增量調節。編碼ME，MIP或另一種酶的編碼區可以從4壬何來源分離。在一個實施方案中，ME的編石馬區分離自4以南芥(Jra6/do/7512、f力a7/a/7a)。在一個實施方案中，MIP的編碼區分離自擬南芥。應當注意到，編碼區"分離"自生物體，條件是它編碼的蛋白質序列與從該生物體的細胞純化的相同蛋白質的序列基本上相同。例如，在上述的特定實施方案中，ME編碼區或MIP編碼區不必分離自擬南芥的核酸或通過從擬南芥提取的核酸的一個或多個世代的復制來產生。優選地，編碼所需酶的編碼區以這樣的方式摻入酵母中，該方式為所需的酶在酵母中產生并基本上是功能性的。這種酵母這里可被稱為"功能性轉化的"。區，它可以準備用于轉化到酵母中，并在酵母中表達。至少，這涉及將編碼區插入到載體中，并與存在于栽體上的且在酵母中是有活性的啟動子可操作地連接。任何載體(整合型，染色體的或附加型)都可以使用。在靶宿主中有活性的任何啟動子(同源的或異源的；組成型，誘導型，或阻抑型)都可以使用。這種插入可能涉及將限制性內切核酸酶用于在所需位點"打開"載體，其中與啟動子可操作地連接是可能的，接著將編碼區連接到所需位點中。如果需要，在插入到載體中之前，編碼區可準備用于靶生物體。這可能涉及改變編碼區中使用的密碼子以更加充分地與靶生物體使用的密碼子匹配；改變編碼區中可能削弱該編碼區的轉錄或翻譯或該編碼區的mRNA轉錄物的穩定性的序列；或添加或除去編碼信號肽的部分(指導蛋白質到特定位置(例如，細胞器，細胞或細胞器的膜，或胞外分泌)的由編碼區編碼的蛋白質的區域)，以及本領域中已知的其它可能的制備。不考慮是否修飾編碼區，當將編碼區插入到載體中時，它與在酵母中有活性的啟動子可操作地連接。啟動子，如已知的，是能夠指導附近的編碼區轉錄的DM序列。如已經描述的，啟動子可以是組成型的，誘導型的或阻抑型的。組成型啟動子連續地指導附近的編碼區轉錄。誘導型啟動子可以通過添加合適的誘導性分子到培養基中被誘導，合適的誘導性分子可以根據啟動子的特征來確定。阻抑型啟動子可以通過添加合適的阻制性分子到培養基中被阻抑，合適的抑制性分子可以根據啟動子的特征來確定。在一個實施方案中，啟動子是組成型的。在更進一步的實施方案中，組成型啟動子是啤酒糖酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)啟動子。含有與啟動子可操作地連接的編碼區的載體可以是質粒，粘粒，或酵母人工染色體，以及本領域已知的適用于酵母的其它載體。除了與啟動子可操作地連接的編碼區，載體還可以包含其它的遺傳元件。例如，如果不期望載體整合到酵母基因組中，則該載體可以包含復制起點，其允許載體傳遞給含有該載體的酵母的子代細胞。如果需要載體整合到酵母基因組中，則該載體可包含與酵母基因組中發現的序列同源的序列，而且還可以包含可促進整合的編碼區。為了確定哪些酵母細胞被轉化，載體可包含選擇標記或篩選標記，其賦予酵母區別于未轉化酵母的表型，例如，它能在含有對未轉化酵母致命的抗生素的培養基上存活，或它可將培養基的某種成分代謝成未轉化酵母不能產生的產物，以及其它的表型。此外，載體可包含其它的遺傳元件，如限制性核酸內切酶位點以及通常在載體中發現的其它元件。載體制備以后，其具有與啟動子可操作地連接的編碼區，可用該載體轉化酵母(即，可以將該載體引入到酵母群體的至少一個細胞中)。用于酵母轉化的技術沿用已久，包括電穿孔法，微粒轟擊，以及LiAc/ssDNA/PEG法，等等。被轉化的酵母細胞，然后可以使用載體上的篩選或選擇標記進行檢測。應當注意，短語"轉化酵母"具有與如上面所定義的"重組酵母"基本相同的含義。轉化酵母可以是在轉化技術中接受載體的酵母，或可以是這種酵母的子代。已經獲得重組酵母以后，可以在培養基中培養酵母。其中能夠培養酵母的培養基可以是本領域已知的適于這種用途的任何培養基。培養技術和培養基是本領域公知的。在一個實施方案中，可以通過在合適的容器中的水性發酵進行培養。用于酵母發酵的典型的容器的例子包括搖瓶或生物反應器。培養基可以包含D-葡萄糖。它可以進一步地包含酵母生長所需的任何其它的成分。D-葡萄糖可能是酵母的生長所需要的成分但不一定是。培養基可以包含除D-葡萄糖以外的碳源，如蔗糖，果糖，乳糖，D-半乳糖，或植物性物質的水解產物，等等。在一個實施方案中，培養基還可以包含氮源如有機或無機分子。在另外的實施方案中，培養基還可以包含組分如氨基酸；嘌呤；嘧啶；玉米漿；酵母提取物；蛋白水解物；水溶性維生素如復合維生素B維生素；或無機鹽如Ca，Mg，Na，K,Fe，Ni,Co，Cu，Mn，Mo或Zn的氯化物，鹽酸鹽，磷酸鹽或硫酸鹽，等等。還可以包含本領域普通技術人員已知的可用于酵母培養或發酵的其它的組分。培養基可以是緩沖的，但不是必需的。在發酵的過程中，D-葡萄糖可以被酵母內在化并通過許多步驟，轉變成L-抗壞血酸。這樣產生的L-抗壞血酸可以在酵母內部聚集，或可以由酵母分泌到培養基中。優選的培養基含有D-葡萄糖和YNB。在已經培養足夠長的時間以在酵母，培養基或二者中產生所需濃度的L-抗壞血酸之后，可以分離L-抗壞血酸。如這里提到抗壞血酸時使用的"分離的"指的是通過L-抗壞血酸與酵母或培養基的至少一種非L-抗壞血酸成分的分離而使之處于更純的狀態。優選地，分離的L-抗壞血酸的純度為至少大約95%，更優選純度為至少大約99%。為了從酵母中分離L-抗壞血酸，在酵母從培養基中分離之后，分離的第一個步驟可以是通過化學或酶促處理，用玻璃珠處理，超聲處理，冷凍/融化循環，或其它已知的技術裂解酵母。可以通過合適的技術，如離心，過濾，微過濾，超濾，納過濾，液-液提取法，結晶，用核酸酶或蛋白酶進行酶促處理或色譜法等等，從酵母裂解物的膜，蛋白質和核酸級分中純化L-抗壞血酸。為了分離培養基中積累的L-抗壞血酸，分離可以包括從培養基中純化抗壞血酸。可通過已知的技術，如利用離子交換樹脂，活性碳，微過濾，超濾，納過濾，液-液提取法，結晶或色譜法等等進行純化。L-抗壞血酸可以從酵母和培養基中分離。如果在培養步驟期間酵母在培養基中積累L-抗壞血酸，優選使L-抗壞血酸的濃度穩定或允許其增加。提供以下定義以便幫助本領域技術人員理解本發明的詳細描述術語"高于背景水平的抗壞血酸的積累"指的是抗壞血酸的積累高于如使用這里所述的方法確定的不可檢測的水平。如這里使用的"抗壞血酸"以及"維生素C"指的是L-抗壞血酸。"抗壞血酸前體"是一種能由本發明的酵母直接或通過一個或多個中間產物轉變成L-抗壞血酸的化合物。"擴增"指的是無論通過什么方式，增加所需核酸分子的拷貝數或提高酶的活性。"密碼子"指的是確定特定氨基酸的三個核苷酸的序列。"DNA連接酶"指的是共價連接兩段雙鏈DNA的酶。"電穿孔法"指的是一種將外源DM引入到細胞中的方法，其采用短暫的，高壓DC電荷來穿透宿主細胞，導致它們吸收染色體外的DNA。"核酸內切酶"指的是在內部位置水解雙鏈DNA的酶。酶1.1.3.37，D-阿拉伯糖酸-l，4-內酯氧化酶，指的是催化D-阿拉伯糖酸-l，4-內酯+02轉變成D-赤型抗壞血酸+&02的蛋白質。由于寬的底物范圍，同樣的酶能催化卜半乳糖酸-1，4-內酯+02轉變成L-抗壞血酸+11202。該同樣的酶錯誤地被稱為L-半乳糖酸-l，4-內酯氧化酶(酶1.1.3.24)(參見Huh，W.K.等，1998，Mol.Microbiol.30，4，895-903)。酶1.3.2.3,L-半乳糖酸-1，4-內酯脫氫酶，指的是催化L-半乳糖酸-1，4-內酯+2高鐵細胞色素C轉變成L-抗壞血酸+2亞鐵細胞色素C的蛋白質。酶1.1.3.8，L-古洛糖酸-1，4-內酯氧化酶，指的是催化L-古洛糖酸-l，4-內酯氧化成L-木-己酮糖酸內酯的蛋白質，L-木-己酮糖酸內酯自發地異構化成L-抗壞血酸。酶GDP-甘露糖-3，5-差向異構酶(5.1.3.18)，指的是催化GDP-甘露糖轉變成GDP-L-半乳糖的蛋白質。酶肌醇磷酸酶(3.1.3.23)，指的是催化L-半乳糖-IP轉變成L-半乳糖的蛋白質。其它值得關注的酶，和它們的分類號，如下己糖激酶葡萄糖-6-P異構酶甘露糖-6-P異構酶磷酸甘露糖變位酶甘露糖-l-P烏苷酰轉移酶GDP-甘露糖3，5-差向異構酶L-半乳糖-脫氫酶L-半乳糖酸-l，4-內酯脫氫酶葡糖磷酸變位酶UTP-葡萄糖-l-P尿苷酰轉移酶UDP-D-葡萄糖脫氫酶UDP-葡糖醛酸4-差向異構酶葡糖醛酸-l-P尿苦酰轉移酶D-葡糖醛酸激酶D-葡糖醛酸還原酶醛糖內酯酶L-古洛糖酸-l，4-內酯氧化酶糖醛酸內酯酶葡糖醛酸內酯還原酶活性L-半乳糖酸-1,4-內酯3-差向異構i半乳糖醛酸酯-l-P尿苷酰轉移酶半乳糖醛i2.7.1.15.3.1.95.3.1.85.4.2.82.7.7.225.1.3.183.1.3.23*)1.3.2.32.7.1.15.4.2.22.7.7.91.1.1.225.1.3.62.7.7.442.7.1.431.1.1.193.1.1.171.1.3.83.1.1.191.1.1.20*)*)2.7.1.44己糖醛酸(D-半乳糖醛酸)還原酶*)月幾醇l-P合酶5.5.1.4肌醇l-P單磷酸酶3.1.3.25肌醇加氧酶1.13.99.1D-半乳糖激酶2.7.1.6UTP-己糖l-P尿苷酰轉移酶2.7.7.10UDP-葡萄糖4-差向異構酶5.1.3.2Sue合酶2.4.1.13果糖激酶2.7.1.4*)分類號在數據庫中沒有得到。術語"表達，，指的是基因轉錄以產生對應的mRNA,并翻譯該mRNA以產生對應的基因產物，即肽，多肽或蛋白質。短語"功能性連接"或"可操作地連接"指的是啟動子或啟動子區域和編碼或結構序列以這樣的方向和距離以便編碼或結構序列的轉錄可以由該啟動子或啟動子區域來指導。術語"基因"指的是染色體DNA，質粒DM，cDNA，合成DM，或編碼肽，多肽，蛋白質的其它DNA，或RM分子，以及表達調節中所涉及的編碼序列旁側的區域。術語"基因組"包括宿主細胞內的染色體和質粒。引入到宿主細胞中的本發明的編碼DM因此可以是染色體整合的或質粒定位的。"異源DNA"指的是來自與受體細胞不同來源的DNA。"同源DNA"指的是來自與受體細胞相同來源的DM。"雜交"指的是核酸鏈與互補鏈通過堿基配對結合的能力。當這兩條核酸鏈中的互補序列彼此結合時，發生雜交。術語"培養基，，指的是酵母的化學環境，其含有酵母或重組酵母生長所需的任何組分以及用于生產抗壞血酸的一種或多種前體。適于酵.的"可讀框(0RF)"指的是編碼肽，多肽或蛋白質的DNA或RM的區域。"質粒"指的是一段環狀的，染色體外的，可復制的DM。"聚合酶鏈反應(PCR)"指的是產生一條核酸序列的多個拷貝的酶技術。通過在兩個擴增引物之間穿梭移動DNA聚合酶來制備DNA序列的拷貝。這種擴增方法的基礎是變性，然后再退火擴增引物，接著延伸以在位于側翼擴增引物之間的區域中合成新的DM鏈的多個循環的溫度改變。術語"啟動子"或"啟動子區域"指的是一種DM序列，其通常發現于編碼序列上游(50，其通過提供用于RNA聚合酶的識別位點和/或在正確位點開始轉錄所必需的其它因子來調控信使RNA(mRNA)的產生，從而調控編碼序列的表達。"重組細胞"或"轉化細胞"是這樣的細胞，其含有細胞中非天然存在的核酸序列或內源核酸序列的另外的單拷貝或多個拷貝，其中核酸序列通過人的行為被引入到細胞或其祖細胞中。術語"重組載體"或"重組DM或RM構建體"指的是任何元件如質粒，粘粒，病毒，自主復制序列，噬菌體，或線性或環狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，其來源于任何來源，能整合到基因組中或自主復制，含有其中一個或多個序列已經以功能性操作方式連接的核酸分子。這種重組構建體或載體能以這樣的方式將5'調節序列或啟動子區域和用于選擇的基因產物的DNA序列引入到細胞中，該方式為DNA序列被轉錄成功能性mRNA，其可以或不可以被翻譯并因此表達。"限制酶"指的是能識別雙鏈DM中的核苷酸的特定序列并切割兩條鏈的酶；也被稱為限制性核酸內切酶。切割一般發生于限制位點內或接近于限制位點。"選擇標記"指的是這樣的核酸序列，其表達賦予促進含有該核酸序列的細胞的鑒定的表型。選擇標記包括那些賦予毒性化學藥品(例如，氨千青霉素，卡那霉素)抗性或補充營養缺乏(例如，尿嘧啶，組氨酸，亮氨酸)。"篩選標記"指的是這樣的核酸序列，其表達賦予視覺上有區別的特征(例如，顏色變化，熒光)。"轉錄"指的是從DNA模板產生RM拷貝的過程。"轉化"指的是引入外源核酸序列(例如，載體，質粒，或重組核酸分子)到細胞中的過程，其中該外源核酸摻入到染色體中或能夠自主復制。已經經歷轉化的細胞，或這種細胞的子代，是"轉化的"或"重組的"。如果該外源核酸含有編碼所需蛋白的編碼區，而且該所需蛋白在轉化的酵母沖生產并基本上是有功能的，那么這種轉化的酵母是"功能性轉化的"。"翻譯"指的是從信使RNA產生蛋白質。術語"產率"指的是用產生的抗壞血酸的量(摩爾或重量/體積)除以消耗的前體的量(摩爾或重量/體積)，再乘以100。酶的"單位"指的是酶活性，其表示每分鐘每mg總的細胞蛋白質所轉變的底物的微摩爾數量。"載體"指的是攜帶核酸序列進入宿主細胞中的DNA或RNA分子(如質粒，粘粒，噬菌體，酵母人工染色體，或病毒，等等)。載體或它的一部分可以被插入到宿主細胞的基因組中。縮寫表AscL-抗壞血酸(維生素C)AGDL-半乳糖酸-l，4-內酯脫氫酶(沒有信號肽)ALOD-阿拉伯糖酸-l，4-內酯氧化酶ARAD-阿拉伯糖脫氫酶GalL-半乳糖酸-l，4-內酯GulL-古洛糖酸-l，4-內酯LGDHL-半乳糖脫氫酶ME甘露糖差向異構酶MIP肌醇磷酸酶RGLOL-古洛糖酸-l，4-內酯氧化酶TCA三氯乙酸TPI丙糖磷酸差向異構酶實施例下面的實施例旨在示范本發明的特定實施方案。本領域技術人員應當認識到，下列實施例中公開的技術代表發明人所發現的在實施本發明中充分發揮作用的技術，并因此可被認為構成用于實施本發明的優選方式。然而，本領域的技術人員，根據本公開內容，應當理解，可以對所公開的具體實施方案進行許多改變，并仍然獲得同樣的或相似的結果而不背離本發明的精神和范圍。材料和方法1.抗壞血酸的測定按照Sullivan等的方法(1955，Assoc.0ff，Agr.Chem.，38，2,514-518)用分光光度法測定抗壞血酸。將135jal樣品與40jalH3P04(85%)在比色杯中混合。然后添加675jaloc，cT-聯吡咬(0.5%)和135jLi1FeCl3(1%)。IO分鐘以后測定525nm處的吸光度。在一些實驗中，通過HPLC(TracerExtrasil柱C8，5yM，15x0.46cm，Teknokroma，S.Coop.C.Ltda.#TR-016077;洗脫液'溶于95/5&0/乙腈中的5mM十六烷基三曱基溴化銨，50mMKH2P04;流速1ml/分鐘，在254nm處UV檢測)，用純的L-抗壞血酸(Aldrich，A9,290-2)作為標準品證實了抗壞血酸的身份。2.特定基因序列的擴增為了擴增特定基因序列，將PfuTurboDM聚合酶(Stratagene#600252)用于GeneAmpPCRSystem9700(PEAppl.Biosystems,Inc.)上。使用的標準條件為每100m1反應液400jaMdNTP,0.5|iM引物，0.5mMMgC12(除了緩沖液以外)，以及3.75UPfu。使用的基因的序列已經通過Genbank公開報道，如下，MIP除外。MIP序列如SEQIDN0:4所示，其不同于Genbank序列(登錄號NM—111155)之處在于有兩個翻譯沉默位點置換bp271處，A(NM—111155)置換為T(SEQIDNO:4);685bp處，T(NM—11155)置換為G(SEQIDNO:4)。基因Genbank登錄號SEGIDNO:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>將下面的程序用于擴增ME:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>將下面的程序單用于擴增MIP:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>用于LGDH，ME與MIP的模板DNA:50ng質粒cDNA文庫pFL61擬南芥(ATCC#77500(MinetM.等，1992，PlantJ.，2，417-422))。用于AL0的模板DNA:來自啤酒糖酵母GRF18U的50ng基因組DNA，是使用標準方法提取的。使用NovagenInc.的完全平端克隆試劑盒(#70191-4)，將PCR產物平端克隆到pSTBlue-1的EcoRV位點中。使用的寡核普酸SEQIDNO:8:tttcaccatatgtctactatccSEQIDNO:9:aaggatcctagtcggacaactc擴增的基因AL0(酵母)SEQIDNO:10:atgacgaaaatagagcttcgagcSEQIDNO:11:ttagttctgatggattccacttggLGDH(植物)SEQIDNO:12:gcgccatgggaactaccaatggaacaSEQIDNO:13:gcgctcgagtcactcttttccatcaME(植物)SEQIDNO:14:atccatggcggacaatgattctcSEQIDNO:15:aatcatgcccctgtaagccgcMIP(植物)3.質粒構建這里使用的命名規則是將pSTBlue-l，在就它的多克隆位點(MCS)而言有義方向上含有，例如，ALO，命名為pSTBAL0-1。在另一個例子中，將pSTBlue-1，在就它的MCS而言反義方向上含有ALO，命名為pSTBALO-2，等等。使用pYX系列(R&DSystems,Inc.)或著絲粒表達質粒pZ3和pZ4(P.Branduardi，M.Valli,L.Brambilla,M.Sauer，L.Alberghina和D.Porro.TheYeastzj^osacc力ao/z/ycesbailii:將aNewHostforHeterologousProteinProduction,SecretionandforMetabolicEngineeringApplications,FEBSYeastResearch,FEMSYeastRes.4，493-504,2004)克隆插入物。將標準程序用于所有的克隆過程(SambrookJ.等，MolecularGenetics:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。pSTBLGDH-1EcoRIpYX022pHHIS3(標記)pSTBALO-1EcoRIpYX024ALOLEU2(標記)pSTBME-1EcoRIpZ3pZ3MEKarf(標記)pSTBME-lEcoRIpZ4pZ4MEHphr(標記)pSTBMIP-1EcoRIpYX012pUMIPURA3(標記)為了進行下面的所有工作，將酵母對照菌株用對應的空載體轉化。4.酵母培養與檢驗使用的酵母菌株是啤酒糖酵母GRF18U(Brambilla,L.等，1999，FEMSMicrob.Lett.171，133-140)，卑酒糖酵母GRFc(Brambilla等1999FEMSMicrob.Lett.171:133-140)，哞酒糖酵母BY4742O^fcr,力/s》/ew義/7^/wsJ，EuroScarf登錄號Y10000),啤酒糖酵母YML007w(BY4742;M4ra/A/sJ;7eM,j1￥丄^7『.."/3#K，EuroScarf登錄號Y10569)，或通過用不同的開發質粒轉化而由它們4汙生。所有的菌林都在裝有基本培養基(0.67%w/vYNB(DifcoLaboratories,Detroit,MI#919-15，2%w/v葡萄糖或甘露糖，并分別添加合適的氨基酸或腺嘌呤或尿嘧啶至50jag/L)和/或合適的抗生素(G418或潮霉素分別至500mg/l和400mg/1)的搖瓶中，在標準條件(30。C下振蕩)下培養。對于抗壞血酸測定，660nni處的初始光密度為大約O.05，從氧化脅迫恢復的動力學為0.1。通過以4000rpm于4'C離心5分鐘回收細胞，用冷蒸餾&0洗滌一次，并如下處理對于測定胞內抗壞血酸，將細胞重懸浮于為沉淀體積的大約3倍的冷10%TCA中，強力渦旋，在水上保持大約20，然后通過離心從細胞碎片中清除上清液。5.酵母轉化酵母細胞的轉化4安照LiAc/ss-DNA/PEG法(Gietz，R.D.和Schiestl，R.H.,1996，TransformingYeastwithDM,MethodsinMol.andCell.Biol.)進行。轉化的酵母待保藏于ATCC，保藏號還沒有指定。實驗結果在C^7(^哞《這擬/^不li",Z/(^^學潘潛發母〃0編碼擬/^f#凡舉潘#餘母"G，擬扇不Z(7/^希擬^辜#/尸的基因被置于TPI啟動子的調控下，每個基因都位于它自己的整合質粒上，除了ME，其被亞克隆到著絲粒質粒中。兩個或多個基因被整合到啤酒糖酵母GRF18U和BY4742中。每個基因在單一座位上被整合。圖1提供了目前對植物中從D-葡萄糖到L-抗壞血酸的生理學生物合成途徑的理解的示意圖。涉及下列酶A，L-半乳糖酸-l，4-內酯脫氫酶(1.3.2.3)，B，L-半乳糖脫氫酶，C,肌醇磷酸酶(3.1.3.23)，D，水解酶(假定的)，E，GDP-甘露糖-3，5-差向異構酶(5.1.3.18)，F,甘露糖-l-磷酸鳥苷酰轉移酶(2.7.7.22),G，磷酸甘露糖變位酶(5.4.2.8),H，甘露糖-6-磷酸異構酶(5.3.1.8)，I，葡糖-6-磷酸異構酶(5.3.1.9)，J，己糖激酶(2.7.1.1)。在圖l所示的途徑中，AL0催化反應A,LGDH催化反應B，ME催化反應E,而MIP催化反應C。已知野生型酵母細胞能生產GDP-甘露糖(圖1中的反應F-J)，并將它轉運到內質網中。下表顯示了通過啤酒糖酵母GRFc(對照)，或用(i)AL0和LDGH;(n)ALO，LDGH和ME;或(iii)ALO，LDGH，ME和MIP轉化的嘩酒糖酵母GRF18U,將D-葡萄糖和D-甘露糖轉變成抗壞血酸。細胞從0D"。為0.05開始，在基本培養基(2%葡萄糖或甘露糖，0.67%YNB)上生長。生長24小時以后，測定抗壞血酸。雖然用ALO和LGDH轉化的野生型GRFc和GRF18U這兩種細胞都沒有積累抗壞血酸，但是用ALO，LDGH和ME，或ALO，LDGH，ME和MIP轉化的細胞分別出乎意料地積累了相當量(即高于背景水平)的抗壞血酸。使轉化的酵母在基于葡萄糖或基于甘露糖的培養基上批量生長表達的基因含有葡萄糖的培養基上總的(抗壞血酸加赤型抗壞血酸)含有甘露糖的培養基上總的(抗壞血酸加赤型抗壞血酸)wt(對照)0.02050.0220ALO,LGDH(對照)0.02100.0221ALO，LGDH，ME0.03020.0332ALO,LGDH,ME，MIP0.04500.0296(總的(抗壞血酸加赤型抗壞血酸)值為生物質/L的mg/0D"°)對照菌抹中測定的值表明野生型酵母通常產生的赤型抗壞血酸產物。我們推斷，酵母內源性地具有可非特異性催化從GDP-L-半乳糖到L-半乳糖的反應的活性(參見圖1)。具體地說，雖然不想受理論束3縛，但是我們推斷GDP-L-半乳糖自發地水解成L-半乳糖-l-P并且非特異性磷酸酶催化L-半乳糖-l-P轉變成L-半乳糖，其然后由LGDH和ALO轉變成L-抗壞血酸。MIP與假定的非特異性磷酸酶相比提供了更好的使L-半乳糖-l-P轉變成L-半乳糖的催化作用(E《ZM《#5,#/尸對E《ZC/眠#i)。我們沒有觀察到在培養基中任何抗壞血酸積累。圖2表明了YML007w酵母宿主對氧化脅迫特別敏感。Yaplp激活對氧化脅迫應答所需的基因；缺失該基因導致所觀察到的表型(Rodrigues-PousadaCA，NevittT，MenezesR，AzevedoD，PereiraJ，AmaralC.Yeastactivatorproteinsandstressresponse:anoverview.FEBSLett.2004Jun1;567(1):80-85)。已經分析了下列酵母菌林BY4742(▲)YML007w(0)圖2A.酵母菌抹從0D"。為Q.l開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。圖2B.在存在0.8mM比02時，酵母菌抹從0D綱為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。圖2C.在存在1.0mM11202時，酵母菌林從0D"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。在缺乏11202時這兩個菌林均生長(圖2A)，雖然YML007w酵母宿主的生長在含有0.8mM過氧化氫(圖2B)的培養基中強烈延遲并在含有1mM過氧化氫(圖2C)的培養基中完全削減。圖3表明了YML007w酵母的生長敏感性可通過添加抗壞血酸到培養基中來拯救。已經分析了下列酵母菌林BY4742(▲)200680015039.4說明書第28/32頁YML007W(0)圖3A.在存在0.8niMH力2時，酵母菌林從OD"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，Q.67%YNB)上生長。以15mg/L的終濃度在T=0時添加抗壞血酸。圖3B.在存在1.0mM&02時，酵母菌株從OD"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，Q.67%YNB)上生長。以15mg/L的終濃度在T=0時添加抗壞血酸。添加的抗壞血酸的作用是濃度依賴性的。實際上，抗壞血酸濃度增加到30mg/L，確定了對生長缺陷更快的拯救(數據未顯示于圖中)。圖4表明了YML007w酵母宿主的生長缺陷可以由表達ALO,LDGH,ME和MIP的表達來杏i救。已經分析了下列酵母菌抹BY4742(▲)表達ALO，LDGH和ME的YML007w(口)表達ALO，LDGH，ME和MIP的YML007w(■)圖4A.在存在0.8mM&02時，酵母菌林從OD"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。圖4B.在存在1.0mMH202時，酵母菌林從0D"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。克隆的基因能與通過在培養基中添加抗壞血酸獲得的類似地拯救生長敏感性(參見圖3)。令人感興趣的是注意到，與在沒有MIP存在下的酵母細胞相比，存在MIP可以更快的恢復。作為脅迫的經典例子，我們用&02激發了野生型酵母細胞。正如所料，在缺乏&02時野生型細胞充分生長(圖5A)，但是相同的酵母細胞在存在&02時不生長(圖5B)。普遍認為外部脅迫物導致DNA損害，脂質損害，蛋白質損害，膜損害，以及其它的亞細胞結構，并最終導致細胞生活力和細胞完整性的喪失。因此，不令人驚訝的是，這種脅迫物的存在導致零產物，零生產率與零產物(在本案中，野生型酵母生物質)的產量，如圖5B所示。通過用(i)LGDH，AL0和ME或(ii)LGDH，AL0，ME和MIP轉化野生型GRF酵母，重組酵母產生了抗壞血酸，如上所述，而野生型酵母沒有天然地產生抗壞血酸。令人驚訝地，基于這些重組酵母的生物加工顯示出高產，高生產率，和高產物(酵母生物質)的產量(圖5B)。生產，生產率和產量的值都大于0.00(對照菌林的值)。圖5表明了野生型GRF酵母菌林對發酵的脅迫狀態(由添加2mMH202誘導的脅迫狀態)是敏感的；令人驚訝地，產生抗壞血酸的酵母菌林顯示非常強健。已經分析了下列酵母菌林GRFc(閉合的三角形)；表達ALO,LDGH和ME的GRF18U(開放的正方形)；表達AL0，LDGH,ME和MIP的GRF18U(閉合的正方形)。圖5A.酵母菌株從0D"。為0.l開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。圖5B.在存在2.0mM&02時，酵母菌林從0D"。為0.1開始，在基本培養基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生長。野生型菌林沒有消耗葡萄糖。用于該實驗的所有菌林均具有相同的營養缺陷型互補和相同的抗生素抗性表達盒(其是不同的異源基因表達所必需的)，以便對于它們中所有的菌抹，表達3個或4個異源基因的菌林或野生型菌抹，使用相同的培養基都是可能的。該實驗顯示，兩個重組GRF酵母菌林是比野生型GRP酵母更強健的菌林，因此可能更適于某些工業過程。雖然不想受理論束綽，但是我們認為也許通過由抗壞血酸直接清除活性氧類別(ROS)和由抗壞血酸干擾不需要的應激反應如凋亡，細胞死亡，生活力喪失和完整性喪失等等，重組酵母可能對各種各樣的脅迫物不太敏感。雖然已經根據特定的實施方案描述了本發明的組合物和方法以及酵母菌林，但是可以進行改變而不背離本發明的構思，精神和范圍，對于本領域技術人員來說是顯而易見的。參考文獻下列參考文獻，某種程度上，它們為這里描述的那些提供了示例性的程序或其它的額外詳述，特此引入這里作為參考。PadhH.1990，Cellularfunctionsofascorbicacid,Biochem.CellBiol，68，1166-1173.[2〗美國專利2,265,121Huh，W.K.，Lee，B,H.，Kim，S.T.，Kim，Y.R.，Rhie，G.E.，Baek，Y.W.，Hwang,C.S.,Lee，S.J.,Kang，S.0.，1998，D-Erythoascorbicacidisanimportantantioxidantmoleculein5:cere"'"'ae，Mol.Microb.30，4，895-903Wheeler,G.L.，Jones,M.A.，Smirnoff,N.，1998，TheMosyntheticpathwayofvitaminCinhigherplants,Nature393,365-368Huh，W丄，Kim，S.T.，Yang，K.S.，Seok，YJ.，Hah，Y.C.，Kang，S.0.，1994，CharacterisationofD-arabinono-l，4一lactoneoxidasefromCa/7￡/2.￡/aa/6/ca/2SATCC10231，Eur.J.Biochem.225，1073-1079Kim，S.T.，Huh，W.K.，Kim，J.Y.，Hwang,S.W.，Kang，S.0.，1996，D-ArabinosedehydrogenaseandbiosynthesisoferythoascorbicacidinCfl/2d2'c^a/6/ca叫BBA1297,1—8Kim，S.T.，Huh,W.K.,Lee，B.H.，Kang,S.0.，1998，D-Arabinosedehydrogenaseanditsgenefrom5^cc力aro/z7/cescere"^e，BBA1429，29-39Roland,J.F.，Cayle，T.，Di畫odie，R.C.，Mehnert，D.W.，1986，FermentationProductionofAscorbicAcidfromL-GalactonicSubstrate,美國專利4,595,659Roland,J.F.，Cayle，T.，Di畫odie，R.C.,Mehnert，D.W.，1990，BioconversionProductionofAscorbicAcidwithL一Galactono—l，4一0xidase，美國專利4,916，068Lee,B.H.，Huh，W.K.，Kim，S.T.，Lee，J.S.，Kang，S.0.，1999，BacterialProductionofD-ErythoascorbicAcidandL一ascorbicacidthroughFunctionalExpressionof5^cc力aro/z77cescereF/、2'aeD—Arabinono—l，4一LactoneOxidaseini^c/er/c力/aco//App.Env.Micr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