樹狀細胞組合物和方法

專利名稱：：樹狀細胞組合物和方法才對狀細力包組合物和方法發明背景許多的臨床試驗已經證明樹狀細胞疫苗的安全性，超過1000名患者接受了樹狀細胞疫苗而沒有出現與該療法相關的嚴重不良事件，以及在一半的患者中沒有出現臨床反應(Ridgeway(2003)CancerInvest21:873-8%)。用于制備樹狀細胞(DC)的常規方法是從個體收集外周血單核細胞(PBMC),然后將占PBMC小比例的單核細胞分化成DC。離后不久就應當冰凍或培養單核細胞。因此，在以前的臨床試馬會中，樹狀細胞疫苗由單核細胞組成，PBMC或單核細胞可在約37°C中培養，或在從患者收集后幾小時中進行冷凍。然而，由于該方法需要培養或冷凍新分離的PBMC或單核細胞，在實際的生產條件中限制了處理的疫苗的廣泛應用。PBMC分化成DC,耗時約一周，并需要GMP設備和熟練技術人員。因此，提供在或接近可從患者獲得PBMC的每個臨床現場以用于生產DC疫苗的設備和人員，成本是過高的。商業上生產DC疫苗的可行模式是提供一種或較少數量的可從患者PBMC或在臨床現場收集的單核細胞以制備DC疫苗的設備，然后運輸到生產現場。然而，所述模式不能應用于目前需要新鮮的PBMC或單核細胞的DC生產方法。冷凍新鮮的單核細胞需要在收集現場分離白細胞后的額外操作，因此并不是理想的選擇。因此，需要研制在運輸到生產設備期間使用已經保存的PBMC或單核細胞來生產DC疫苗的方法。本發明滿足了這種需要，同時還提供另外的優點。發明筒述本發明人發現了從分離自個體并在1-34°C保存6-96小時周期的單核細胞中制備樹狀細胞和樹狀細胞疫苗的方法。這種從保存的單核細胞制備DC的能力，提供了單核細胞更多的加工適應性，并便于單核細胞從收集現場運輸到生產設備。另外，本發明人發現了從保存的胞。例如，與從新鮮單核細胞制備的樹狀細胞相比，從保存的單核細胞制備的樹狀細胞疫苗，提高了共刺激分子(例如CD80、CD83和CD86)的水平，以及提高了MHC-I類和MHC-III類分子的水平。因此，在一個方面中，本發明提供用于從單核細胞制備樹狀細胞的方法，包才舌a.提供從分離自個體起已在1°C-34°C溫育6至％小時周期的單核細胞；和.b.誘導所述單核細胞分化成樹狀細胞。在優選的實施方案中，通過分離白細胞以收集包含單核細胞的外周血單核細胞(PBMC),獲得單核細胞。優選地，通過用培養基接觸單核細胞以誘導分化，其中培養基包含可誘導單核細胞分化成未成熟樹狀細胞的有效量成分，例如但不限于GM-CSF;GM-CSF和IL-4;GM-CSF和IL-13;GM-CSF和IL-15;和IFNoc。然后使未成熟樹狀細胞進行發育，以生產成熟樹狀細胞。通過本發明方法制備的成熟樹狀細胞，表型不同于現有技術的成細胞中ALOX15RNA對肌動蛋白RNA或GAPDHRNA的比值小于1.0。與在從新鮮單核細胞制備的成熟樹狀細胞中的ALOX15對肌動蛋白或GAPDHRNA的比值相比，該比值是降低的。在另一個實施方案中，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的CD52RNA對肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值大于1.0。在另一個實施方案中，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL誦1PRNA或CD69RNA對肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值大于1.0。還在另一個實施方案中，本發明提供包含成熟單核細胞衍生的樹狀細胞的組合物，其中與從新鮮單核細胞制備的成熟樹狀細胞相比，本發明的成熟樹狀細胞提高了CD80、CD83、CD86、MHC-I類分子或MHC-II類分子中的一種或多種的水平。另外，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，所述樹狀細胞的ALOX15RNA、CD52RNA、TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1(3RNA或CD69RNA的穩定狀態7jC平發生改變。通過本發明方法制備的樹狀細胞，特別適合于制備疫苗。因此，同時提供相關的樹狀細胞組合物和疫苗。在優選的實施方案中，疫苗是個體自體同源的。優選地，樹狀細胞疫苗負載了來自于個體中的癌細胞或病原體的抗原。令人驚訝地是，發明人已經發現溶化后在DMSO的存在下，用DMSO冷凍的樹狀細胞疫苗是穩定的。因此，本發明提供使用抗原負載的樹狀細胞以用于制備治療或預防癌癥或病原體傳染病的冷凍藥物，其中藥物包含至少2%的DMSO,并且剛一溶化就可進行施用。在另一個實施方案中，本發明提供接種個體的方法，包括a.解凍包含至少2%DMSO的冷凍樹狀細胞疫苗，和b.在施用前，不改變細胞對DMSO的比例，以將解凍疫苗施用給個體。DMSO的濃度優選是約10%。在另一個實施方案中，本發明提供抗原負載的樹狀細胞，其中所述細胞是體外分化于單核細胞，并在>5%DMSO的存在下冷凍以及解凍后，能體外存活至少24小時。在優選的實施方案中，在>10%DMSO的存在下進行冷凍和解凍后，抗原負載的樹狀細胞能體外存活至少24小時。在另一個實施方案中，本發明提供包含約5-15%DMSO的樹狀細胞疫苗，其中所述疫苗用于施用給個體。附圖簡述圖1:用于調節單核細胞(如，分離白細胞的產物)運輸溫度的優選運輸容器和包裝材料的簡圖。圖2:RNA轉染的DC提供功能共刺激載體。在混合淋巴細胞反應(mixedlymphocytereaction,MLR)分析中，測試DC刺激從PBMC生產INF-y的能力。將從3種不同供體制備的解凍DC,與預先來自各個供體的冷凍PBMC進行匹配。使用作為讀數器的ELISPOT(INF-y)，測試所有匹配方式的組合。第1柱、第4柱和第7柱代表與自體PBMC匹配的DC。第2柱、第3柱、第5柱、第6柱、第8柱、和第9柱代表與非自體PBMC匹配的DC。第10-12柱僅僅代表代表PBMC對照。圖3:對于混合細胞因子的成熟DC與來自相同供體的未成熟DC，比較刺激從自體T細胞生產Thl細胞因子的能力。用編碼流感基質蛋白的RNA轉染這兩種DC群體，并用于刺激來自自體PBMC的流感特異記憶性CTL。顯示ELISPOT分析的結果(#斑點/孔與輸入PBMC有關)。下列順序顯示四個柱形的各組通過未成熟DC，從流感特異T記憶性細胞得到的IFNy產物；通過成熟C，從流感特異T記憶性細胞得到的IFNy產物；通過未成熟DC,從流感特異T記憶性細胞得到的IL-2產物；以及通過成熟DC，從流感特異T記憶性細胞得到的IL-2產物。圖4:對通過從2個不同健康供體獲得的日齡PBMC所制備的兩個RNA負載的樹狀細胞制品中的各兩個小管，進行解凍。將每個供體的一個小管迅速在同種異基因混合淋巴細胞反應(Alio-MLR)分析中進行測試，同時在通過相同方法進4亍分析之前，使每個制品的第二個小管置于室溫40分鐘。用于該實驗的PBMC，包括來自每個供體的自體細胞和來自與以上兩者無關的供體的PBMC的第三種樣品。用于該分析的讀數器是ELISPOT(INF-y)。圖5:根據DC刺激與降低流感mRNA轉染濃度有關的自體PBMC的記憶性流感特異反應，評價DC預先冷凍對解凍后的函數。分析的讀出器是ELISPOT(INF-力。圖6:通過使用編碼GFP的RNA電穿孔后，GFP表達的流式細胞術評價。未轉染(虛線)。圖7:細胞內細胞因子染色使用通過編碼GFP(負調節，左欄)或CMVpp65(右欄)的RNA轉染的DC進行刺激后，CD4和CD8T細胞上的IL-2/IFN-y。圖8:使用通過編碼GFP(負調節，左欄)或CMVpp65(右欄)的RNA轉染的DC進行刺激后，在CD4和CD8T細胞中稀釋CSFE。圖9:從分離白細胞的日齡產物所制備的6日齡未成熟樹狀細胞(iDCs)的表型。圖10:從分離白細胞的日齡產物所制備的7日齡成熟樹狀細胞(mDCs)的表型。發明詳述貫穿本說明書的各種出版物、專利和公開專利說明書作為相同引用的參考文獻。因此，這些出版物、專利和公開專利說明書的內容作為參考而被引入本說明書中，以更充分地描述適合本發明的現有技術水平。除非另外指出，實施本發明所使用的分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規方法(包括重組技術)，均屬于本
技術領域：
的范圍內。所述方法已在文獻中得到充分說明。參見例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(1989);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人編著(1987));theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);PCR:APracticalApproach(M.MacPherson等人。IRLPressatOxfordUniversityPress(1991));PCR2:APracticalApproach(M丄MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編著，(1995));Antibodies,ALaboratoryManual(Harlow和Lane編著(1988));UsingAntibodies,ALaboratoryManual(Harlow和Lane編著(1999));以及AnimalCellCulture(R丄Freshney編著(1987))。定乂如本文中所用的，某些術語具有下列規定的含義。如本說明書和權利要求中所用的，除非上下文另外清楚的限定，單數形式"一"、"一個"和"該"包括復數標準。例如，術語"細胞"包括多個細胞及其混合物。術語"抗原"是本領域中充分理解的，包括免疫原性的物質(即免疫原)以及抗原性表位。可以理解的是可預見本發明使用任何抗原，因此包括但不限于自身抗原(無論是正常或疾病相關的)、傳染性抗原(如，微生物抗原、病毒抗原，等等)、或其它外源抗原(如，食品成分、花粉，等等)。術語"抗原"或替換物、或"免疫原"，施加于多于一種免疫原的集合，使得可同時調控對多種免疫原的免疫反應。而且，該術語包括免疫原或抗原的任何各種不同的制劑。在優選的實施方案中，抗原來自于癌細胞或病原體。優選地，癌細胞是腎癌細胞、多發性骨髓瘤細胞或黑素瘤細胞。優選的病原體是HIV和HCV。在優選實施方案中，抗原以分離自或衍生于癌細胞或病原體的RNA形式，被呈遞于抗原呈遞細胞(APC)。"衍生于"包括但不限于包含融合無關或相關序列的天然存在的序列的重組變體。在共同未決的美國臨時專利申請號60/525,076和PCT/US/05053271(其內容在此通過引用以作為參考)中，？〉開了適于從任何細胞(如，癌細胞或病原體細胞)提取的RNA的RT-PCR方法以及體外轉錄方法。術語"癌"指細胞的異常形態，它可展現相對的自發增長，以致癌細胞展現以明顯失去細胞增殖控制為特征的畸形生長表型。癌細胞可以是良性的或惡性的。在各種實施方案中，癌侵害膀胱、血液、月畝、乳、結腸、消化道、肺、子宮、胰腺、前列腺或皮膚的細胞。如本文中所用的癌細胞定義，不僅包括原發癌細胞，而且包括衍生于癌細胞的任何細胞。這包括衍生于癌細胞的轉移性癌細胞和離體培養物以及細胞系。癌包括但不限于，實體胂瘤、液體腫瘤、血癌、腎細胞癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睪丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、神經母細胞瘤、惡性膠質瘤、視網膜母細胞瘤、白血病、骨髓癌、淋巴瘤、肝癌、腺瘤、肉瘤、癌瘤、胚細胞瘤，等等。如本文中所用的，術語"包括，，用于限定包含所述要素、但并不排除其它要素的組合物和方法。當用于限定組合物和方法時，"基本上由...組成"表示用于組合的、排除其它要素的任何重要基本物。因此，基本上由本文所規定的要素組成的組合物，不排除來自分離和純化方法的痕量污染物以及藥學上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等等。"由...組成"表示為了施用本發明組合物而排除其它組分的微量元素和基本方法步驟以外。根據這些變化術語的每個具體定義，都落入本發明的范圍內。如本文中所用的，術語"細胞因子"指對細胞發揮各種效應(例如，誘導生長或增殖)的許多因子中的任何一個。在實施本發明中，;(IL-2)、'干;田胞因子(SCF)、白細胞介素-3(IL-3^白細胞介素-4(IL-4;、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-ll(IL-ll)、白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-13(IL-13)、白細胞介素-15(IL-15)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-1(3(IL-l卩)、千擾素-y(IFN力、腫瘤壞死因子-ot(TNFa)、前列腺素E2(PGE2)、MIP-ll、白血病抑制因子(LIF)、c試劑盒配體、血小板生成素(TPO)以及flt3配體。細胞因子是可從一些供應商購買得到的，例如，Genzyme(Framingham,MA)、Genentech(SouthSanFrancisco,CA)、Amgen(ThousandOaks,CA)、R&DSystems(Minneapolis,MN)以及Immunex(Seattle,WA)。盡管沒有一直明確指出，但可以期望，與野生型或純術語"i對狀細胞(DC)"指在各種^淋巴和非淋巴組織中發現的形態學相似的細胞類型的不同群體(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9:271-296)。樹狀細胞組成生物體中最有效的和最優選的APC。樹狀細胞可分化于單核細胞，并具有單核細胞的明顯表型。例如，在樹狀細胞中沒有發現特殊分化標記CD14抗原，但單核細胞具有該標記。顯然，成熟DC可提供T細胞激活和增殖所需的所有信號。此外，成熟樹狀細胞不是吞噬細胞，然而單核細胞和未成熟樹狀細胞是明顯的吞噬細胞。通過胞吞作用、吞噬作用、巨胞飲作用(macropinocytosis)或吸附胞飲作用以及受體介導的抗原攝入，未成熟DC能夠捕獲抗原，并是表型CD80-或CD801ow、CD83-或CD831ow、CD861ow,以及具有高細胞內濃度的MHC-II類分子。成熟DC具有菌膜形態、低能力的胞吞作用，與未成熟DC相比，其表型是CD80high、CD83high、CDMhigh。優選地，成熟DC分泌IL-12p70多肽或蛋白，和/或顯著分泌水平下降的IL-10(每百萬DC0至S00pg/ml)。在從未成熟DC誘導DC成熟后直至36小時，通過培養上清的ELISA,測定IL-10和IL-12水平。參見，WierdaW.G.等(2000)Blood96:2917;AjdaryS等(2000)InfectionandImmunity68:1760;Banchereau,口Steinman(1998)Nature392:245。"有效量，，是足以發揮有益或期望結果的量。以一次或多次給藥、應用或劑量中，進行施用有效量。如本文中所用的，"表達"指將核酸轉錄成mRNA和/或mRNA翻譯成肽、多肽、或蛋白的過程。如果多核苷酸來源于合適真核生宿主的基因組DNA,表達則包括mRNA剪接。表達所需要的調控元件，包括結合RNA聚合酶的啟動子序列和用于核糖體結合的轉錄起始序列。例如，細菌表達載體或表達盒包含啟動子(如，乳糖啟動子)和用于轉錄起始的Shine-Dalgarno序列以及起始密碼子AUG(Sambrook等(1989)上文)。類似的，真核表達載體或表達盒通常包含RNA聚合酶II的異源或同源啟動子、Kozak序列、起始密碼子AUG、用于核糖體分離的終止密碼子以及下游聚腺苷酸化信號。所述載體可通過商業上購買獲得，或通過本領域中已知方法所述序列進行合成。術語"遺傳修飾"表示含有和/或表達可依次修飾細胞或其子代的基因型或表型的外源基因或核酸序列。換句話說，指細胞內源核苷酸的任何添加、缺失或斷裂。術語"分離，，表示從細胞等組分進行分開，其中多核普酸、肽、多肽蛋白、或其片段通常與性質是相關的。例如，至于多核苷酸，分離的多核苷酸是從通常結合在染色體中的5'和3'序列所分離的片段。對于本領域技術人員顯而易見的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，不需要進行"分離"，以區別其天然存在的配對物。另外，"濃縮的"、"分離的"或"稀釋的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，可不同于其天然存在的配對物，因為每體積分子的濃度或數量大于其"濃縮的"或小于"分離的"天然存在的配對物。不同于天然存在的配對物的一級序列或例如糖基化模式的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，不必以其分離形式進行存在，因為通過一級序列或者通過另一種特征例如糖基化模式，可從天然存在的配對物區分它們。盡管未明確指明本發明中公開的各個部適條件下的以上所有實施方案。因此，通過分離的天然存在的多核苷酸的單個實施方案，提供非天然存在的多核苷酸。通過從天然存在的、分離自天然生成的真核細胞的蛋白的單個實施方案，提供細菌細胞中產生的蛋白。從通常在體內被發現的或取自于體內的位置分離單個哺乳動物細胞。例如，通過白細胞分離術收集的白細胞是"分離的"，并且體外從單核細胞分化的樹狀細胞是"分離的"。術語"主要組織相容性復合體"或"MHC"指編碼可將抗原呈遞給T細胞并用于快速移植排斥所需要的細胞表面分子的基因復合體。在人類中，MHC亦稱"人類白細胞抗原，，或"HLA"復合體。MHC編碼的蛋白被稱為"MHC分子"，并被分成I類和II類MHC分子。I類MHC分子包括膜異形二聚蛋白，該蛋白由與(32-微球蛋白非共價結合的MHC中編碼的OC鏈組成。幾乎所有的有核細胞都能表達I類MHC分子，并且證實這些分子在抗原呈遞于CD8+T細胞中發揮作用。I類分子包括人類中的HLA-A、HLA-B以及HLA-C。II類MHC分子還包括由非共價結合的oc鏈和P鏈組成的膜異形二聚化蛋白。已知II類MHC分子在CD4+T細胞和在人類中包括HLA-DP、DQ以及DR中發揮作用。術語單核細胞，是能分化成對GM-CSF和IL-4應答的未成熟樹狀細胞的CD14+外周血單核細胞。如本文中所用的"病原體"，指引起任何疾病的生物體或病毒，及其減毒的衍生物。"藥物組合物"包括活性劑(例如抗原負載的DC)與惰性或活化載體的組合，以制備適于體外、體內或離體(exvivo)診斷或治療使用的組合物。如本文中所用的術語"藥學上可接受的載體"，包括任何標準藥物載體，例如熱滅活血清，添加10%DMSO、5%葡萄糖、磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳化液(例如油/水或水/油乳化液)以及各種濕潤劑。組合物還包括佐劑、穩定劑以及防腐劑。載體、穩定劑以及佐劑的實例，參見Remington'sPharm.Sci.l8thEd.(MackPubl.Co.,Easton(1990))。可交換使用術語"多核苷酸"和"核酸分子"，以指代任意長度的核苷酸的聚合形式。核酸包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。核苷酸具有任意的三維結構，并可實施任何已知或未知的功能。術語"多核苷酸"，包括，例如，單鏈/雙鏈以及三鏈螺旋分子、基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組核酸、支鏈核酸、質粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針以及引物。除了天然核酸分子之外，本發明的核酸分子還包括修飾的核酸分子。使用術語"肽"的主要含義，指兩種或多種氨基酸亞基、氨基酸類似物或多肽模擬物的化合物。亞基通過肽鍵連結。在另一個實施方案中，亞基通過其它鍵，如酯鍵、醚鍵等等進行連結。如本文中所用的術語"氨基酸"，指任一的天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D型與L型旋光異構體、氨基酸類似物以及多肽模擬物。如果肽鏈很短，三個或多個氨基酸的肽通常被稱為寡肽。如果肽鏈很長，肽通常被稱為多肽或蛋白質。如本文中所用的"個體"指哺乳動物，包括但不限于人及其它靈長類動物、嚙齒動物、狗以及貓。優選地，個體是人。發明人發現從患者收集單核細胞后，通過保存于1°C-34。C約6至96小時的單核細胞，可制備未成熟樹狀細胞、成熟樹狀細胞以及抗原負載的樹狀細胞。這些結果是令人驚訝的，因為通常認為關鍵在于從新分離的單核細胞而不是從已在周圍溫度下保存相當長時間的單核細胞中制備樹狀細胞。而且，通過培養收集自患者后6小時內的單核細胞、或通過冷凍收集后不久的PBMC并保存PBMC以用于隨后的解凍和培養單核細胞，制備用于本發明之前所實施臨床試驗的單核細胞衍生的DC疫苗。本發明人不僅發現能夠從在1°C-34°C下保存約6至96小時的單核細胞制備樹狀細胞和樹狀細胞疫苗，而且還令人驚訝地發現該方法所制備的樹狀細胞，表型優于從新鮮單核細胞所制備的樹狀細胞。制備方法和通過這些方法所制備的樹狀細胞疫苗的特征，特別與疫苗效價、遍及廣泛地區的成功的商品化以及便利地施用有關。首先，與通過現有技術方法所制備的DC相比，使用本發明方法所制備的成熟樹狀細胞，表達更高水平的CD80、CD83以及CD86共刺激分子，以及更高水平的MHC-I類和MHC-II類分子，其中這些都表現出DC成熟性和效價。另外，本發明的成熟DC以抗原特異方式，能從記憶性T細胞誘導IL-2產物。其次，在收集患者PBMC的每個現場附近建立樹狀細胞的生產能力，在商業上是不可行的。因此，自體樹狀細胞疫苗的有效普遍的商品化，依賴于將PBMC或分離自PBMC的單核細胞運輸到用于分化成未成熟和成熟樹狀細胞以及疫苗制品的集中生產設備的能力。然而，在本發明之前，一般認為在從患者移出后不久，應當冷凍或培養PBMC。通過允許加工已被過夜運輸或更久運送的PBMC或分離自PBMC的單核細胞，本發明方法解決了該問題。再者，在施用給患者之前，通常將抗原負載的樹狀細胞在DMSO中冷凍并保存直至解凍、洗滌以及重懸浮在無DMSO的藥學上可接受的載體中。預先的DC疫苗臨床試驗包括洗滌步驟，因為人們認為DMSO對凍融或解凍DC會有不利影響。令人驚訝地是，本發明人發現了DMSO對樹狀細胞沒有明顯的不利影響。因此，在施用之前，不必洗滌和重懸浮解凍的DC疫苗。忽略這個步驟，將提高施用簡易性，并減少由于額外操作帶來的對DC的污染風險和副作用。因此，在一個方面中，本發明提供用于從單核細胞制備樹狀細胞的方法，包"l舌a.提供從分離自個體起已在1。C-34°C溫育6至96小時周期的單核纟田月包；和b.誘導溫育的單核細胞分化成樹狀細胞。如本文中所用的"單核細胞"，指具有分化成樹狀細胞的能力的CD14+白細胞。單核細胞可來自任意的哺乳動物，并優選是人單核細胞。在優選的實施方案中，例如作為分離白細胞的產物，提供單核細胞連同其它的外周血單核細胞(PBMC)。在另一個實施方案中，從PBMC富集或直接從周圍血液分離單核細胞。本領域技術人員已知了分離單核細胞或含有單核細胞的PBMC的方法。在優選的實施方案中，通過分離白細胞，收集單核細胞連同其它的PBMC。分離白細胞的方法是本領域中已知的。在本發明的優選實施方案中，通過在醫院、診所、醫生辦公室等進行分離白細胞，從個體中收集包含單核細胞的PBMC。白細胞分離術是通過除去個體血液的白細胞、并然后將剩余物輸回個體的方法。白細胞分離術的產物通常是富集PBMC的血份，其具有低水平的紅細胞、粒細胞和血小板的雜質。用于實施白細胞分離術的方法和儀器是本領域中熟知的。例如，參見白細胞分離術的詳細信息gambrobct.com/Products—&—Services/。分離白細月包的4義器實例包4舌由GAMBROBCT制造的COBESpectra,和由BaxterFenwal制造的CS3000Plus血細胞分離才幾。在1。C-34。C溫育期之中或之后，從血液或血份(如，PBMC)富集單核細胞。如本文中所用的，"富集單核細胞"表示提高單核細胞對存在于該方法起始中的其它細胞類型的比例的方法。用于從PBMC、血液或其它iM分中富集單核細胞的方法，是本領域4支術人員已知的，包括但不限于淘析、FACS、淘選、磁力分選、低密度Ficoll梯度離心等等。優選地，通過淘析，從PBMC富集單核細胞。在一個替代的實施方案中，通過選擇在細胞培養中粘附塑料的單核細胞，在6-96小時溫育期后從PBMC富集單核細胞。在另一個實施方案中，通過免疫磁性篩選以富集單核細胞。免疫磁性篩選可正選擇結合單核細胞，或負選擇結合非單核細胞的細胞(如，T細胞、B細胞等等)。一旦從個體分離，將單核細胞從分離自個體起在1°C-34°C下溫育6至96小時周期。如本文中所用的，從個體分離單核細胞或含有單核細胞的PBMC的時間，指完成從個體中移出該細胞的過程的時間。例如，如果從患者分離PBMC超過四小時白細胞分離術的時程，分離時間則是從分離白細胞終點起至收集PBMC的時間。優選地，在3。C-34。C下、或4°C-32°C下或5°C-30°C下、更優選地在6。C-28。C下、更優選在6°C-27°C下、8°C-26°C下或約14°C-24°C下，溫育單核細胞6至96小時。優選的下溫度范圍是6。C、7。C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C和14°C。優選的上溫度范圍是20°C、21。C、22。C、23。C、24。C、25。C、26°C、27°C、280C、29。C、30°C、31°C、32°C、33。C和34。C。優選地，溫育期是8至72小時，更優選10至48小時，甚至更優選12至24小時以及最優選15至22小時。其它優選的溫育時間范圍包括8至48小時、10至30小時、26至72小時以及48至80小時。優選的溫育時間下限選自6、7、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、36以及48小時。優選的溫育時間上限選自24、26、28、30、36、48、60、72、84以及96小時。在1。C-M。C溫育期，將任意形式的單核細胞(如，血液中的單核細胞、血份、PBMC、純化單核細胞等等)從臨床現場運輸到樹狀細胞生產現場。優選地，將單核細胞在調溫容器中進行運輸。在溫育期間，將單核細胞溫度維持在1°C-34。C中的方法是本領域技術人員已知的。例如，在恒溫箱中或在1°C-34°C的室內中溫育單核細胞。優選地，在溫育期間，將單核細胞進行一些移動(間歇的或連續的)。移動是與運輸相關的移動。在另一個實施方案中，在溫育期間，可輕柔搖動或轉動細胞。不希望受到理論的限制，人們認為移動可防止與沉淀壓實相關的細胞損傷。在1°C-34°C的6-96小時溫育期中，溫育但不培養單核細胞。術語"不培養"，表示在6至96小時溫育期中，在約36-38°C下，將單核細胞不在哺乳動物細胞培養基(包括但不限于，生理性合適濃度的培養基，例如RPMI、DMEM、X-VIVO15、AIM畫V、StemSpanH2000等等)中進行培養。相反，將通過本發明方法加工的單核細胞在1°C-34°C下進行溫育，優選在血液或血份(如，血清、血漿、分離白細胞的產物(如，PBMC)、血沉棕黃層等等)鹽水或生物學緩沖液例如磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)中進行溫育。最優選地，在1°C-34°C下，將含有單核細胞的分離白細胞的產物在分離白細胞收集容器(如，血液收集袋)中進行溫育。在開始階段或在溫育期間，當將分離白細胞的產物轉入另一個容器時，優選避免會增加污染可能性的不必要的轉移。在1°C-34°C下溫育6-96小時之中或之后，在分化步驟之前可富集單核細胞。只要在1°C-34°C下進行操作，就在溫育期間實施對單核細胞或PBMC的操作。具體地說，在溫育期間，還可純化PBMC或從PBMC富集單核細胞。所述操作包括但不限于，離心、淘析、切向流過濾、Ficoll密度梯度、稀釋Ficoll密度梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心、抗體淘選、磁細胞分選、陽性或陰性免疫磁性選擇等等。在一個實施方案中，溫育期之后，通過在容器(優選塑料容器)中培養和選擇粘附的單核細胞，從PBMC富集單核細胞。在1°C-34°C下溫育約6至96小時周期和進一步富集單核細胞的任選步驟之后，誘導單核細胞分化成樹狀細胞。典型的，將單核細胞分化成未成熟樹狀細胞，然后未成熟樹狀細胞成熟為成熟樹狀細胞。用于將單核細胞分化成樹狀細胞和用于樹狀細胞成熟的各種方法，是本領域技術人員已知的。在一個實施方案中，在包含可誘導單核細胞分化成未成熟或成熟樹狀細胞的組合物的培養基中，培養單核細胞。誘導單核細胞分化成未成熟樹狀細胞的組合物是本領域技術人員已知的。所述組合物包括但不限于，GM-CSF+IL-4;GM-CSF+IL-13;GM-CSF+IL-15;IFNoc;以及GM-CSF+TNFa。誘導分化的組合物優選是GM-CSF+IL-4。GM-CSF和IL-4的濃度范圍在每細胞因子約400至2000U/ml。優選地，GM-CSF和IL-4的濃度是每細胞因子500至1000單位/ml。在一個實施方案中，在單核細胞分化成未成熟樹狀細胞期間，將單核細胞接觸GM-CSF和IL-4約4-7天，最優選地約5-6天。單核細胞分化成未成熟樹狀細胞之后，未成熟樹狀細胞可成熟為在一個實施方案中，通過接觸包含GM-CSF、IL-4、成熟混合物(PGE2、TNFoc、IL-6和IL-ip)的培養基，使未成熟樹狀細胞得以成熟。例如參見，Jonuliet等人(1997)EurJImmunol27:3135-3142，其內容通過引用作為參考。在替代的成熟方法中，用包含IFN-y的第一信號、隨后用包含CD40L的第二信號來指示未成熟樹狀細胞。例如在一個實施方案中，優選地在GM-CSF和IL-4的存在下，將未成熟樹狀細胞接觸PGE2、IFN-y以及CD40L。在優選的實施方案中，樹狀細胞中的重組CD40LmRNA的翻譯可影響與CD40L的4妄觸。優選地，通過編碼CD40L的mRNA或其活性片段，瞬時轉染樹狀細胞。最優選地，優選在GM-CSF和IL-4的存在下，將未成熟樹狀細胞接觸PGE2、TNFa以及IFNy，以生產成熟樹狀細胞。通過使用編碼CD40L的RNA進行轉染、優選瞬時轉染，可進一步增進樹狀細胞的成熟。優選地，使用編碼CD40L的RNA和/或編碼一種或多種目的抗原或表位的RNA,轉染樹狀細胞。在美國申請11/246,387中描述了上述成熟方法，其內容在此通過引用以作為參考。在本發明優選的實施方案中，樹狀細胞負載一種或多種抗原。抗原負載的樹狀細胞作為疫苗，并用于體外刺激T細胞。可將抗原負載進未成熟或成熟樹狀細胞。如果將抗原負載進入未成熟樹狀細胞，那么通過負載本身的方法、或通過本文中所述其它成熟方法或本領域技術人員已知的替代的成熟方法，可使得未成熟樹狀細胞成熟。抗原可負載成抗原自身(如，蛋白、肽、表位、細胞裂解物、病毒粒子等等)，或負載成編碼抗原的核酸。優選地，將抗原負載成編碼抗原的核酸。更優選地，核酸是RNA,最優選是mRNA。在優選的實施方案中，使用編碼CD40L的mRNA,共轉染編碼一種或多種抗原的mRNA。優選地，抗原是個體自體的，并用于制備施用給個體的抗原負載的自體DC疫苗。使用肽和蛋白抗原、細胞、細胞或組織裂解物、病毒或病毒粒子、核酸等等，用于負載樹狀細胞的方法是本領域技術人員已知的。在優選的實施方案中，通過^f吏用核酸、優選mRNA進^亍電穿孔樹狀細胞(成熟的或未成熟的)，來負載抗原。優選地，使用約0.25至4微克RNA/10M對狀細胞、最優選使用約2貼RNA/10M對狀細胞，進行轉染樹狀細胞。在一個實施方案中，每次轉染使用1微克腫瘤RNA/百萬DC。在另一個實施方案中，每106樹狀細胞，使用0.25至1.0pg的四種RNA中的一種，其中所述四種RNA編碼來自病原體(如，HIV)的四種分離的抗原。抗原可以是任意來源。然而，在優選的實施方案中，抗原或抗原是個體自體的。術語"個體自體的"指抗原是從個體中獲得的或衍生的。作為非限制性實例，抗原可來自從個體中獲得的癌細胞或胂瘤組織。以癌細胞、癌細胞或組織的裂解物、癌細胞或組織的提取物、癌細胞或組織的純化或克隆成分、總RNA或總mRNA、或從所述細胞或組織選出的RNA或mRNA的形式，無論是存在于提取物中、或是純化的、擴增的、體外翻譯等等的形式，可將癌癥抗原負載進入樹狀生抗原。本發明方法可特別用于治療或預防癌癥和病原體傳染病。在優選的實施方案中，癌是腎細胞癌、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤、肺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌或前列腺癌。術語病原體指病原學所涉及的任意病毒或生物體及其減毒衍生物。所述病原體包括但不限于，細菌、原蟲、真菌和病毒病原體，例如螺旋桿菌(//￡/化'0^"￡。如幽門螺桿菌(/ze/,'co^"er/^/on)、沙門氏菌(S"/mowe〃")、痢疾桿菌(57nge〃a)、腸桿菌、彎曲菌(G3w/7少/o/^"er),各種分枝桿菌(myco6a"en力)，例如麻風分枝桿菌(A^yco6""en力m/e/rae)、炭疽一干菌(S"d〃W5aw/7zracw)、鼠疫耶爾森氏菌(Ters7"/a/7e5/7s)、土4立弗朗西其斤菌(Fra/7C&e〃a化/are"w'力、布魯一干菌(Brwce〃(357ec/'es)、鉤端螺旋體菌(丄e/^cw//raz力&rraga似)、葡萄球菌(5V"尸/^/occwa、)(如，金黃色葡萄球菌S.沖炎菌(C/oW/7'c/wm)、白色念J朱菌(Ca"J/(i"a/Zn'ca/w)、癡原蟲(尸/aywo6/Zwm)、牙'H十曼原、蟲(丄e^/zwam'a)、4,蟲(7>_y/(3c^owa)、人類免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、巨細胞病毒(CMV)、人嗜淋巴細胞病毒(HTLV)、皰滲病毒(如，1型單純皰疹病毒、2型單純皰滲病毒、冠形病毒、水痘帶狀皰滲病毒以及Epstein-Barr病毒(EBV))、乳頭狀瘤病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒以及風滲病毒。優選病原體是病毒病原體，更優選是逆轉錄病原體，以及最優選是HIV或HCV。無論是成熟的或未成熟的、是抗原負載或非抗原負載的樹狀細胞，都可在包含防凍劑的組合物中進行冷凍。許多防凍劑是本領域技術人員已知的。防凍劑的實例包括但不限于，二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙醇、甲醇乙酰胺、單乙酸甘油酯、丙烷二元醇、聚乙二醇、乙二醇、異-丁四醇、D-核醣醇、D-木密醇、D-山梨糖醇、D-乳糖、異-肌醇、氯化膽堿、氨基酸、白蛋白(優選人血清白蛋白)、聚烯吡酮、葡聚糖、蔗糖、Ficoll、無機鹽以及羥乙基淀粉。在優選的實施方案中，防凍劑是DMSO。優選地，DMSO濃度是2-20%,更優選是5-"%。以及最優選是約10%。此外，冷凍培養基含有一種或多種碳水化合物衍生的多羥基化合物，例如葡萄糖、葡萄糖、蔗糖等等，濃度優選為2-30%,更優選為5-10%，最優選為5%葡萄糖。用于冷凍樹狀細胞的方法是本領域技術人員已知的。例如參見，美國專利申請20(M0253574，其內容在此通過引用以作為參考。優選地，防凍劑是二曱亞石風(DMSO)。在優選的實施方案中，DMSO濃度是5%至20%。最優選地，組合物中的DMSO濃度是約10%。令人驚訝地是，在5%-20%DMSO的存在下進行冷凍并解凍后，通過本發明方法所制備的樹狀細胞和樹狀細胞疫苗，解凍后能體外存活至少24小時。由于本發明的抗原負載的樹狀細胞能抗DMSO,因此在施用樹狀細胞疫苗之前不必洗滌細胞。因此，本發明解凍的樹狀低污染風險并避免:損傷樹狀細胞的進一步操作。因此:、在二個i施方案中，本發明提供用于施用抗原負載的樹狀細胞疫苗的方法，包括對包含至少2%至20%DMSO的冷凍樹狀細胞疫苗進行解凍，和施用前不改變樹狀細胞對DMSO的比例下將疫苗施用于個體。優選地，疫苗中的DMSO濃度是約5-20%,更優選是10%。在另一個實施方案中，本發明提供使用裝載抗原的樹狀細胞以用于制備治療或預防癌癥或病原體傳染病的冷凍藥物，其中藥物包含至少2%的DMSO,并且剛一溶化就可進行施用。本發明方法提供生產具有功能增強的和水平提高的成熟標記的新的樹狀細胞。例如，在一個方面中，本發明提供包含成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中與從新鮮單核細胞制備的成熟樹狀細胞相比，本發明的成熟樹狀細胞提高了CD80、CD83、CD86、MHC-I類分子或MHC-II類分子中的一種或多種的水平。在另一個實施方案中，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中樹狀細胞可引起從記憶性T細胞生產抗原特異IL-2。用于測量IL-2的方法是本領域中已知的。在圖10.35(Immunobiology,第6版,Eds.Janeway等,GarlandSciencePublishing,NewYork,NY,2005)中公開了記憶性T細胞特有的并可區別于其它T細胞類型的細胞表面標記和其它分子的表達；其內容在此通過引用作為參考。例如，記憶性T細胞表達高水平的CD44、CD45RO、CD45RA、Bcl-2、IFNy、CD127和Ly6C，表達中等水平的CD122和CXCR4，以及表達低水平的FasL和陰性的CD69和CD25。如本文所述，穩定狀態RNA水平的微陣列分析，顯示與從新鮮單核細胞制備的樹狀細胞相比，在從日齡老單核細胞制備的樹狀細胞之間的不同基因表達。因此在一個實施方案中，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中ALOX15RNA對細胞中的任一的(3-肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值小于1.0。優選地，比值在0.2至0.7之間，更優選地在0.4至0.5之間，以及最優選地約0.45。胞，其中細胞中的CD52RNA對(3-肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值大于1.0。優選地，比值在1.2至5.0之間，更優選在1.5至2.2之間、或在1.8至1.9之間，以及最優選地比值是1.86。還在另一個實施方案中，本發明提供成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1卩RNA或CD69RNA對肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值大于1.0。優選比值在0.2至0.9之間，更優選在0.5至0.8之間。使用SEQIDNOs:2-12所示的Affymetrix探針，檢測人ALOX15mRNA(SEQIDNO:l)及其等位變體。使用SEQIDNOs:14-24所示的Affymetrix探針，檢測人IL-1pmRNA(SEQIDNO:13)及其等位變體。使用SEQIDNOs:26-36所示的Affymetrix探針，檢測人TLR1mRNA(SEQIDNO:25)及其等位變體。使用SEQIDNOs:38-48所示的Affymetrix探針，檢測人TLR2mRNA(SEQIDNO:37)及其等位變體。使用SEQIDNOs:50-60所示的Affymetrix探針，檢測人CD69mRNA(SEQIDNO:49)及其等位變體。使用SEQIDNOs:62-77所示的Affymetrix探針，檢測人CD52mRNA(SEQIDNO:61)及其等位變體。使用SEQIDNOs:79-98所示的Affymetrix探針，檢測人GAPDHmRNA(SEQIDNO:78)及其等位變體。使用SEQIDNOs:100-119所示的Affymetrix探針，檢測人卩-肌動蛋白mRNA(SEQIDNO:99)及其等位變體。通過微陣列，優選使用Affymetrix人基因組U133Plus2.0陣列，檢測RNA穩定狀態的表達水平。或者，使用上文所列的基因特異探針，進行雜交。優選地，按照產品說明書(Genechip⑧ExpressionAnalysisTechnicalManual,2004),從樹狀細胞提取的RNA樣品可用于人基因組U133Plus2.0陣列(AffymetnxSantaClara,加利福尼亞州)。簡單地說，使用SuperscriptII逆轉錄酶，3微克的總RNA標準品和GenechipPoly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞州)可轉錄第一條cDNA鏈。合成第二條cDNA鏈后，隨即體外轉錄以用于線性擴增各個轉錄物和摻入生物素化CTP和UTP。將cRNA產物破碎成約100核苷酸的片段，并將其在微陣列上雜交16小時。然后，將微陣列在低嚴謹條件(6xSSPE)和高嚴謹條件(lOOmMMES,0.1MNaCl)下進行洗滌，并用鏈霉親和素-藻紅蛋白進行染色。通過添加生物素化的抗鏈霉親和素和額外等分量的鏈霉親和素-藻紅蛋白染料，以擴增焚光。在570nm激發后，將GenechipScanner3000(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞州)用于收集3jum分辨率的熒光信號。對于各個目的微陣列特征，計算兩個連續掃描的平均信號。用GenechipOperatingSoftwarevl.l(Affymetrix,SantaClara,力口利福尼亞)，分析掃描圖像。優選地，將Poly-ARNA對照試劑盒(Affymetrix,SantaClam,加利福尼亞)中包含的4種對照RNA的高線性相關(R2>0.95)，確認作為有效標記過程的對照。將所有基因或僅僅目的基因(如,ALOX15、IL-1卩、TLR1、TLR2、CD69和/或CD52,以及(3-肌動蛋白和/或GAPDH)的曲線數據，輸入計算機程序GeneSpring,并進行標準化處理。通過用于Affymetrix陣列的GeneSprmgTM所建議的標準方法，以正常步驟實施三個步驟。1)數據轉換(將所有小于0.01的值設定為0.01);2)將第50百分位數正態化。3)將中值正態化。通過區分目的mRNA的標準化表達(即GAPDH或卩-肌動蛋白mRNA的標準化表達)，然后可測定目的mRNA(ALOX15、IL-1|3、TLR2、CD69或CD52mRNA)對穩定狀態GAPDH或卩-肌動蛋白mRNA的比值。本發明的抗原負載的樹狀細胞可作為治療或預防疾病的疫苗，或激活可用于治療的T細胞。例如，抗原負載的樹狀細胞可用于引起對抗原的免疫反應。它們可作為預防將來的傳染病或疾病的疫苗，或作為激活免疫系統以治療正發生的疾病的疫苗，例如但不限于，病原體感染或癌癥。可將抗原負載的樹狀細胞與合適載體(例如生理緩沖液或其它注射液)一起配制成疫苗或藥物組合物。以足夠引起免疫反應的治療有效量，進4于施用疫苗或藥物組合物。優選地，用可衍生樹狀細胞的個體自體抗原負載樹狀細胞，并施用于相同個體。例如，參見，美國5,853,719(其內容通過引用作為參考)，描述了抗原負載的樹狀細胞和特別是RNA負載的樹狀細胞的制品和用途。或者，可使用計劃接受DC療法的受體的非自體抗原，以負載樹狀細胞。所述抗原的實例包括但不限于已知的治療靶的抗原，例如端粒酶、前列腺特異抗原，及其它胂瘤標記物，或來自病原體的已^口^元原。收集單核細胞或包含單核細胞的PBMC的方法用于收集單核細胞的包含單核細胞的PBMC的各種方法，對于本領域技術人員是已知的。例如，參見，詳細說明了用于PBMC收集和淘析單核細胞純化的白細胞分離術的gambrobct.com/Products—&—Services/。在優選的實施方案中,在GambroBCTCOBESpectra(GambroBCT,Lakewood,CO)上使用AutoPBSC(AutomatedPeripheralBloodStemCell)程序,在單個無菌的一次性、一次使用的細胞成份袋中，收集分離白細胞產物和血漿。在一個分離白細胞的替換方法中，通過在肝素注射器中收集血液、用PBS稀釋、在Histopaque1077(Sigma)上分層、離心以及在4妄觸面上復性PBMC,以獲得PBMC。參見Woodheadetal.(2000)InternationalImmunol12:1051-1061。收集、純化或分級PBMC的其它方法，對于本領域技術人員是已知的。在收集分離白細胞產物或其它血液產物后，將其中包含的單核細胞在1-34°C下溫育6-96小時。在一個實施方案中，在袋中收集分離白細胞的產物，然后將其轉移到能維持1-34°C、優選約6-28°C、最優選8-26°C的溫度監控運輸容器中的疫苗制備設備中。例如在美國專利4，102807中公開的有助于防止溫度變化的膠袋(gdpack)，可被歸入運輸容器范疇中。例如，可在絕熱集裝箱(如，ThermoSafemodelE65聚氨酯泡沫絕熱集裝箱)中運輸單核細胞，并用如圖1所示的ThermoSafeU-tek膠袋和膠墊進行包裝。例如，在圖1所示的包裝過程中，將可調節-l。C的16ozU-tek膠袋平放在E65容器底部。將兩個16ozU-tek膠墊(-l。C)重疊并放在第一層膠墊和E65容器的矮容器壁之間。然后將兩個16ozU-tek膠(調節+18。C)幾乎垂直放置在先前的膠墊上。將ThermoSafeINF3000運輸容器放置在膠之間。將分離白細胞的袋放在密封的內袋(STP711)中。將記錄內袋溫度的裝置用于監測運輸溫度。一個所述裝置是ThermoSafeDataLogger。將內袋置于密封的外袋(STP710)中，然后將該袋放入INF3000容器中。將16ozU-tek膠(+18。C)置于用牛皮纟氏(Kraftp叩er)套上的封閉INF300容器的頂部，然后塞上4"泡沫塞。然后用膠帶封口盒子，以備運輸。在1-34°C的溫育期之中或之后，可進一步處理或純化分離白細胞的產物，例如室溫下在50ml錐形管中進行Fico11密度梯度離心，以分離和濃縮包含樹狀細胞前體(單核細胞)的單核細胞組分。優選地，在通過磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行多個洗滌步驟后，可測定細胞濃度和細力包存活力。貧菜卓^"細應用于富集單核細胞的方法，對于本領域技術人員是已知的，包括但不限于密度梯度離心(如，稀釋Ficoll密度梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心等等)、淘析、附著塑料、切向流過濾、熒光激活細胞分選(FACS)、免疫細胞分離法(抗體淘選以選擇單核細胞或除去非單核細胞(如，白細胞、巨噬細胞、粒細胞，等等)、差異裂解、磁細胞分選等等)、在包被有塑料微載體珠的塑料培養袋中培養，等等。參見，例如，O'Doherty等(1993)JExpMed178:1067-1076;Young等(1990)JExpMedl71:1315-1332;Freudenthal等(1990)PNAS87:7698-7702;Bemhard等(1995)CancerRes55:1099-1104;Caux等(1992)Nature360:258-261;Read等(2003)"EvaluationofaClosedAutomatedSystemtoIsolatePeripheralBloodMonocytesforDendriticDell(DC)Immunotherapy",NinthannualmeetingoftheISCT;Mu等(2003)ScandJImmunol58:578-586;Maffei等(2000)Transfusion40:1419-1420;mitenyibiotec.com;Meyer-Wentrup等(2003)JHematotherStemCellResl2:289_2";以及WO2004/000444,其內容在此引用作為參考。例如，通過正選擇(CD14+細胞)或通過負選擇(即，除去非單核細胞的細胞；如，CD3+、CD19+和CD2+細胞)，磁細胞分選可用于富集單核細胞。優選地，通過淘析(分離來自個體白細胞分離物的單核細胞的自動方法)，從白細胞分離的產物富集單核細胞。分離白細胞的方法是本領域中已知的。例如，在GambroBCTElutraTM細胞分離系統(GambroBCT,Lakewood,CO)上實施淘析。通過將1000ml的5%人白蛋白血清(HSA)加入4LHank'平衡鹽溶液(HBSS)袋中，以制備淘析緩沖液。根據制造商的方法，通過淘析來分級細胞。在優選的實施方案中，將制造商(Gambro)方法的改良法用于淘析，其中最終的旋轉出組分是第四餾份而不是第五餾份。對單核細胞餾份實施CBC與差異分析，以鑒定純度和回收率。或者，通過免疫分型法與CD14,評價單核細胞純度。然后，將富集的單核細胞分化成樹狀細胞，或冷凍和保存以便后用。在一個實施方案中，將細胞冷凍在25ml或50ml的冷凍袋中。冷凍袋的實例包括Cryocyte冷凍袋、Origen冷凍袋(Cryostore)和Pall頂冷凍袋。優選地，各個冷凍袋含有15ml培養基(如，AIMV、x隱VIVO、RPMI,等等)，其中具有直至3x109細胞和約10-12%的DMSO和10-20%熱滅活的過濾血漿、終濃度約107至507mg/L的CaCl2，以及終濃度約44至241mg/L的MgS04。使用控制速度的水箱冷凍細胞，然后冷凍保存。在替代的實施方案中，PBMC溫育和Ficoll密度梯度純化之后，將PBMC重懸浮于八1]^々@培養基中，并以每瓶2.0xl()S細胞接種T"0cn^燒瓶。在獲得不足數量的PBMC的事件中，可冷凍PBMC并與第二次分離白細胞匯集。在"。C、5%C02、75%濕度的條件下，通過在無菌組織培養塑料燒瓶中附著1至2小時，從單核細胞群體中選擇單核細胞。除去未附著的和半附著的細胞。將PBS加入燒瓶，以除去剩余的未附著細胞、半附著細胞以及剩余的培養基。剩余的附著細胞是主要的單核細胞，代表富集的單核細胞群體。卓裙細應為VA成詢7乂'細^好才法用于單核細胞分化成樹狀細胞的各種方法，對于本領域技術人員是已知的。參見，U.S.6,607,722,WO97/29182;Romani等(1994)J.Exp.Med.180:83-93;Sallusto和La腿vecchia(1994)J.Exp.Med.179:1109等，和Reddy等(1997)Blood90:3640-3646;其內容在此通過引用以作為參考。這些方法的多數包括在細胞因子的存在下培養單核細胞，其中所述細胞因子可誘導單核細胞分化成樹狀細胞。用于單核細胞分化成樹狀細胞的替代方法的實例包括但不限于暴露于物理干擾下(如，剪切)，在通過細胞DNA成分能制備光加成產物的光敏劑的存在下進行照射，和/或用DNA粘合劑治療，隨后與疾病效應劑一起溫育，例如微生物、真菌、病毒以及惡性細胞。參見美國專利6力O7,722，其內容在此通過引用以作為參考。的組合物的培養基中進行培養，將單核細胞分化成樹狀細胞。用于培養單核細胞、未成熟和成熟樹狀細胞的合適培養基，包括但不限于AIM-V、X-VIVO-15、RPMI、DMEM等等。誘導單核細胞分化成樹狀細胞的組合物是本領域中已知的，包括但不限于添加IL-4的GM-CSF、添加IL-13的GM畫CSF、以及IFNa。在優選的實施方案中，通過在GM-CSF和IL-4的存在下進行培養，將富集的單核細胞分化成樹狀細胞。(參見，例如WO97/29182;Salhisto和La歸vecchia(1994)J.ExpMed.179:1109;以及Romani等(1994)J.Exp.Med.180:83-93)。簡單地說，優選以lxl()6細胞/ml的濃度，將富集的單核細胞在AIMV培養基、x-VIV015培養基或其它合適培養基中，在800U/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的存在下和37。C、5%C〇2、>75%濕度的條件下進行培養約4-7天、優選6天，以使得單核細胞分化成未成熟樹狀細胞。可調整細胞因子濃度。例如，GM-CSF濃度優選是500至1500U/ml、更優選是700至1000U/ml、最優選是800U/ml。IL-4濃度優選是400-1500U/ml、更優選是450至1000U/ml、最優選是500U/ml。IL-13或IL-15可用于代替IL-4，或者除其之外還含有IL-4。IFNa可用于代替添加了IL-4、IL-13或IL-15的GM-CSF。當單核細胞分化成樹狀細胞時，它們逐漸失去CD14的表達，并獲得和未成熟狀態中的樹狀細胞表型一致的CD80表達。f細y^成'熟力成勿/S^才法未成熟樹狀細胞成熟為成熟樹狀細胞的方法對于本領域技術人員是已知的，包括但不限于，抗原攝入和/或接觸可誘導成熟的組合物。基;PBMC條件培養基:固定金黃葡萄球菌(^ansorbin'TM);脂多糖(LPS);其它菌細胞產物，例如單磷酸脂A(MPL)、脂胞壁酸等等；磷酸膽石咸；鈣離子載體；佛波酯例如PMA;熱休克蛋白；核苷酸，例如ATP等等；脂肽；Toll樣受體4;適于Toll樣受體的人造配體；雙鏈RNA，例如poly-I:C等等；免疫激活DNA序列；成熟混合物(TNF-a、IL-6、IL-1卩和PGE2);GM-CSF、IL-4和成熟混合物(TNFot、IL-6、IL-1卩以及PGE2)、GM-CSF、IL-4、PGE2和IFNy序列信號，其后是CD40L信號；等等。參見，例如Cisco等(2004)JImmunol172:7162-7168;Jonlmt等(1997)EurJImmunol27:3135-3142;美國專利申請20040203143;PCT申請PCT/US2005/036304和美國專利申請11/246,387,其內容在此通過引用以作為參考。在一個實施方案中，將含有TNFouIL-6、IL-ip和PGE2的成熟混合物，加入未成熟樹狀細胞的培養中。然后，將細胞過夜培養(約12小時或更久)，以產生成熟樹狀細胞。在一個替代的實施方案中，優選通過使用編碼CD40L的mRNA、或任選使用編碼一種或多種抗原的mRNA進行電穿孔，以轉染未成熟樹狀細胞，然后在IFNy和任選PGE2的存在下過夜培養(約12小時或更久)，以生產成熟樹狀細胞。人CD40LcDNA和蛋白分別如SEQIDNO:120和SEQIDNO:121所示。其它CD40L的mRNA是本領域技術人員已知的。在優選的實施方案中，將AIMV培養基中的成熟制劑直接加給未成熟DC，達到TNF-a(10ng/ml)、IFN-Y(1000U/ml)以及PGE2(1Mg/ml)的終濃度。然后，將細胞過夜培養(約12小時或更久)，以產生成熟樹狀細胞。任選地，通過細胞接觸被加入培養基中的或更優選在細月包中表達的CD40配體(CD40L),可進一步促進成熟。CD40L是組成型表達或瞬時表達。優選地，使用編碼CD40L的mRNA,任選地使用編碼一種或多種目的抗原的mRNA,轉染成熟樹狀細胞。我#將任意抗原負載到未成熟或成熟樹狀細胞中。然后處理抗原，并通過成熟DC進行呈現。抗原實例包括但不限于，病毒粒子、細菌或其它病原體、蛋白及其片段、多肽、病原體裂解物、病原體提取物、病原體核酸、癌細胞、癌細胞蛋白及其片段、癌細胞裂解物、癌細胞提取物以及癌細胞核酸。抗原是天然存在的，或通過化學合成或重組進4亍制備。使用本領域中已知的方法，以多肽、蛋白或核酸的形式，將抗原呈遞給細胞。以"天然"形式進行呈遞抗原，其中在制備抗原或誘導其進入所面對樹狀細胞的環境中沒有出現人為干涉。或者或另外，抗原包括粗制品，例如在常規的過敏注射(allergyshot)或腫瘤裂解物中，通常進行施用的類型。或者抗原是基本上純化的，如至少約90%純度。例如，抗原是通過蛋白裂解分離的蛋白所產生的肽。可利用任何各種裂解試劑，包括但不限于，胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝肽，或進行重組表達。另外，使用重組方法以產生編碼目的肽的核酸，并在期望條件下表達肽。或者，可純化編碼核酸的抗原，或從細胞、組織或病毒書f生該抗原。方案中,'、i元原是修飾:原"，、因為抗原具^基本上相同于天然2在的抗原的結構，但包含與天然存在的化合物的精確結構的一個或多個變化。例如，當天然存在的抗原是蛋白或多肽抗原時，與蛋白或多肽抗原相比，修飾抗原具有不同于天然存在的抗原的、以一個或多個氨基酸的插入、取代或缺失形式的氨基酸序列，和/或包括不同于天然存在的抗原中所對應氨基酸的、通過插入、取代或缺失一個或多個共價連接于氨基酸的化學部分的氨基酸。在一個方面中，天然存在的和修飾的抗原共有至少5個氨基酸(即至少75%同一性)的至少一個區。本領域技術人員可理解，在比較兩條氨基酸序列以測定它們同一性程度中，相同氨基酸延伸段(即，至少兩個區)的間距不必總是精確保守的。在至少5個氨基酸的至少一個區的氨基酸序列中，天然存在的和修飾的蛋白或多肽抗原顯示至少約80%同一性，或者更多是85%、90%、95%,或大于99%同一性。經常，更多的氨基酸序列的長區域(如，10、20、50、或100或多個氨基酸)可用于顯示稱為同一性程度。在優選的實施方案中，以編碼抗原的多核苷酸或基因施用抗原，使得基因表達引起在單個處理過的(當體內施用時)或細胞培養系統(當體外施用時)中產生抗原。用于生成包括表達基因或mRNA的核酸的方法，和用于將所述核酸導入可產生由表達基因編碼的任何蛋白的表達系統，是本領域中已知的，并在下文進行簡要描述。優選地，以mRNA形式進4亍施用抗原。將/人細胞(例如，癌細胞、病原體細月包或病原體感染的細胞)獲得的RNA或mRNA直接負載到樹狀細胞中。或者，在負載之前擴增RNA或mRNA。在一個實施方案中，使用含有有義啟動子的引物，通過RT-PCR擴增總mRNA或耙mRNA，以構建cDNA表達構建體。然后，將從表達構建體體外轉錄的RNA，用于負載細胞。用于分離、擴增、體外轉錄RNA并將RNA或其它核酸負載到樹狀細胞中的方法，是本領域技術人員已知的。例如，參見，PCT/US04/39539和美國臨時申請60/522,310,其內容在此通過引用以作為參考。在本發明的一個實施方案中，抗原是一個或多個HIV蛋白或其片段。作為非限制性實例，來自HIV感染者的血漿可作為HIVRNA的分離來源。在一個實施方案中，離心部分血漿、收集上清，并使用0.22jiim過濾器進行過濾，以及保存在-20。C，直至用于制備樹狀細胞疫苗。通過RT-PCR,擴增血漿中的HIVRNA并進行體外轉錄反應，以提供用于負載到樹狀細胞中的、足夠數量的擴增HIVRNA。簡單地說，使用逆轉錄酶、合適反應緩沖液以及隨機六聚體或靶反向引物，將病毒RNA反轉錄為單鏈(ss)DNA。然后，在一級PCR反應中，使用多重引物，通過PCR將單鏈cDNA擴增成雙《連DNA。通過選擇互補于那些區域兩側的靶序列的特異引物，測定一級PCR反應中的擴增區域的同一性。使用QIAquickPCR純化試劑盒，純化一級PCR反應的產物，然后作為第二輪或嵌套式PCR擴增中的模版。在這輪擴增中，5'引物含有RNA聚合酶結合位點(如，T7啟動子)突出端，3'引物含有聚T片段(polyTstretche)的懸突。通過在巢式PCR循環中的突出端區域所導入的修飾，使得體外轉錄PCR產物，并一運送到樹狀細胞中就進行有效翻^奪。使用QmgenRNeasy試劑盒，進行純化體外轉錄的RNA,并將RNA在無核酸酶的水中進行洗脫。如果需要，進行乙醇沉淀以濃縮RNA。將RNA重懸浮在無核酸酶的水中，并通過0.8/0.2pm聚醚砜(PES)過濾器，然后分散到0.5ml安全鎖的聚丙烯管中，并負載到DC中或在^150。C下冷凍保護，直至轉染之前進行解凍。在另一個優選實施方案中，從一種或多種癌細胞提取RNA或mRNA。使用PCT/US04/39539中描述的方法，將RNA或mRNA直接負載到樹狀細胞中，或首先通過RT-PCR進行擴增和體外轉錄。/W乂'勿/《^戎^,戎當作為未成熟樹狀細胞、成熟樹狀細胞時，或在未成熟到成熟才對狀細胞的分化中，使用一種或多種抗原負載樹狀細胞。樹狀細胞能攝取抗原，例如蛋白、肽、病毒、細胞、細胞裂解物等等。因此，僅僅通過用抗原或編碼抗原的核酸接觸樹狀細胞，可實施抗原負載。用于負載樹狀細胞的其它方法是本領域技術人員已知的，包括但不限于，核酸轉染、外來體、病毒載體、微顆粒輸送等等。例如，參見，Mitchell等(2000)CurrOpinMolTher2:176-181;Zitovogel等(1998)Nature4:594-600;Jenne等(2001)TrendsImmunol22:102-106，以及美國專利公開2005/0158856，其內容在此通過引用以作為參考。將一種或多種抗原直接負載到樹狀細胞中，或將編碼一種或多種抗原的核酸負載(轉染)到樹狀細胞中。在優選的實施方案中，使用編碼一種或多種抗原的核酸來負載樹狀細胞。優選地，核酸是mRNA。包括但不限于，被動轉染、脂質介導的轉染、^離子脂質介導的轉染(如，DOTAP)、陽離子肽介導的轉染、電穿孔。參見Nair等(1998)NatBiotechnology16:364-369;VanTendeloo等(2001)Blood98:49-56;Saeboe-Larssen等(2002.)JImmunolMethods259:191-203'，Boczkowski等(2000)CancerRes60:1028-1034;Gilboa等ImmunolRev(2004)199:251-263;美國臨時申請60/583,579;和美國專利公開10/177,390，其內容在此通過引用以作為參考。使用蛋白、多肽、肽、細胞或組織提取物或其它類型的抗原，以負載樹狀細胞的方法對于本領域技術人員是已知的。在優選的實施方案中，用一種或多種抗原負載未成熟樹狀細胞。在本發明的一個實施方案中，僅僅通過在培養基中與未成熟樹狀細胞一起溫育，負載肽、多肽和/或細胞或組織提取物。遞^《,/乙,戎在#，炎勿f厲子;遂合參^4熟44腐一#炎*/《在本發明的一個實施方案中，通過輕敲培養瓶以移動細胞，來收集未成熟樹狀細胞。然后將懸浮細胞轉入錐形管。將PBS加入培養瓶，以除去加入錐形瓶中的剩余漂浮細胞和剩余培養基。一些未成熟樹狀細胞可繼續附著于燒瓶。通過加入PBS并在從2。C直至室溫的任何地方中溫育燒瓶，以促進這些細胞的分離。在溫育末期，排干燒瓶并將移出的細胞加入錐形管中。然后沉淀所有細胞懸浮液，在PBS中洗滌并以0.5ml的4xl07/ml重懸浮在水冷ViaSpant，并置于冰上。用編碼抗原(組)的、2嗎/106細胞的mRNA混合DC,并置于4mm缺口電穿孔管中，在275-350V脈沖、100-300D和150pF,優選在325V、200Q下進行電穿孔。在電穿孔后，立刻在X-VIV015培養基中洗滌DC，并以lxl06/ml濃度重懸浮于補充了GM-CSF(800U/ml)、IL-4(500U/ml)和PGE2(l嗎/ml)、TNF-a(10ng/ml)、IL隱1卩(10ng/ml)以及IL詞6(100ng/ml)的X-VIV015中。然后，在37。C、5%C02、>75%濕度下，過夜溫育未成熟樹狀細胞，以生產穩定的成熟樹狀細胞。然后在PBS中洗滌成熟樹狀細胞。遞^在#/乙遽/尹戎#,裁'，炎^遽/尹成,熟在本發明的一個實施方案中，使用CD40L和IFN-y成熟未成熟樹狀細胞。優選地，通過如上所述電穿孔，用4jngCD40LmRNA/106細胞和編碼一種或多種抗原的mRNA(2^/106細胞)轉染未成熟DC,然后在補充了GM-CSF(800-1000U/ml)、IL-4(500-1000U/ml)、IFN畫y(500-1000U/ml)或TNF-oc(10ng/ml)和PGE2(ljig/ml)的X-VIV015中過夜培養，以生成穩定的成熟樹狀細胞。與通過上述細胞因子混合法成熟的樹狀細胞相比，通過這種方法成熟的樹狀細胞，可分泌高水平的IL-12(T細胞生長因子)和最小限度的IL-IO。遞過^*應，^戎通過本領域技術人員已知的方法，用抗原負載成熟樹狀細胞。在本發明的一個非限制性實施方案中，單核細胞開始分化成未成熟樹狀細胞后的第6天，將AIMV培養基中的成熟制劑直接加給未成熟DC,以獲得TNF-a(10ng/ml)、IFN^(1000U/ml)和PGE2(l|ig/ml)的終濃度。然后，過夜培養細胞以產生成熟樹狀細胞。然后收集DC,并用lpg編碼RNA的抗原和任選用4)igCD40LRNA/1()6細胞，進4亍共電穿孔。電穿孔后，將細胞在補充了GM-CSF(800U/mL)和IL-4(500U/mL)的lxl()S細胞的AIMV培養基中培養4小時。然后制備用于施用給個體而無需冷凍的細胞，或者配制用于冷凍的細胞。為了冷凍，優選在熱滅活的自體血漿、10%DMSO和5°/。葡萄糖中，以2xl0細胞/ml進行制備細胞。使用總數為1.4><107細胞的0.7ml小管，以充滿冷凍管。然后，將小管在乙醇盒中于-85。C下冷凍至少4小時，并轉入冷凍冰箱中以備保存。然后，將冷凍的樹狀細胞疫苗進行解凍，并且無需洗滌或重新配制即施用纟會個體。^式'勿應術'為、^fDC,以^定成熟在優選的方法中，收集106DC，并重懸浮在冰PBS/1%FCS中。在96孔平板(BDBiosciences)中，使用lxlOV孔的DC,混合偶聯了MHC分子的特異抗體的藻紅蛋白(PE)或FITC，(HLA-ABC，HLA-DR)、共刺激分子(CD80,CD86)、成熟標記(CD83)以及單核細胞標記(CD14),并在4°C下溫育至少15分鐘。將同種型匹配抗體作為對照。徹底洗滌之后，使用FACScalibur流式細月包4義(BDBiosciences)和CellQuest軟件(BDBiosciences),實施萸光分析。的實施方案中，洗滌成熟樹狀細胞，并以4x107細胞/的濃度重懸浮在熱滅活血漿(優選自體血漿)和10%葡萄糖中。然后，使用熱滅活血漿和20%DMSO按1:1稀釋細胞，以在熱滅活血漿中達到5°/。葡萄糖、1(P/。DMSO的終濃度。在適于冷凍保存的容器中，最終的靶填充成分是1.4xl(^細胞/0.7ml。然后，將樹狀細胞施用給患者或優選在-85。C下進行冷凍，和優選在^150。C下保存在冷凍冰箱(優選在干液氮水箱中，以預防污染)中。然后，將冷凍疫苗運輸到用于施用患者的臨床現場(優選通過皮內注射)。剛一解凍，無需進一步處理就將疫苗直接施用給患者。其它用于施用的合適制劑，包括含有抗氧劑、緩沖液、抑菌劑和溶質(使得制劑與計劃受體血液等滲)的等滲無菌注射水溶液，包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、保存劑、免疫激活劑、細胞因子和佐劑的無菌水性和非水性懸浮液。在優選的實施方案中，將成熟樹狀細胞以4xl07細胞/的終濃度重懸浮在熱滅活血漿的自體血漿和10%葡萄糖中。然后，使用熱滅活的自體血漿和20%DMSO的混合液，將這些細胞按1:1進行稀釋，以在含有5%葡萄糖和10%DMSO的熱滅活的自體血漿中達到終濃度2xl0"田胞/ml。在適于冷凍保存的容器中，最終的飽和制劑是1.4x107細胞/0.71！11。然后冷凍疫苗，并保存在^150。C的千液氮冰箱中。解凍之后，無需洗滌和重懸浮，疫苗可用于施用。通過各種方法，可施用樹狀細胞疫苗，例如但不限于，注射(如，皮下注射、皮內注射、靜脈注射、淋巴管灌注、關節腔內注射、肌肉注射、腹腔內注射)、連續灌輸、植入物的持續釋放等等。典型地，以每兩至四周施用DC疫苗。可以與生理可接受的載體、緩沖液、稀釋劑、佐劑、免疫調節劑等等一起施用樹狀細胞疫苗。優選地，所施用的樹狀細胞疫苗是患者自體的，或是HLA配型。施用于個體的細胞(如，激活T細胞或樹狀細胞)劑量，是在個體中隨時間有效實現期望的有益治療反應、抑制癌細胞生長、或抑制傳染病的有效量。優選劑量是約107細胞。任選地加入生物反應調節物，以通過本發明的DC或活化的T細胞用于治療。例如，任選地將細胞與佐劑或例如GM-CSF、IL-12或IL-2的細胞因子一起施用。#定友#,4'^#炎*應成乂##的『勿應的義的才法通過本發明方法可測定抗原負載的樹狀細胞或培養的T細胞的免疫原性，其中這些眾所周知的方法包括但不限于下列51Cr釋放裂解分析。比較抗原特異T細胞對肽沖擊的51Cr標記靶的裂解。"更活性"組合物顯示與時間有關的更多的靶裂解。裂解動力學和固定時點(如，4小時)的裂解綜合指標，可用于評價性能。Ware,CF等(1983)J.Immunol.131:1312。細胞因子釋放分析。T細胞一接觸修飾APC就分泌細胞因子的類型和數量的分析，是功能活性的測量。通過測定細胞因子生產的速率和總量的ELISA或ELISPOT分析，可測量細胞因子。Fujihashi,K.等(1993)J.Immunol.Meth.160:181;Tanquay，S.和Killion,JJ.(1994)LymphokineCytokineRes.13:259。體外T細胞培養。分析本發明組合物可引起來自正常供體的T細胞群體或患者衍生的PBMC的反應的能力。在該系統中，測試所得T細胞的溶解活性、細胞因子釋放、多克隆性以及對抗原表位的雜交反應。Parkhurst,MR等(1996)J.Immunol.157:2539。增殖分析。T細胞會擴大對反應組合物的響應。例如，通過測量3H-胸腺嘧淀的攝入，可定量監測增殖。Caruso,A等(1997)Cytometry27:71。轉基因動物模型。通過與本發明組合物一起接種HLA轉基因小鼠并且測定誘導免疫反應的性質和量度，可體內評價免疫原性。或者，通過人PBL的過繼轉移，hu-PBL-SCID鼠模型允許在小鼠中重建人免疫系統。如上文所述，可用組合物4妻種這些動物，并分析免疫反應，參見，Shirai,M等(1995)J.Immunol.154:2733;Mosier，D.E.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2443。靈長類模型。可利用非人靈長類(黑猩猩)模型系統來監測HLA限制配體的體內免疫原性。已經證明黑猩猩與人MHC分子一起共有重疊的MHC-配體特異性，因此允許人們檢驗HLA-限制配套的體內的相對免疫原性。Bertoni,R.等(1998)J.Immunol.161:4447。監測TCR信號轉導事件。由MHC-配體復合物引起的一些細胞內信號轉導事件(如，磷酸化)，是與有效的TCR嚙合有關的。這些事件的定性和定量分析已經與組合物通過TCR嚙合來激活效應細胞的相對能力有關。Salazar,E等(2000)Int.J.Cancer85:829;Isakov，N.等(1995)J.Exp.Med.181:375)。f#岸定^^€勿/《^方法可在一些任何結構中，實施細胞分離或用于在細胞純化中檢測細月包的免疫測定，^口，參見，Maggio(編著)(1980)EnzymeImmunoassayCRCPress,BocaRaton,Fia;Tijan(1985)"PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,"LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam;Harlow和Lane,supra;Chan(編著)(1987)Immunoassay:APracticalGuideAcademicPress,Orlando,FIa.;Price和Newman(編著)(1991)PrinciplesandPracticeofImmunoassaysStocktonPress,NY;以及Ngo(編著)(1988)Non-isotopicImmunoassaysPlenumPress,NY。通過所述FACS分析的流式細胞術，分離和鑒定細胞。各種流式細胞術是已知的。對于突光激活的流式細胞術的全面概述，例如參見，Abbas等(1991)CellularandMolecularimmunologyW.B.SaundersCompany,具體是第3章；和Kuby(1992)ImmunologyW.H.Freeman和Company,具體是第6章。如，可從BectonDickinson獲得FACS儀器。可用于標記細胞抗原的標記試劑，包括但不限于，單克隆抗體、多克隆抗體、蛋白或其它聚合物，例如親和基質、碳水化合物或脂質。通過任何已知的方法，例如免疫印跡、蛋白質印跡分析、；改射性示蹤或生物發光標記、毛細管電泳或其它追蹤尺寸、電荷或親合力基礎的方法，進4于一全測。實施例實施例1:從日齡分離白細胞制備樹狀細胞通過分離白細胞，從4個人供體收集外周血單核細胞(PBMC),并通過過夜輸送轉移到可保持8°C-26°C溫度的溫度監控運輸容器中的樹狀細胞生產設備.輸送當天，在50ml錐形管中，將分離白細胞的產物在室溫(約19-22。C)下進行Ficoll密度梯度離心(800xg)20分鐘，以分離和濃縮包含樹狀細胞前體(單核細胞)的單核細胞組分。在用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次之后，測定細胞濃度和細胞存活力。在第三次離心/用PBS洗滌步驟之后，將單核細胞重懸浮于StemSpanH2000培養基中，并以2.0xl08細胞/燒瓶接種在T150cm2燒瓶中。然后，在37。C、5%C02、>75%濕度下，通過附著在無菌組織培養塑料燒瓶，從單核細胞群體選出單核細胞。棄去非附著和半附著細胞(初級淋巴細胞)。將主要是單核細胞的剩余附著細胞，培養在含有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)StemSpanTMH2000培養基中。將這些細胞在3"C、5%C02、>75%濕度下溫育6天，以使得單核細胞分化成未成熟樹狀細胞。通過輕柔輕敲以移動細胞，收集大量的未成熟樹狀細胞群體。然后將懸浮細胞轉入錐形管。將額外的PBS加入燒瓶以除去剩余的懸浮細胞和剩余的培養基，并將PBS加入錐形管中的細胞懸浮液中。通過加入PBS，并在2_8°C下將燒瓶溫育約10分鐘，完全分離剩余的附著細胞。當溫育這些細胞時，離心錐形管中的細胞懸浮液，并將細胞沉淀重懸浮在PBS中。溫育末期，輕拍燒瓶，將內含物加入錐形管中的細胞懸浮液。沉淀所有細胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，根據細胞濃度細胞存活力和免疫分型而除去樣品。通過流式細胞術，檢查下列四種細胞標記組單核細胞系標記(CD3、CD14、CD19以及CD56)、樹狀細胞存在的指示物(CD11c)、抗原呈遞細胞標記(HLA-DR)以及成熟樹狀細胞標記(CD83)。富集的未成熟樹狀細胞制品，表達不顯著水平的CD83系標記，和表達高水平的CDllc和HLA-DR。使用OPTI-MEM⑧還原性血清培養基(GIBCC)TM)和HEPES緩沖液、L-谷氨酰胺而非酚紅，將未成熟樹狀細胞洗滌一次。然后，^吏用擴增腫瘤RNA,通過以每106樹狀細胞約2|agRNA的比例進行電穿孔，轉染樹狀細胞。在含有600(il的細胞懸浮液(含5xlCT細胞/ml)的4mm缺口管中，以500V、500ps的脈沖實施電穿孔。電穿孔后，將轉染的細胞轉移到T150燒瓶中，該燒瓶含有補充了IL-4(500U/ml)和GM-CSF(800U/ml)的StemSpanH200()TM培養基。在37。C、5%C02、>75%濕度下，將轉染的細胞溫育2-3小時，以使得細胞從電穿孔復蘇。在37。C、5%C02、>%濕度下，將未成熟的電穿孔樹狀細胞在補充了IL-4(500U/ml)和GM-CSF(800U/ml)以及成熟混合物(5ng/ml的IL隱lj3、150ng/ml的IL-6、5ng/ml的TNF-a以及l昭/ml的PGE》的StemSpanHM00TM培養基中，進行成熟20-24小時。使用1%HSA，將所有細胞因子以及PGE2在PBS中重建或稀釋(就PGE2而論)。在稀釋步驟之前，在乙醇中重建PGE2。然后，在加入細胞消化液(無胰蛋白酶)之前，用PBS洗滌成熟樹狀細胞，然后用PBS洗滌三次以除去細胞消化液。根據細胞濃度、存活力和免疫分型，收集樣品。表1所示比較未成熟和成熟樹狀細胞的免疫分型。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>以2xl0"田胞/ml的終濃度，將轉染的成熟樹狀細胞懸浮在自體血漿中。然后，用80%血漿和20%DMSO的混合液，按l:1稀釋細胞，以在90%血漿和10%DMSO中達到終濃度3><106或lxlO"田胞，然后使用控速冷凍法將其冷凍在低溫管中，并保存在S-150。C下。實施例2:從日齡分離白細胞的產物所制備的樹狀細胞疫苗，在10%DMSO中解凍后至少2小時保持有活力。將如實施例1所述制備的冷凍樹狀細胞疫苗在37°C下解凍，并在20-25°C或2-8。C下保持2小時。解凍后，在30分鐘間隔瞬時測定存活力，直至兩小時。解凍后，在37°C時的瞬時存活力是92%。結果如表2所示，證實疫苗可在10%DMSO中解凍并保存至少兩小時。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實施例3:從患者分離單核細胞并將單核細胞分化成未成熟樹狀細胞室溫下，通過在臨床現場進行分離白細胞從患者或志愿者收集外周血單核細胞和血漿。將分離白細胞的產物(PBMC)和血清，在可維持6-28°C溫度范圍的溫度調節容器中進行過夜運輸。分離白細胞的第二天，室溫下通過Ficoll密度梯度離心，在50ml錐形管中純化PBMC，以分離和濃縮包含單核細胞(樹狀細胞前體)和白細胞的單核細胞組分。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，幾次洗滌單核細胞，并測定細胞濃度。在最終離心/用PBS洗滌的步驟后，將單核細胞重懸浮在AIM-V培養基中，并以2.0xl()S細胞每瓶播種在T150cm2中。然后，在37°C、5%C02、》75%濕度的條件下，通過在無菌組織培養塑料燒瓶中附著1至2小時，從單核細胞群體中選擇單核細胞。通過用PBS輕柔洗滌，除去非附著和半附著細胞。將主要是單核細胞的剩余附著細胞，培養在含有1000U/mlGM-CSF和1000U/mlIL-4的X-VIVO15培養基中。將細胞在37。C、5%C02、>75%濕度的條件下溫育6天，使得單核細胞分化成未成熟樹狀細胞。體外培養之后，通過輕敲燒瓶以移動細胞，收集豐富的未成熟樹狀細胞群體。將懸浮細胞轉入錐形管。將PBS加入燒瓶以除去剩余的懸浮細胞和剩余的培養基，然后將PBS加入相同錐形管中的細胞懸浮液中。在2-8。C下，通過在PBS中溫育，促進剩余的附著未成熟樹狀細胞的分離。溫育末期，輕拍燒瓶，將內含物加入相同錐形管中的細胞懸浮液。然后沉淀所有細胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，除去樣品以測定細胞濃度。洗滌未成熟樹狀細胞，重懸浮在ViaSpan中，并用2|tig抗原編碼mRNA/10M對狀細胞進行轉染。在含有0.4ml細胞懸浮液(含4xl0"田胞/ml)的4mm缺口管中，以300V、IOOQ和150)nF的脈沖實施電穿孔。在電穿孔后，用X-VIV015培養基洗滌轉染的細胞、離心，并重懸浮在補充了GM-CSF(800U/ml)、IL-4(500U/ml)、IL-1卩(10ng/ml)、IL畫6(150ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)、和PGE2(lpg/ml)的X-VIV015(無血清)中。在37。C、5%C02、>75%濕度的條件下，過夜溫育細胞以促進成熟。將轉染的成熟樹狀細胞以4x107細胞/的終濃度重懸浮在熱滅活血漿的自體血漿和10%葡萄糖中。使用20%DMSO的混合液，按1:1稀釋細胞，以在含有10%DMSO和5%葡萄糖的熱滅活的自體血漿中達到終濃度2xl(^細胞/ml，然后在"0。C下冷凍在無菌低溫管中。實施例4:在6-28。C下，從過夜溫育的單核細胞所制備的樹狀細胞的物理和功能特征該實施例的數據證實了從日齡清血(apheresis)產物制備RNA轉染的樹狀細胞的功能和可行性。通過實施例3中描述的方法，制備樹狀細胞。下列數據顯示，以合適產率從單日齡的清血產物可重復地制備樹狀細胞，并且所得的細胞是(l)展現標準的成熟表型，(2)可有效地被RNA轉染，以及(3)用進行冷凍保存，并具有解凍后高存活力。DC的免疫表型.成熟DC的大量特征在于最終的細胞制品中應當存在或沒有分子標記的FACS染色。HLA-DR、CD83、CD86、CD80、CDla和CD209顯示高表達，CD14、CD56、CD19以及CD3顯示低表達。表3(下文)顯示從獲得自不同健康供體的PBMC中制備樹狀細胞疫苗的11個連續過程中所編輯的結果(陽性細胞百分比的平均值和標準偏差)。表3:從日齡單核細胞所制備的DC中，表達細胞表面標記<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>這些數據與顯微照片(未顯示)一起說明通過本發明方法條件所制備的DC，展現標準的DC表型和形態。進一步地，比較低的標準偏差表示該方法的可復現性。,量、《f和存活力。樹狀細胞方法經過了完全測試，并顯示可重復產生高質量RNA轉染的成熟樹狀細胞。表4顯示使用作為抗原有效負載的所有擴增腫瘤細胞系RNA和作為載體的正常供體樹狀細胞，11次疫苗試驗的結果。表4:在11次一致試驗中產生的DC疫苗產物的試驗結果概要<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>4這CCW7的成熟iW」脊^Z)C遷移。評價除了上述成熟DC標記之外的負責體內DC的淋巴節遷移的CCR7表達。在該研究中，將FACS分析和CCR7特異抗體用于檢查解凍的RNA轉染的DC,其中所述DC使用工業規模的GMP方法進行制備(一致試驗3、4、6、7、8和10)。結果如表5所示表5:CCR7+樹狀細胞的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>除了證實遷移后CCR7對DC的物理存在之外，通過使用膠原凝膠基質自發的遷移分析，還證實DC具有遷移能力，這表明表達的CCR7也是有功能的(數據未公開)。脊染/w」的dc炎供《處^W邀4'伴。上述實驗顯示，所制備的DC表達所有的關鍵共刺激標記，而以下實驗說明這些分子具有功能的。對于這個目的，使用從3種不同供體和來自各個供體的預先冷凍的PBMC中所制備的解凍DC，測定DC刺激由異常混合淋巴細胞(MLR)分析中產生的千擾素Y(IFN-y)的能力。期望結果是DC不會刺激由各自的HLA-匹配的自體PBMC所產生的INF-y,但當與非自體PBMC混合時，DC會進行刺激。使用作為讀數器的ELISPOT(INF-力，測試所有匹配方式的組合。數據如圖2所示。該實驗結果表明，正如預期的，只有錯配的DC/PBMC組合引起產生INF-y，這是需要功能性MHC和共刺激分子的表達的性質。成,熟z)c^|^##的衫^。在該實驗中，用于使轉染后DC成熟和預冷凍的細胞因子混合物，含有TNF-a、IL-ip、IL-6和PGE2。為了說明成熟DC優于未成熟DC，測定兩種群體的細胞(來自相同供體)刺激自體T細胞產生TH1細胞因子的能力。用編碼流感基質蛋白的RNA轉染這兩種DC群體，并用于刺激來自自體PBMC的流感特異記憶性CTL。以下圖3顯示ELISPOT分析的結果(#斑點/孔與輸入PBMC有關)。觀測在未成熟和成熟DC之間的引起從流感特異記憶性t細胞產生inf-y的非統計學差異。然而，僅僅成熟dc會引起從這些細胞產生IL-2。IL-2誘導被認為是非常重要的，因為(l)誘導的IL-2分泌物可維持自分泌抗原特異性CTL的增殖，和；(2)最近顯示，少量生產的INF-y和IL-2與在HIV患者中和最新研究中增長的死亡風險有關，缺乏INF-y或IL-2的分泌物會導致削弱了T細胞功能，并無法維持中樞記憶性反應(centmlmemoryresponse)。為簡單起見，不圖解表示負調節。從PBMC(即，無DC)單獨觀測的斑點的平均數是9.7(INF-y)和1.3(IL-2)。使用由3個獨立供體的PBMC所制備的疫苗，重復該實驗，結果在性質上是相同的。因此，與未成熟DC相比成熟DC具有額外的和更優越的功能。/^M4脊染^席劣^的DC^€潛定#。當臨床方案規定為剛一解凍就立即注射樹狀細胞疫苗時，意外事故可引發推遲施用。為了說明DC會保持活力和功能的，如果解凍但不進行立即注射，則實施下列實驗。將相當于2種不同健康供體的2種樹狀細胞制品中每種的兩管，進行解凍。將每個供體的一個小管迅速在同種異基因混合淋巴細胞反應(Alio-MLR)分析中進^^測試，同時在通過相同方法進4亍分析之前，使每個制品的第二個小管置于室溫40分鐘。用于該實驗的PBMC,包括來自每個供體的自體細胞和來自與以上兩者無關的供體的PBMC的第三種樣品。用于該分析的讀出器是elispot(inf-y)。該實驗結果如圖4所示，并表明在一解凍就進行分析的DC與在室溫下保持40分鐘的DC之間，功能上沒有明顯的差異。除了這項功能分析之外，通過臺盼染色排除法(trypandyeexclusion),測定解凍后和解凍后40分鐘的細胞存活力，并獲得相同結果(數據未顯示)。冷疾-席《不參喻DC#處。為了評價DC功能是否受到冷凍-解凍過程的反向影響，比較預先冷凍和解凍后的DC功能。根據DC刺激自體PBMC的記憶性流感特殊響應的能力，以評價功能，其中所述流感特殊響應與降低用于轉染的流感mRNA濃度有關。分析的讀出器是ELISPOT(INF-y)。在這次分析中，結果如以下圖5所示，表明冷凍-解凍過程對DC功能沒有影響。混合GFPmRNA的恒定量(0.5)iig),以監測轉染率。冷凍24小時后，將解凍后的樣品進行解凍。炎^7m7M^g,/乙Z)C^^蛋^4^t。作為第一步驟，我們評價使用mRNA轉染DC，是否導致編碼蛋白的mRNA的適量表達。為了制備DC，通過從健康志愿者中分離白細胞而獲得的PBMC(新鮮或冷凍的)，富集體外溫育2小時后附著在塑料燒瓶上的單核細胞。洗滌之后，將附著細胞在補充了重組粒細胞/巨噬細胞-集落刺激因子(rGM-CS)和白細胞介素-4(rlL-4)的X-VIVO15培養基中，培養六天以生成未成熟DC(iDC)。然后，使用編碼病毒或對照蛋白的RNA進行電穿孔lDC(300、150nF、IOOQ)，并在補充了IL-1卩、IL-4、IL-6、GM-CSF、TNF-a和前列腺素E2(PGE2)的X-VIVO15培養基中誘導成熟24小時。為了測試轉染后的蛋白表達，使用編碼綠色焚光蛋白(GFP)的RNA進行電穿孔DC,并通過流式細胞術測量表達。如圖6所示，轉染后直至四天，從日齡單核細胞所制備成熟DC的大量組分，都表達高水平的GFP，這證實這種方法可有效地長期促進DC中的蛋白表達。其次，測定自體DC在來自CMV感染個體的PBMC中可誘導CD4和CD8T細胞反應的能力，其中所述自體DC通過編碼CMVpp65蛋白的mRNA進行電穿孔而被轉染。通過使用充分限定的、衍生于pp65蛋白的免疫優勢肽(immunodominantpeptide)以刺激來自一些供血者的PBMC,并測量IL-2/IFN-Y分泌物以及測量CD8和CD8T細胞中的細胞增殖，鑒定CMV感染的個體。檢測是陽性CMV特異性T細胞反應的個體，并選出知情同意后贊同進行白細胞分離術的人員以進一步研究。如上所述，從這些個體制備DC。然后，將通過編碼CMVpp65蛋白的RNA所轉染的成熟DC,與自體PBMC按1/40比例溫育16小時(ICS)或6天(增殖)。刺激后，通過流式細胞術，評價IL-2和IFN-y分泌物(圖7)和CMV特異性CD4和CD8T細胞的增殖(圖8)。通過CMVpp65RNA進行電穿孔的DC,可誘導IFN-y和IL-2的高度表達，以及誘導來自CMV感染個體的CD8T細胞的增殖。然而，在CD4T細胞中所檢測的低水平細胞因子分泌物和增殖所示(圖7和圖8,下組)，這種方法可誘導CD4T細胞的最小限度的激活。實施例5:使用500U/ml或1000U/ml的IL-4,比較單核細胞分化成樹狀細胞洗滌來自在6-28。C下保持的日齡分離白細胞的PBMC,并以@~2xl0"燒瓶在AIM-V培養基中種植2小時的附著步驟。2小時后，除去非附著細胞，洗滌附著細胞并重懸浮在補充了1000U/mlGM-CSF和500U/ml或1000U/mlIL-4的X-VIVO15中，在37。C下溫育6天。另外，對于在補充了lOOOU/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的X-VFVO15中的培養，與培養6天而不改變培養基相比，比較在第3天改變培養基的效果。具體地說，在第3天，除去培養基和懸浮細胞；用X-VIVO培養基輕柔洗滌燒瓶，以收集松軟的附著細胞；以及將培養基和洗滌物以1300rpm離心8分鐘，以沉淀細胞。將細胞重懸浮在補充了lOOOU/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的新鮮X-VIVO15培養基中；將培養基和細胞回加到還含有附著細胞的燒瓶中；以及將燒瓶在37°C下進一步溫育三天。分別收集用于電穿孔的所有燒瓶。在第6天，用2貼GFPmRNA/106細胞(20)tigGFPmRNA/5xl06細胞)轉染DC,重懸浮在補充了800U/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的X-VIVO15中并以lxl06/ml進4亍接種；以及用細胞因子混合物(TNFa-10ng/ml;IL-l卩-10ng/ml;IL-6-100ng/ml;PGE2-l|ag/ml)進行成熟。在37。C、5%C02下過夜溫育DC。在第6天(未成熟DC;圖9)和轉染后24小時(成熟DC;圖IO)，進行表型鑒定。表6A-C顯示，各個培養條件轉染后立即和轉染后24小時的產率(。/。Rec)和存活力(％V)。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>白蛋白血清(HSA,BaxterHealthcare,Westlake，CA)力口入4L的Hank'平衡鹽溶液(HBSS,CambrexBioScience,Walkersville,MD)袋中，以制備淘析緩沖液。將該淘析緩沖液加入等于清血(pheresis)體積的日齡清血產物中。用淘析緩沖液灌注Elutra細胞分離系統(GambroBCT,Lakewood,CO),并裝載清血產物。實施淘析過程之后，從轉出的組分收集單核細胞。冷凍保存單核細胞。解凍已冷凍陶析的單核細胞，然后在燒瓶中，以1百萬細胞/ml在具有800U/mlGM畫CSF(BerlexLaboratories,Richmond,CA)和500U/mlIL-4(RDSystems,Minneapolis,MN)的X-VIVO15中，進行分化5天以產生未成熟樹狀細胞(iDC)。收集iDC,并通過電穿孔法，用擴增的RCC腫瘤RNA來負載抗原。用800U/mlGM-CSF、500U/mlIL-4以及成熟細胞因子(TNF-ouIL-1|3、IL-6以及PGE》來培養細胞，并在培養24小時后進行收集。使用臺盼藍排除法，通過ViCell(BeckmanCoulterInc.,Fullerton，CA)測定成熟樹狀細胞(mDC)的細胞計數和存活力。將所得的mDC進行表型鑒定。燒瓶中培養的細胞是99%CD83+和0.2%CD14+。在燒瓶中，所培養mDC的產量是34%的CD14+細胞。實施例7:比較通過新鮮細胞和通過日齡白細胞分離術所制備的DC的共刺激分子的表達在白細胞分離術分離的第3天，從3個健康人供體收集周圍血液，并在收集后30分鐘內轉移到蒙特利爾大學(UniversityofMontreal)。除去20ml白細胞分離物，并通過離心制備自體血漿。將白細胞分離物體積分成兩個相等部分。立即處理一部份，以生成"新鮮"單核細胞，而將第二部份以20ml等分量保存在5個50ml錐形管中，以產生來自"日齡清血法，，的細胞。將試管置于傾斜于震動臺(rockingplatform)的盒中的塑料容器中，于16-20°C下保存24小時。溫育期后，使用Ficoll密度梯度，分離PBMC。使用Ficoll密度梯度，從新鮮和日齡清血產物，分離包含樹狀細胞前體(單核細胞)的單核細胞組分。在50錐形管中，在Ficoll上分層白細胞分離物，并在室溫下將管離心(800xg)20分鐘。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)四次洗滌細胞，并進行計數以測定細胞濃度和細胞存活力。為了獲得高純度單核細胞群體，使用CD14微珠(Miltenyi)進一步純化單核細胞組分。將1x109細胞重懸浮在8ml含有PBS、0.5%BSA以及2mMEDTA(Miltenyi緩沖液)的緩沖液中。將2ml的CD14微珠加入含有1x109細胞的各個50ml管，并在4。C下溫育15分鐘。在100ml相同緩沖液中洗滌細胞，以300xg離心并重懸浮在20mlMiltenyi緩沖液中。將細胞懸浮液施加到位于》茲場下的四個LS柱(MiltenyiQuadromaxTM)。F利用重力流而施加細胞后，用3mlMiltenyi緩沖液將柱洗滌三次。在沒有磁場下，用5mlMiltenyi緩沖液將單核細胞洗脫兩次，并以300xg離心10分鐘。使用特異于CD3、CD19、CD16、CD56、CD14以及CD209的抗體，通過流式細胞術測定洗脫物和流過組分的純度。洗脫物組分包含88-98%單核細胞和小于2%的小細胞。非附著組分僅僅包含小百分率(2%)的單核細胞。在這時候，從一部分純化的單核細胞(50百萬)提取總RNA。為了制備成熟的分化DC，在37°C下，將50百萬單核細胞在含有IL-4和GM-CSF的X-VIVO培養基的T150cm2燒瓶中接種5天。在第5天，將含有腫瘤壞死因子、干擾素y和前列腺素e2的細胞因子混合物(TIP)加入細胞中。收集培養第6天的細胞，并將此時的細胞命名為"TIP-DC"。通過輕敲燒瓶以移動細胞，收集富含樹狀細胞的群體，用另外的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行洗滌，并通過在PBS中于2-8。C下溫育約10分鐘，來分離剩余的附著細胞。沉淀所有細胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，分析細胞濃度、細胞存活力和免疫分型。通過流式細胞術，檢查下列細胞標記組單核細胞系標記(CD3、CD14、CD19、CD16以及CD56)、樹狀細胞存在的指示物(CDllc、CDla和CD209)、抗原呈遞細胞標記(HLA-II)、遷移標記(CD38和CCR7)以及成熟樹狀細胞標記(CD83和CD86)。將20百萬TIP-DC重懸浮在600|iil的ViaSpan中，并用CD40LRNA以4|iigRNA/百萬樹狀細胞的比例進行電穿孔。在4mm缺口試管中，以300V、300ps的脈沖實施電穿孔。電穿孔后，將細胞轉移到含有補充了IL-4和GM-CSF的X-VIVO培養基(無血清培養基)的T75燒瓶中。在3C、5%C02、>75%濕度下，將轉染的細胞溫育4小時，使得細胞從電穿孔復蘇。此后，使細胞進一步成熟，并將其命名為"PME-CD40LDC"。從所生成的PME-CD40LDC的部分中，分離RNA。使用調速冷凍法(controlled-mtefreezing),將PME-CD40LDC冷凍在具有10。/。DMSO和90%自體血漿的冷凍管中，并保存在-85。C下。將如上所述制備的冷凍樹狀細胞疫苗，在37。C下進行解凍，并在20-25。C下保持30分鐘。解凍后，立即以10分鐘間隔測定存活力，直至30分鐘。使用特異于下列標記的抗體，通過流式細胞術檢查解凍后的PME-CD40LDC:單核細胞系標記(CD14)、樹狀細胞標記(CD1lc、CDla和CD209)、抗原呈遞細胞標記(HLA-II)、遷移標記(CD38和CCR7)以及成熟樹狀細胞標記(CD80、CD83和CD86)。結果來自三個供體的數據表明使用CD14微珠的正選擇，得到88-98%純度的單核細胞群體(表7)。小細胞污染的最大量是2%(表7)。在所有三個供體中，非附著(流動)組分含有直至2%單核細胞(大量細胞)(數據未公開)。因此，在非附著組分中沒有顯著的單核細胞損失。作為高CD3表達和低CD19、16或56標記表達的證據，洗脫物中存在的小細胞群體污染，主要由T細胞組成。在新鮮和日齡白細胞分離物之間的洗脫物組分中，CD83、CD86、CD11C、HLA-I或HLA-II標記的表達中沒有明顯的差異。表7:單核細胞匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>單核細胞在最初是很純的(90%),并且在分化過程中純度進一步得到提高，例如在來自所有三個供體的TIP-DC中，大細胞百分率是98-99%,因此，小細胞百分率低于2%(數據未公開)。通過流式細胞術分析TIP-DC表型，顯示在由新鮮白細胞分離物和日齡白細胞分離物所生成的TIP-DC之間，CD83表達存在差異。陽性細胞百分率涉及用于研究中的標記的細胞陽性數目。在來自所有3個供體的、從新鮮白細胞分離物所制備的TIP-DC中，表達表面成熟標記CD83的DC百分率，低于來自日齡白細胞分離物所制備的TIP-DC的表達率(表8)。在來自TIP-DC的任何其它標記中，沒有其它差異，其中通過新鮮白細胞分離物和日齡白細胞分離物可產生TIP-DC。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>DGS轉染后4小時對于轉染后的DC(PME-CD40LDC),分析轉染后四小時內CD154(CD40L)的表達。與通過新鮮白細胞分離物所生成的PME-CD40LDC相比，在轉染后l、2和4小時的供體中，來自日齡白細胞分離物的PME-CD40LDC表達更多的CD40L(表9)。在通過供體1和供體2中的新鮮分離物和日齡分離物所生成的PME-CD40LDC之間，平均熒光強度(MFI)也存在差異(表9)。解凍后的PME-CD40LDC解凍后，分析PME-CD40LDC對各種DC標記的表達。在解凍后的、由新鮮白細胞分離物和日齡白細胞分離物所生成的PME-CD40LDC表型中，存在差異。與通過日齡白細胞分離物所制備的DC相比，在通過新鮮白細胞分離物所制備的PME-CD40LDC中，CD40L表達的平均熒光強度更低。低于通過新鮮白細胞分離i所生成DC^的轉染率(表9)。"表9:PME-CD40LDC中的CD154表達匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>通過流式細胞術所測量的陽性細胞百分率，顯示在三個實例的兩個中，在通過白細胞分離物的日齡部分所生成的樹狀細胞中，更多的細胞被CD83抗體染色成陽性(表IO)。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>當CD80、CD83和CD86的陽性細胞百分率中的差異不一定高于通過日齡白細胞分離物(供體3，表10)所生成DC中的百分率時，在所有供體中，通過用特異抗體染色的日齡白細胞分離物所生成的細胞平均熒光強度是更高的。除了CD80、CD86和CD83之外，HLA-I和HLA-II顯示相同的結果(表11)。在成熟DC中，上調了與高蛋白水平表達/細胞和CD80、CD83、CD86、HLA-I以及HLA-II分子的表達相關的平均熒光強度信號。因此，這些細胞的表型反映了從所有三個供體中的日齡部分所獲得樹狀細胞的更多成熟狀態。這些變化反映DC的成熟狀態。將測量陽性細胞百分率所獲得的數據聯合平均萸光強度的數據，使得我們斷定從白細胞分離物的日齡部分所生成的細胞可展現更多的成熟表型。表11:解凍后PME-CD40LDC的MFI<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實施例8:在新鮮與日齡單核細胞中的基因表達的^f效陣列分析，及從中制備的樹狀細胞才艮據制造商的i兌明書(GenechipExpressionAnalysisTechnicalManual,2004)，將如實施例8所述新鮮的和日齡的單核細胞(在分離白細胞后，已將單核細胞在16-20。C下溫育24小時)的RNA樣品，以及從新鮮的和日齡的單核細胞所制備的DC的RNA,應用于HumanGenomeU133Plus2.0陣歹'J(Affymetrix,SantaClara,力。利福尼亞)。簡單地說，使用SuperscriptII逆轉錄酶，將3孩i克的總RNA標準品和GenechipPoly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClara,力口利福尼亞州)轉錄成第一條cDNA鏈。合成第二條cDNA鏈后，隨即體外轉錄以用于線性擴增各個轉錄物和摻入生物素化CTP和UTP。將cRNA產物破碎成約100核苷酸的片段，并將其在微陣列上雜交16小時。然后，將微陣列在低嚴謹條件(6xSSPE)和高嚴謹條件(lOOmMMES,0.1MNaCl)下進行洗滌，并用鏈霉親和素-藻紅蛋白進行染色。通過添加生物素化的抗鏈霉親和素和額外等分量的鏈霉親和素-藻紅蛋白染料，以放大熒光。在"0nm激發后，將GenechipScanner3000(Affymetnx，SantaClara,加利福尼亞州)用于收集3)im分辨率的熒光信號。對于各個微陣列特征，計算兩個連續掃描的平均信號。用GenechipROperatingSoftwarevl.l(Affymetrix,SantaClara,力口利坤畐尼亞)，分析掃描圖^象。將Poly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClam，加利福尼亞)中包含的4種對照RNA的高線性相關，確認是保證標記過程的成功。將所有性質的數據輸入計算機程序Genespring中，并根據樣品類型(即單核細胞樣品對單核細胞，樹狀細胞樣品對樹狀細胞)進行標準化處理。4艮據用于Affymetrix陣列的GeneSpring所建議的標準方法，以正常步驟實施三個步驟。4)數據轉換(將所有小于0.01的值設定為0.01);5)將第50百分位數正態化。6)將中值正態化。首先過濾具有空斑點的標志的數據。然后，不使用隨機預測模型，通過置信水平范圍在p.05或p.l的單向方差分析(onewayanova),進行分析數據。然后，分析過濾基因(filteredgene)表的任一倍數變化、表達水平或置信度。使用正常水平的樣品或單個樣品，實施如上操作。在變量分析之前或之后，比較新鮮的和日齡的單核細胞或樹狀細胞中的表達水平。相互比較基因表，并在一些基因表中根據它們的可信度細胞中與從新鮮單核細胞所制備的樹狀細胞中的變化的RNA穩定狀態水平的基因。表12B中列出了這些基因的說明。表13A中列出了具有日齡單核細胞中與新鮮單核細胞中的變化的RNA穩定狀態水平的基因。表13B中列出了這些基因的說明。這些結果說明新鮮單核細胞表型上不同于日齡單核細胞，而且從新鮮單核細胞所制備的樹狀細表12A:與從新鮮單核細胞所制備的樹狀細胞相比，具有從曰齡單核細胞所制備的樹狀細胞中的變化的RNA穩定狀態水平的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表12B:表12A中列出的基因說明<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>PKIB蛋白激酶(cAMP依賴型的催化反應)抑制子P蛋白激酶活性的負調節PTGER3前列腺素E受體3(亞型EP3)轉錄，DNA依賴型，信號轉導，細胞死亡，G蛋白偶合受體蛋白信號途徑CAMTA1鈣調蛋白結合轉錄激活蛋白1WNF受體信號途徑PLS3絲素蛋白(T同型)肌動蛋白結合鈣離子結合肌動蛋白結合TREM1在骨髓細胞1上表達的觸發受體體液免疫反應胞內信號級耳關TMEPAIRNA誘導的跨膜前列腺和雄激素整合膜CHI3L1幾丁質酶-3-樣l(軟骨糖蛋白-39)碳水化合物代謝幾丁質分解表13A:與新鮮單核細胞相比，具有日齡單核細胞中的變化的RNA穩定狀態水平的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>將表達兩個持家基因的樹狀細胞基因進行進一步標準化處理，其中所述持家基因在通過新鮮的和日齡的單核細胞所制備的DC之間是保持恒定的。將各個基因的平均表達量(標準)除以GAPDH(甘油醛-3磷酸脫氫酶)或(3-肌動蛋白的平均表達量(標準)，以得到持家基因有關的表達比值。六種基因的結果如表14所示。"DCdo"指從日齡單核細胞所制備的DC。"DCf'指從新鮮單核細胞所制備的DC。表14:在通過日齡或新鮮的單核細胞所制備的DC中，某些RNA對GAPDH或P-肌動蛋白的RNA穩定狀態表達比值。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>迄今為止，使用表15所示的引物并通過實時定量PCR(QPCR)，實施額外地檢驗兩個候選基因的單核細胞中的差異表達。根據制造商的說明書(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亞)，使用寡聚(dT)引物和用于RT-PCR的SuperscriptIIIFirst-strandSynthesisSystem,從各種總RNA(與用于GeneChip分析的相同)生成第一cDNA鏈。根據制造商的說明書(ABIPrism7900HTSequenceDetectionSystemUserGuide),使用ABIPrism⑧7900HTSequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems，FosterCity,力口利福尼亞)以實施QPCR。將TaqManGeneExpressionAssays或CustomTaqManGeneExpression(AppliedBiosystems,Foster,加利福尼亞)作為TaqMan⑧探針。使用ABsoluteQPCRROXMix(ABgene，Surrey,英國)，實施三次PCR反應。使用如ABIPrism7700SequenceDetectionSystemUserBulletin#2(AppliedBiosystems,FosterCity,力卩利福尼亞)中所述相對標準曲線方法，進行相對cDNA濃度的定量。將Genechip分析中具有各種基因最大表達量的一種cDNA，用于生成相對標準曲線。顯示所有數據與內部GAPDH的表達有關。證明在新鮮和日齡的單核細胞中的APAF-I和CDCA2效應蛋白，相對于GAPDH分別減少了至少2.5倍和3倍。表15:引物<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>實施例10:比較通過從供體分離后在室溫下溫育23、48或71小時的PBMC所制備的一對狀細胞方法過夜運輸后，接受來自兩個供體的"健康供體"白細胞分離產物。在如下所示的分離收集后的給定時間中，對用于生成DC的約三分之一的各種產物進行加工。在進行如下所述Ficoll-淋巴細胞分離液(Hist叩aque)密度梯度離心和附著步驟之前，將白細胞分離產物(即PBMC)在室溫下溫育23、48或71小時。室溫溫育期之后，測定PBMC的存活力和B細胞、T細胞、單核細胞以及NK細胞的百分比。結果如表16所示。表16:鑒定第O天培養的細胞產物<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>通過Ficoll-淋巴細胞分離液密度離心制備PBMC,并在PBS中于室溫洗滌四次。將2xl08PBMC重懸浮在30ml的AIM-V培養基(Invitrogen)中，并在37°C下使其附著于150cn^的塑料燒瓶。除去非附著細胞，將剩余細胞在補充了1000U/ml的GM-CSF(Leukine)和1000U/ml的IL-4(R&D系統)的X-VIV015培養基中，于37。C、5%C02下培養5天。最初，通過添加TNF-a(10ng/ml)、IFN-Y(1000U/ml)和PGE2(l昭/ml)，使未成熟DC成熟。過夜培養后通過除去培養基并用冰PBS洗滌，以收集TIP-DC中間產物。鑒定TIP-DC表型，證實了細胞成熟種群的生成。為了生成抗原負載、使DC完全成熟，電穿孔TIP-DC:將細胞以4x107/ml濃度重懸浮在0.5ml的冰Viaspan中，并置于冰上。使用l貼/106細胞的擴大總腫瘤腎細胞癌mRNA(作為編碼抗原的有效負載)，加上4嗎/106的CD40LmRNA,以混合DC，并置于4mm缺口的電穿孔管中，隨后使用BioradGenePulsarXcell系統進行電穿孔。電穿孔后，立即將DC在X-VIVO15培養基中洗滌，最后以1x106/ml濃度重懸浮在補充了GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的20mlX-VrV015中，并在低附著性T75燒瓶中于37°C培養4小時。使用如制造商所述硤化丙咬和CalTag計數微珠，測定細胞數和存活力。將Ficoll梯度離心后的PBMC樣品、第6天的TIP-DC、電穿孔和培養(PME-CD々0LDC)4小時后回收的DC，以及解凍后的最終產物，都進行細胞計數和存活力分析。結果如表17所示。表17:PME-CD40LDC的生成中，DC的回收率和產量.<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>所有抗體都來自BDBiosciences,并根據制造商建議的稀釋度進行使用。PBMC:使用CD19-PE、CD14-PE和CD3-PE中的各種，染色3xl()S細胞，或者通過在抗體中于4°C溫育30分鐘，來匹配同型偶聯的對照。溫育后，在冰1%FBS/PBS中3次洗滌染色細胞，并重懸浮PBS中，然后使用CellQuest軟件(BDBiosciences),通過FACScalibur流式細胞^義(BDBiosciences)進行熒光分析。在纟果測前3分鐘，將-典化丙啶(l貼/ml)加入各個樣品，以作為用于指示存活力目的的著色劑。DC:將lx106細胞(TIP-DC和PME-CD40LDC)重懸浮在冰PBS/1%FBS中。使用lxl0V孔的DC,混合偶聯了MHC分子(HLA-ABC、HLA-DR)的特異抗體的PE或FITC、或者混合共刺激分子(CD80、CD86)、或混合成熟標記(CD83)以及單核細胞標記/DC系標記(CD14、CD209),并在4°C下溫育至少l5分鐘。將同型匹配抗體作為對照。徹底洗滌后，將細胞進4亍如上所述流式細月包術。如下所示測定月包內CD40L:將2xl05的PME-CD40LDC重懸浮在250)ti1的Cytofix/Cytoperm溶液(BDBiosciences)中，并置于4°C最短10分鐘、最長2小時。用2ml染色緩沖液(PBS、BSA、NaN3以及EDTA)兩次洗滌細胞，重懸浮在0.5ml染色緩沖液中并于4°C過夜保存。將細胞在2.0mlPerm/洗液(BDBiosciences)中重懸浮15分鐘，離心并重懸浮在lOOpl的Perm/洗液中。將20^1鼠抗人CD40LAPC或鼠IgGlAPC加入各個DC制品，并在黑暗中于4°C溫育30分鐘。用1ml的Perm/洗液兩次洗滌細胞，并在進行流式細胞術分析之前重懸浮在染色緩沖液中。結果如表18所示。表18:中間TIP-DC和最終PME-CD40LDC產物的表型<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>應當理解的是，本文中描述的具體實施方案是用于舉例說明而非限制本發明。各種實施方案可使用本發明的主要特征而不脫離本發明的范圍。本領域技術人員可認可或能確定使用許多不超過常規實驗的、本文所述具體方法的等效方法。所述等效方法被認為是落入本發明范圍內，并被權利要求所覆蓋。說明書中提到的所有出版物和專利申請，可指導本發明所屬領域的技術人員的技能水平。以達到與引入被具體和分別說明的各種單個出版物或專利申請作為參考的相同程度，將所有出版物和專利申請以及特別是其相關部分引入本文以作為參考。根據本說明書而不需要過多的實驗，可獲得和實施本文中所公開合物和/或方法。當根據優選實施方案來描迷本發明的組合物和方法時，對本領域技術人員顯而易見的是可改變本文所述組合物和/或方法以及方法中的步驟或步驟順序，而不脫離本發明的原理、精神和范圍。更具體地說，當能達到相同或相似的結果時，化學和生理上都相關的一些試劑顯然可取代本文中所述試劑。對本領域技術人員顯而易見的是，如附屬權利要求所限定的，所有這些相似的替代方式和修飾，被認為落在本發明的精神、范圍和原理中。表16中來自兩個獨立實驗的數據表明，來自患者的分離白細胞產物，靜置直至72小時后可產生高活力的群體，并且在回收的白細胞亞組沒有顯著的偏差。盡管使用分離產物的DC總回收率在延長的周期中的確下降(表17)，使用PBMC在每個時點接種燒瓶、并培養以生成成熟DC(TIP-DC),可獲得高頻率的活細胞。然而，通過用所有擴增的腫瘤RNA和CD40LRNA,可生成用于進一步加工的充足DC。最重要的，表17和表18表明從各種起始產物所生成的TIP-DC進行了相同的電穿孔，并且和具有完全成熟為最終產物PME-CD40LDC的相同回收率。從該研究所生成的PME-CD40LDC，可制成"疫苗"，并可進行冷凍和解凍而不出現DC制品的任何變質。總之，收集后直至72小時，分離白細胞產物是用于統一生產門診中所用DC疫苗的活性原料。權利要求1.一種用于從單核細胞制備樹狀細胞的方法，所述方法包括b.提供從分離自個體起已在1℃-34℃溫育約6至96小時周期的單核細胞；和；c.誘導所述單核細胞分化成樹狀細胞。2.權利要求l中所述方法，其中單核細胞是人單核細胞。3.權利要求l中所述方法，其中溫育溫度是6。C-28。C。4.權利要求4中所述方法，其中溫育溫度是8°C-26°C。5.權利要求l中所述方法，其中溫育周期是8至48小時。6.權利要求5中所述方法，其中溫育周期是10至30小時。7.權利要求l中所述方法，其中溫育周期是26至72小時。8.權利要求l中所述方法，其中溫育周期是48至80小時。9.權利要求1中所述方法，其中通過將單核細胞接觸包含可誘導單核細胞分化成未成熟樹狀細胞的有效量組合物的培養基，進行誘導分化。10.權利要求9中所述方法，其中組合物是GM-CSF和IL-4;GM-CSF和IL-13;GM-CSF和IL-15;或IFNa。11.權利要求1中所述方法，其中在全部或部分的溫育周期中，單核細胞和外周血單核細胞(PBMC)—起存在。12.權利要求11中所述方法，其中通過白細胞分離術，從個體分離PBMC。13.權利要求ll中所述方法，其中在溫育期之中或之后，從PBMC富集單核細胞。14.權利要求13中所述方法，其中通過淘析、稀釋Ficoll梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心或^t珠分選，從所述PBMC富集單核細胞。15.權利要求13中所述方法，其中通過使得單核細胞附著于塑料，在溫育期之后從PBMC富集單核細胞。16.權利要求9中所述方法，還包括使未成熟樹狀細胞成熟為成熟樹狀細胞的步驟。17.權利要求16中所述方法，還包括將一種或多種抗原負載到所述成熟樹狀細胞中。18.權利要求16中所述方法，其中步驟包括將未成熟樹狀細胞接觸PGE2、TNFa、IL-6和IL畫1卩。19.權利要求16中所述方法，其中所述步驟包括用IFN-Y標志所述未成熟樹狀細胞，隨后用CD40L標志樹狀細胞。20.權利要求19中所述方法，其中樹狀細胞中的重組CD40LmRNA的翻i,可影響所述標志和CD40L。21.權利要求16中所述方法，其中所述步驟包括將未成熟樹狀細胞4妄觸PGE2、TNFa和IFNy,以產生成熟樹狀細胞。22.權利要求21中所述方法，還包括用編碼CD40L的RNA和/或編碼一種或多種抗原或目的表位的RNA,來轉染所述成熟樹狀細胞。23.權利要求22中所述方法，其中RNA編碼一種或多種癌細胞抗原。24.權利要求22中所述方法，其中RNA編碼一種或多種病原體抗原。25.權利要求1中所述方法，還包括將樹狀細胞負載一種或多種抗原，以生產抗原負載的樹狀細胞。26.權利要求25中所述方法，其中抗原是個體自體的。27.權利要求25中所述方法，其中通過用一種或多種編碼所述抗原的RNA轉染所述樹狀細胞，以負載所述抗原。28.權利要求27中所述方法，其中通過電穿孔，用RNA轉染樹狀細胞。29.權利要求27中所述方法，其中用約l-4貼RNA/10s樹狀細胞，來轉染所述細胞。30.權利要求25中所述方法，其中在進行抗原負載時，所述樹狀細胞是未成熟的。31.權利要求30中所述方法，還包括使所述抗原負載的未成熟樹狀細胞成熟為抗原負載的成熟樹狀細胞。32.權利要求25中所述方法，其中抗原來自于或衍生于一種或多種癌細胞或病原體。33.權利要求32中所述方法，其中癌選自腎細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、胃癌和胰腺癌。34.權利要求32中所述方法，其中所述病原體是HTV或HCV。35.—種將樹狀細胞疫苗施用給個體的方法，所述方法包括a)解凍包含了至少2%DMSO的冷凍樹狀細胞疫苗，和.b)在施用前，不改變細胞對DMSO的比值，將所述解凍疫苗施用給個體。36.權利要求44中所述方法，其中冷凍疫苗中的DMSO濃度是約10%。37.權利要求44中所述方法，其中通過權利要求16中的方法制備樹狀細胞。38.抗原負載的樹狀細胞在制備用于治療或預防癌癥或病原體感染的冷凍藥物中的用途，其中藥物包含至少2%DMSO，并且以備解凍就使用。39.^L利要求38中所述用途，其中藥物包含至少10%DMS〇。40.包含通過權利要求16中所述方法制備的樹狀細胞的組合物。41.權利要求40中所述組合物，其中樹狀細胞是抗原負載的。42.權利要求41中所述組合物，其中用編碼CD40L的mRNA轉染樹狀細胞。43.權利要求40中所述組合物，其中與從新鮮單核細胞制備的成熟樹狀細胞相比，成熟樹狀細胞提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類分子或MHC-II類分子的水平。44.包含成熟單核細胞衍生的樹狀細胞的組合物，其中與從新鮮單核細胞所制備的成熟樹狀細胞相比，成熟樹狀細胞提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類分子或MHC-II類分子的水平。45.^又利要求44中所述組合物，其中用編碼CD40L的mRNA瞬時轉染成熟樹狀細胞。46.成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的ALOX15RNA對(3-肌動蛋白RNA或GAPDHRNA的穩定狀態比值小于1.0。47.權利要求46中所述樹狀細胞，其中比值是在0.2至0.7之間。48.權利要求47中所述樹狀細胞，其中比值是在0.4至0.5之間。49.成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的CD52RNA對卩-肌動蛋白RNA或GAPDH的穩定狀態比值大于1.0。50.權利要求49中所述樹狀細胞，其中比值是在1.2至5.0之間。51.權利要求50中所述樹狀細胞，其中比值是在l.5至2.2之間。52.權利要求51中所述樹狀細胞，其中比值是在1.8至1.9之間。53.成熟單核細胞衍生的樹狀細胞，其中細胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1卩RNA或CD69RNA對卩-肌動蛋白RNA或GAPDHRNA的穩定狀態比值小于1.0。54.權利要求53中所述樹狀細胞，其中比值是在0.2至0.9之間。55.權利要求54中所述樹狀細胞，其中比值是在0.5至0.8之間。56.包含權利要求40-55任何一項所述組合物的疫苗。全文摘要提供用于從分離自個體起已在1℃-34℃下保持約6至96小時周期的單核細胞中生產樹狀細胞的方法。溫育期之后，然后誘導單核細胞分化成樹狀細胞。與從分離自個體起已在1℃-34℃下沒有保持至少6小時的單核細胞中所制備的成熟樹狀細胞相比，通過本發明方法所制備的成熟樹狀細胞，提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類分子或MHC-II類分子的水平。通過本發明方法所制備的樹狀細胞，可用于制備疫苗和刺激T細胞。文檔編號C12N5/0784GK101155914SQ200680011380公開日2008年4月2日申請日期2006年4月7日優先權日2005年4月8日發明者I·切爾帕諾瓦,L·丁特曼,R·波格-卡利,T·莫內史密斯申請人:阿戈斯治療公司;麒麟制藥株式會社