原種事件a2704-12以及用于鑒定生物樣品中此事件的方法和試劑盒的制作方法

專利名稱：：原種事件a2704-12以及用于鑒定生物樣品中此事件的方法和試劑盒的制作方法原種事件A2704-12以及用于鑒定生物樣品中此事件的方法和試劑盒發明領域本發明涉及用于鑒定生物學樣品中存在包含特異性轉化事件A2704-12的植物材料的方法和試劑盒，以及包含此事件的轉基因大豆植物、植物材料和種子。本發明的大豆植物組合了除草劑耐受表型與農學性能、遺傳穩定型以及對相當于在缺乏雜草壓力下的非轉化大豆品系的不同遺傳背景的適應性。發明背景置兩者決定。同時，轉基因(在外源DNA中)存在于基因組中的不同位置會以不同方式影響植物的總體表型。在農業或工業上通過遺傳^作成功地向植物中引入在商業上感興趣的性狀是一個依賴不同因素的復雜過程。遺傳轉化植物的實際轉化和再生僅僅是一系列選擇步驟的第一步，這一系列選擇步驟包括廣泛的遺傳描述、培育和田地性狀評估，最終選擇出原種事件。鑒于在NovelFood/Feed,segregationofGMO和non國GMOproducts和theidentificationofproprietary材料中的討論，對原種事件的明確鑒定正變得日益重要。理論上，此鑒定方法既快又簡單，無需廣泛的實驗室組織。此外，方法應該提供允許在無專家判讀的情況下0艮據需要，在專家審查時也有效)明確確定原種事件的結果。在通過用包含合成的/;W基因(編碼對草銨膦(phosphinothricin)耐受)的質粒轉化大豆來開發對除草劑Liberty⑧具有抗性的大豆(GlycinemaxL.)的過程中作為原種事件選擇出A2704-12，并且其可以作為LibertyLink大豆商業購買。本文描述了用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的簡單且明確方法中的工具。發明簡述本發明涉及用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的方法，其中該方法基于特異性識別A2704-125，和/或3，側翼序列的引物或探針。更加具體而言，本發明還涉及一種方法，其包括使用至少2個引物的聚合酶鏈式反應擴增生物學樣品中存在的核酸序列，其中一個引物識別A2704-12的5，或3，側翼區，而另一個引物識別外源DNA內的序列，以便優選得到100和500bp之間的DNA片段。引物可分別識別A2704-125，側翼區(SEQIDNo.1中從位置1至位置209)或A2704-123'側翼區(SEQIDNo2中從位置569至位置1000的互補序列)內的序列和外源DNA(SEQIDNo1中從位置210至位置720的互補序列或SEQIDNo2中從位置1至位置568)。識別5，側翼區的引物可包含本文所述的核苷酸序列SEQIDNo.4,并且識別外源DNA內的序列的引物可包含本文所述的核苷^列SEQIDNo.8。本發明更加特別地涉及用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的方法，其中方法包括使用分別具有核苷酸序列SEQIDNo.4和SEQIDNo.8的兩個引物的聚合i^式反應擴增在生物學樣品中存在的核酸序列，以得到約185bp的DNA片段。本發明還涉及本文所述的A2704-12的特異側翼序列，其可以用于開發特異性鑒定生物學樣品中A2704-12的方法。更加具體而言，本發明還涉及A2704-12的5，和/或3，側翼區，其可用于開發如本文進一步描述的特異性引物和探針。本發明還進一步涉^L^于使用此類特異性引物或探針鑒定生物學樣品中A2704-12存在的方法。由選自SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核普酸569至核苷酸1000的核苷酸序列的互補序列中的17至約200個連續核苷酸的核苷酸序列組成的引物與由選自SEQIDNo1中從核苷酸210至核苷酸720的核苷酸序列的互補序列或SEQIDNo2中從核苷酸1至核苷酸569的核苷酸序列中的17至約200個連續核苷酸的核苷*列的引物相組合。引物還可在其最3，末端包含這些核苷酸序列并且進一步包含無關序列或從所述核苷酸序列衍生但包含錯配的序列。本發明還涉及用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的試劑盒，所述試劑盒包含至少一個特異性識別A2704-125，或3'側翼區的引物或探4h本發明的試劑盒除了包含特異性識別A2704-125，或3，側翼區的引物外，還包含用于PCR鑒定方案的特異性識別A2704-12的外源DNA內序列的第二個引物。優選地，本發明的試劑盒包含兩個特異性引物，其中一個識別A2704-12的5，側翼區內的序列，并且另一個識別外源DNA內的序列。特別地，識別5，側翼區的引物可包含核苷酸序列SEQIDNo.4并且識別轉基因的引物可包含核苷g列SEQIDNo.8或本文所述的任何其它引物。本發明還涉及用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的試劑盒，所述試劑盒包含用于本文所述A2704-12的PCR鑒定方案的具有核苷酸序列SEQIDNo.4和SEQIDNo.8的PCR引物。本發明還涉及用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的試劑盒，其中試劑盒包含特異性探針，所述特異性探針具有的序列相當于(或互補于)與A2704-12特異性區域具有80%和100%間序列同一性的序列。優選地，探針的序列相當于包含A2704-12的部分5，或3，側翼區的特異性區域。最優選地，特異性探針具有(或互補于)與SEQIDNo.1中核苦酸160和260間的序列或者SEQIDNo2中核苷酸520和620間的序列具有80%和100%間序列同一性的序列。本發明包含的方法和試劑盒可用于不同的目的，例如但不限于下列鑒定植物、植物材料或產品(例如但不限于包含植物材料或衍生自植物材料的食物或祠料產品(新鮮的或加工的))中A2704-12存在與否；額外地或備選地，本發明的方法和試劑盒可用于鑒定轉基因植物材料以便分離轉基因和非轉基因材料；額外地或備選地，本發明的方法和試劑盒可用于確定包含A2704-12的植物材料的質量(即材料的純度百分數)。本發明還涉及A2704-12的5，和/或3，側翼區以及從A2704-125，和/或3，側翼序列開發的特異性引物和探針。本發明還涉及包含原種事件A2704-12的大豆植物、其部分、細胞、種子和后代植物。此類植物、其部分、細胞、種子和后代植物可以使用本文所述的方法鑒定。發明詳述重組DNA分子整合至植物基因組通常會源于細胞或組織的轉化(或源于另一種遺傳操作)。在特定位點的整合或者是"隨機"整合或者是在預定位點整合(如果使用靶向整合方法的話)。因用重組DNA或"轉化性DNA，，轉化植物細胞或組織而引入到植物基因組中并且來源于此轉化性DNA的DNA在下文稱作包含一個或多個"轉基因"的"外源DNA"。在本發明上下文中"植物DNA"指源自已轉化植物的DNA。植物DNA通常將在相應野生型植物的同一遺傳基因座中找到.外源DNA可通過重組DNA分子在植物基因組中整合位點的位置和構型表征。重組DNA所插入的植物基因組的位點也稱作"插入位點"或"耙位點"。重組DNA向植物基因組內的插入可以伴隨著植物DNA的刪除，這稱作"靼位點刪除"。如本文所用的"側翼區"或"側翼序列"指位于外源DNA即刻上游并與^目連或者位于外源DNA即刻下游并與之相連的植物基因組中的至少20bp、優選地至少50bp并且至多5000bp的序列。導致外源DNA隨機整合的轉化方法將產生具有不同側翼區(對于每一轉化體其為特征性的和唯一的)的轉化體。當重組DNA通過傳統雜交引入植物中時，其在植物基因組中的插入位點或者其側翼區通常沒有改變。如本文所用的"插入區，，指對應于由包含植物基因組中外源DNA的上游和/或下游側翼區的序列所包含的至少40bp、優選地至少100bp和至多10000bp的區域。考慮到由于物種內突變所產生的微小差異，當雜交^同一物種的植物中時，插入區會保留與包含源自最初轉化的植物中外源DNA的上游和下游側翼區的序列具有至少85%、優選地卯％、更優選地95%和最優選地100%序列同一性。事件被定義為源自遺傳工程的(人造的)遺傳基因座，其攜帶有包含至少一個拷貝目的基因的轉基因。事件的典型等位基因狀況為存在或缺乏外源DNA。事件的表型特征為轉基因的表達。在遺傳水平，事件是植物的遺傳結構的一部分。在分子水平，事件可通過限制性酶鐠(例如通過Southern印跡所確定)、通過轉基因上游和/或下游側翼序列、分子標記物的位置和/或轉基因的分子構型來表征。通常，用包含至少一個目的基因的轉化性DNA轉化植物導致產生多個事件，而每一個事件都是唯一的。如本文所用，原種事件是基于轉基因的表達和穩定性以及其與包含其的植物的最優農學特性相容性，而選自通過用相同的轉化性DNA轉化或者通過與此類轉化所得的植物回交所得到的事件。因此，原種事件選擇標準為一個或多個，優選兩個或多個，有利地是下列全部a)外源DNA的存在不損害植物的其它目的特征，例如與農學性能或商業價值有關的那些特性；b)事件通過能夠穩定遺傳并且對此可開發用于鑒定對照的適宜工具的明確分子構型表征；c)在攜帶事件的植物于正常農業用途中很可能暴露的環境條件下，目的基因表現出在事件的雜合(或半雜合)和純合條件下均以商業可接受的水平正確、適當和穩定的空間和時間表型表達。優選外源DNA與允許容易地向目的商業遺傳背景進行基因滲入的植物基因組中的位置關聯。作為原種事件的事件的狀況通過原種事件向不同相關遺傳背景的基因滲入以;SJ見察是否遵從例如上面a)、b)和c)中的一個、兩個或全部原則來證實。因此，"原種事件，，指符合上述原則的包含外源DNA的遺傳基因座。植物、植物材料或后代，例如種子可在其基因組中包含一個或多個原種事件。開發鑒定原種事件或者包含原種事件的植物、植物材料或者包含含有原種事件的植物材料的產品的工具U于原種事件的特異性基因組特性，例如包含外源DNA的基因組區域的特異性限制性酶切圖鐠、分子標記物或外源DNA的側翼區序列。一旦測出了外源DNA的一個或兩個側翼區的序列，可通過分子生物學技術開發出特異性識別樣品的核酸(DNA或RNA)中該(這些)序列的引物和探針。例如，可開發PCR方法以鑒定生物學樣品(例如植物、植物材料或包含植物材料的產品的樣品)中的原種事件。此PCR基于至少兩個特異性"引物"，一個引物識別原種事件5，或3，側翼區內的序列，并且另一個識別外源DNA內的序列。引物優選具有在在最優化PCR條件下分別"特異性識別"原種事件5，或3，側翼區和原種事件外源DNA內序列的15和35個核苷酸之間的序列，以致于從包含原種事件的核酸樣品中擴增特異片段("整合片段"或辨別性擴增子)。這意味著在最優化PCR條件下僅僅所靶向的整合片段擴增而植物基因組或外源DNA中其它序列不擴增。適于本發明的PCR引物可以是下列引物-長度為17nt至約210nt的寡核苷酸，其在3，末端包含選自5，側翼序列(SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209)中的至少17個連續核苷酸、優選20個連續核苷酸的核苷酸序列(引物識別5，側翼序列)；或-長度為17nt至約450nt的寡核苷酸，其在3，末端包含選自3，側翼序列(SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列)中的至少17個連續核苷酸、優選20個連續核苷酸的核苷酸序列(引物識別3，側翼序列)；或-長度為17nt至約510nt的寡核苷酸，其在3，末端包含選自所插入的DNA序列(SEQIDNo1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列)中的至少17個連續核苷酸、優選20個核苷酸的核苷酸序列(引物識別外源DNA);或-長度為17nt至約570nt的寡核苷酸，其包^逸自所插入的DNA序列(SEQIDNo2中從核苦酸1至核苦酸569)中的至少17個連續核苷酸、優選20個核苷酸的核苷酸序列。當然，引物可長于所述的17個連續核苷酸并且可以是20、21、30、35、50、75、100、150、200nt或者更長。引物可以是完全由選自所述側翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列的核苦酸序列組成。然而，引物的5，末端核苷酸序列(即位于3，的17個連續核苷酸之夕卜)不是關鍵的。因此，引物的5，序列可以根據需要由選自側翼序列或外源DNA的核苷酸序列組成，但是可包含幾個(例如1、2、5、IO個)錯配。引物的5，序列甚至可以完全由與側翼序列或外源DNA無關的核苷酸序列組成，例如代表限制性酶識別位點的核苷酸序列。此類無關序列或具有錯配的側翼DNA序列應該優選地不長于IOO、更優選地不長于50或者甚至25個核苷酸。此外，適宜的引物可在其3，末端包含跨越植物DNA所衍生序列和外源DNA序列的序列(位于SEQIDNo1中的核苷酸209-210和SEQIDNo2中的核普酸568-569)或者其3，末端由跨越植物DNA所衍生序列和外源DNA序列的序列(位于SEQIDNo1中的核苷酸209-210和SEQIDNo2中的核苷酸568-569)組成，其前M所述的位于3，的17個連續核苷酸不是專有地衍生自SEQIDNo1或2中的外源DNA或植物所衍生序列。因此，適于本發明的PCR引物還可以是下列引物-長度為17nt至約210nt的寡核苷酸，其在3，末端包^逸自SEQIDNo1中從核普酸l至核苷酸215中的至少17個連續核苷酸、優選20個連續核苷酸的核苷酸序列；或誦長度為17nt至約450nt的寡核苷酸，其在3，末端包M自SEQIDNo2中從核苷酸554至核苷酸1000的互補序列中的至少17個連續核苷酸、優選20個連續核苷酸的核苷酸序列；或-長度為17nt至約510nt的寡核苷酸，其在3，末端包M自SEQIDNo1中從核苷酸195至核苷酸720的互補序列中的至少17個連續核苷酸、優選20個核苷酸的核苷酸序列；或-長度為17nt至約570nt的寡核普酸，其包含選自SEQIDNo2中從核苷酸1至核苷酸584中的至少17個連續核苷酸、優選20個核普酸的核苷酸序列。本領域技術人員馬上會明白，正確選擇的PCR引物對還不包含彼此互補的序列。為了本發明的目的，"SEQIDNo:X所示核苷酸序列的互補序列"是這樣的核苷酸序列，即通過將核苷酸替換成基于Chargaff規則(AAT;G<C)的互補核苷酸并且以5，至3，方向(即所示核普酸序列的相反方向)讀取而自所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。適宜引物的實例是寡核苷紗列SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5(識別5，側翼序列的引物)SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNo10、SEQIDNo11(識別外源DNA的引物，與識別5，側翼序列的引物一起4吏用)SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14、SEQIDNol5(識別外源DNA的引物，與識別3，側翼序列的引物一起使用)SEQIDNo16、SEQIDNo17、SEQIDNo18或SEQIDNo19(識別3，側翼序列的引物)。適宜寡核苷酸引物的其它實例在其3'末端包含下列序列或者其3，末端由下列序列組成a.識別5，側翼序列的引物-SEQIDNo1中從核苷酸23至核苷酸42的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核普酸68至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸69至核苷酸87的核苷酸序列隱SEQIDNol中從核苷酸69至核苷酸88的核苷^列-SEQIDNo1中從核苷酸134至核苷酸153的核普酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸22至核苷酸42的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸30至核苷酸49的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸67至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸70至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸70至核苷酸88的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸76至核苷酸95的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸78至核苷酸97的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸133至核苷酸152的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸21至核苷酸42的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸31至核苷酸49的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸34至核苦酸63的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸66至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸68至核苷酸88的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸73至核苷酸92的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸75至核普酸95的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸77至核苷酸97的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸77至核苦酸95的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸134至核苷酸152的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸154至核苷酸173的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸22至核苷酸43的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸33至核苷酸53的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸35至核苷酸53的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸67至核苷酸88的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸72至核苷酸92的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸74至核苷酸92的核苷酸序列-SEQIDNol中從核香酸76至核苷酸97的核苦酸序列-SEQIDNo1中從核香酸78至核苷酸95的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸135至核苷酸152的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸154至核苷酸171的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸32至核苷酸53的核苷酸序列-SEQIDNol中從核苷酸36至核苦酸57的核普酸序列-SEQIDNol中從核苷酸71至核普酸92的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸74至核苷酸95的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸75至核苷酸92的核普酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸32至核苷酸51的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苦酸31至核苷酸51的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸33至核苷酸51的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸30至核苷酸51的核苷酸序列-SEQIDNo1中從核苷酸34至核苷酸51的核苦酸序列-SEQIDNo1中從核苦酸205至核苷酸226的核苷酸序列b.識別外源DNA序列的引物，與識別5，側翼序列的引物一起^f吏用-SEQIDNo1中從核苷酸201至核苷酸220的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸220至核苷酸239的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸361至核苷酸380的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸366至核苷酸385的核苷紗列的互補序列國SEQIDNo1中從核苷酸201至核苷酸219的核普絲列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸220至核苷酸238的核苷紗列的互補序列畫SEQIDNo1中從核普酸221至核苷酸239的核普絲列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸358至核苷酸377的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸359至核苷酸378的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸361至核苷酸379的核普酸序列的互補序列國SEQIDNo1中從核苷酸366至核苷酸384的核苷,列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸368至核苷酸387的核苷酸序列的互補序列國SEQIDNo1中從核苷酸496至核苷酸515的核苦紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸656至核苷酸675的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸201至核苷酸218的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸220至核苷酸237的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸221至核苷酸238的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸220至核苷酸240的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸221至核苷酸240的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸251至核苷酸270的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸252至核苷酸271的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸253至核苷酸272的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸359至核苷酸377的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸361至核苷酸378的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸358至核普酸378的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸359至核苷酸379的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核香酸361至核苷酸382的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸366至核苷酸383的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸368至核苷酸386的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸366至核苷酸386的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸375至核苷酸393的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸375至核苷酸394的核苷紗列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸496至核苷酸514的核苷紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸498至核苷酸515的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸562至核苷酸581的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸608至核苷酸627的核苷紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸651至核苷酸670的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸655至核苷酸674的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸656至核苷酸674的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸656至核苷酸676的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸669至核香酸678的核香酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸252至核苷酸270的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸253至核苷酸271的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸251至核苷酸271的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸252至核苷酸272的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸267至核苷酸286的核苷酸序列的互補序列誦SEQIDNo1中從核苷酸359至核苷酸376的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸358至核苷酸379的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸362至核苷酸379的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸359至核苷酸380的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸368至核苷酸385的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸368至核苷酸388的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸375至核苷酸392的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸376至核苷酸393的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸376至核苷酸394的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸376至核苷酸395的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸440至核普酸459的核香酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸442至核苷酸461的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸496至核苷酸513的核苷,列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸556至核普酸575的核香酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸558至核苷酸577的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸561至核苷酸580的核苦酸序列的互補序列國SEQIDNo1中從核苷酸563至核苷酸582的核苦紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸562至核苷酸582的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸608至核苷酸628的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸637至核苷酸656的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸644至核苷酸663的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸651至核苷酸669的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸651至核苷酸671的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸656至核苷酸673的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸655至核普酸675的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸659至核苷酸677的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸659至核苷酸679的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸201至核苷酸222的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸204至核苦酸225的核苷酸序列的互補序列誦SEQIDNo1中從核苦酸223至核苷酸240的核苦^^列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸223至核苷酸241的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸220至核普酸241的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸221至核苷酸241的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸253至核苷酸270的核苷酸序列的互補序列隱SEQIDNo1中從核苷酸251至核苷酸272的核苷絲列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸252至核苷酸273的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸253至核普酸274的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸268至核苷酸289的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸377至核苷酸394的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸375至核苷酸395的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸440至核苷酸458的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸442至核苷酸460的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸440至核苷酸460的核苷紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸442至核普酸462的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸492至核苷酸513的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo1中從核苷酸503至核苷酸522的核苷紗列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸556至核苷酸574的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸556至核普酸576的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸562至核苷酸579的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸563至核苷酸581的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸563至核苷酸583的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸562至核苷酸583的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苦酸608至核苷酸625的核苷酸序列的互補序列國SEQIDNo1中從核苷酸608至核苷酸629的核苷絲列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸644至核苷酸662的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸651至核苷酸668的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸651至核苷酸672的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸655至核苷酸676的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸655至核苷酸677的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸659至核苷酸680的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸657至核苷酸688的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸223至核苷酸242的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸267至核普酸288的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸368至核苷酸389的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸375至核苷酸396的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸376至核苷酸397的核苦酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸440至核苷酸457的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸442至核苷酸459的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸442至核苷酸463的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸534至核苷酸553的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸558至核苷酸575的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸556至核苷酸577的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸563至核苷酸580的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸563至核苷酸584的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸644至核苷酸661的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸645至核苷酸662的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸644至核苷酸665的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸645至核苷酸666的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核普酸325至核苷酸342的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸503至核苷酸520的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸534至核苷酸554的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸221至核苷酸242的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸505至核苷酸522的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸534至核苷酸551的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸534至核苷酸555的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸536至核苷酸557的核普酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸551至核苷酸570的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸551至核苷酸571的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo1中從核苷酸551至核苷酸572的核苷酸序列的互補序列c.識別外源DNA序列的引物，與識別3，側翼序列的引物一起4吏用-SEQIDNo2中從核苷酸955至核苷酸974的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸955至核苷酸973的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸955至核苷酸972的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸958至核苷酸975的核苷酸序列的互補序列畫SEQIDNo2中從核苷酸958至核苷酸977的核苷斷列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸917至核苷酸934的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸947至核苷酸968的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸951至核苷酸968的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸951至核苷酸972的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸958至核苷酸976的核苷酸序列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸955至核苷酸976的核苷絲列的互補序列-SEQIDNo2中從核苷酸958至核苷酸979的核苷酸序列的互補序列d.識別3，側翼序列的引物-SEQIDNo2中從核苷酸151至核苷酸170的核苦酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸152至核苷酸171的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸6至核苦酸25的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸148至核苷酸167的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸151至核苷酸171的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸152至核苷酸170的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸153至核苷酸171的核香酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸5至核苷酸25的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸7至核苷酸25的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸67至核苷酸86的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸89至核普酸108的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸134至核苷酸153的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸147至核苷酸167的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸150至核苷酸171的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸153至核苷酸170的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸154至核苷酸171的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸168至核苷酸187的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苦酸169至核苷酸187的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸171至核苷酸l卯的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸197至核苷酸216的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸236至核苷酸255的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸280至核苷酸299的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸4至核苷酸25的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苦酸8至核苷酸25的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸63至核苷酸82的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸66至核苷酸86的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸68至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸90至核普酸108的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸93至核苷酸112的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸94至核苷酸113的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸96至核苷酸115的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸101至核苷酸120的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸134至核苷酸154的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸146至核苷酸167的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸150至核苦酸167的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸170至核苷酸190的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸172至核普酸190的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸186至核苷酸205的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸189至核苷酸208的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸l卯至核苷酸209的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸191至核苷酸210的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸195至核苷酸214的核香酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸196至核苷酸216的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸196至核苷酸214的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸198至核苷酸216的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸199至核苷酸216的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸208至核苷酸227的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸234至核苷酸253的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苦酸235至核苷酸255的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸279至核苷酸299的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸281至核苷酸299的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸285至核苷酸304的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸296至核苷酸315的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸396至核苷酸415的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸64至核苷酸82的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸65至核苷酸86的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸67至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸75至核苦酸92的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸91至核苷酸108的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸92至核苷酸112的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸93至核苷酸113的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸94至核苷酸112的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸95至核苷酸115的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸95至核苷酸113的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸97至核苷酸115的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸100至核苷酸120的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸132至核苷酸153的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸133至核苷酸154的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸163至核苷酸182的核苷^列-SEQIDNo2中從核苷酸165至核香酸184的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸167至核苷酸187的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸169至核香酸190的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸173至核苷酸190的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸187至核苷酸205的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸189至核苷酸209的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸190至核苦酸210的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苦酸l卯至核苷酸208的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸191至核苷酸209的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸192至核苷酸210的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸194至核苷酸214的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸197至核苷酸214的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸233至核苷酸253的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸234至核苷酸255的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸235至核普酸253的核苷^列-SEQIDNo2中從核苷酸282至核苷酸299的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸295至核苷酸315的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸297至核苷酸315的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸397至核苷酸415的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸65至核苷酸82的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸66至核苷酸87的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸75至核苷酸96的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸91至核普酸112的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸92至核苷酸112的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸94至核苷酸115的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸95至核苦酸112的核普酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸98至核苷酸115的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸99至核苷酸120的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸162至核苷酸182的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸164至核苷酸182的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸164至核苷酸184的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸164至核苷酸184的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸184至核苷酸205的核苦酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸187至核苷酸208的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸188至核苷酸205的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸188至核苷酸209的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸189至核苷酸210的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸191至核普酸208的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸193至核苷酸214的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸205至核苷酸212的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸232至核苷酸253的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸236至核普酸253的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸242至核苷酸261的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸278至核苷酸299的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸283至核苷酸304的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸287至核苷酸304的核苷,列-SEQIDNo2中從核苷酸294至核苷酸315的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸298至核苷酸315的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸332至核苷酸349的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸398至核苷酸415的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸161至核苷酸182的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸163至核苷酸184的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸165至核苷酸182的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苦酸166至核苷酸187的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸241至核普酸261的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸243至核苷酸261的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸244至核苷酸261的核香酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸240至核苷酸261的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸126至核苷酸145的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸208至核普酸225的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸124至核苷酸145的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸75至核普酸94的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸231至核苷酸250的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸243至核苷酸262的核苦酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸230至核普酸250的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸232至核苷酸250的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸242至核苷酸262的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸244至核苷酸262的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸229至核苷酸250的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸241至核苷酸262的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸245至核苷酸262的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核普酸287至核苷酸306的核苷^列-SEQIDNo2中從核苷酸288至核苦酸306的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸230至核苷酸247的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸285至核苷酸306的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸289至核苷酸306的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸282至核苷酸303的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸288至核苷酸307的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸287至核苷酸307的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸289至核苷酸307的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸286至核苷酸307的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸290至核普酸307的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸229至核苷酸248的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸230至核苷酸248的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸227至核苷酸248的核苷酸序列-SEQIDNo2中從核苷酸231至核苷酸248的核苷酸序列。如本文所用，"核苷酸序列SEQIDNo.Z中從位置X至位置Y"指包括兩個核苷酸端點的核苷酸序列。優選地，整合片段長度在50和500個核苦酸之間，最優選地在100和350個核苷酸之間。特異性引物可以具有分別與原種事件5，或3，側翼區內的序列和原種事件外源DNA內的序列具有80和100%之間同一性的序列，其前提是錯配允許在最優化PCR條件下使用這些引物仍可特異性鑒定原種事件。然而，可允許的錯配范圍可以通過經驗容易地確定并且是本領域技術人員眾所周知的。下表例證了使用所選擇PCR引物對的預期擴增子(或整合片段)的大小。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>整合片段的檢測可以多種方式進行，例如通過凝膠分析后判斷大小。整合片段還可以直接測序。用于檢測擴增DNA片段的其它序列特異性方法也是本領域眾所周知的。由于對于每一原種事件而言，引物的序列和其在基因組中的相對位置都是唯一的，因此整合片段的擴增僅在包含原種事件(核酸)的生物學樣品中發生。優選地，當開展PCR來鑒定未知樣品中A2704-12的存在時，要包括一組對照引物，使用對照引物可以擴增出具有事件的植物物種的"看家基因"內的片段。看家基因是在大多數細胞類型中表達并且與所有細胞所共有的基礎代謝活動相關的基因。優選地，從看家基因擴增的片段是長于所擴增整合片段的片段。取決于待分析的樣品，可包括其它對照。標準PCR方案在本領域中已有描述，例如在"PCRApplicationsManual"(RocheMolecularBiochemicals，第2版，1999)中。對于每一原種事件，最優化PCR條件(包括特異性引物的序列)在"PCR鑒定方案"中說明。然而應當理解，PCR鑒定方案中的許多參數需要調整至特異的實驗室條件，并且可以稍稍修改以得到相似結果。例如，使用不同的DNA制備方法將需要調整例如所使用引物的數量、聚合酶和退火條件。相似地，選擇其它引物將決定著使用用于PCR鑒定方案的其它最優化條件。然而，這些調整對于本領域技術人員而言是顯而易見的，并且進一步描述于如上所引用的現行PCR擴增手冊中。備選地，特異性引物可用于擴增用作鑒定生物學樣品中A2704-12的"特異性探針"的整合片段。將生物學樣品與探針在允許探針與核酸中的相應片段雜交的條件下相接觸導致形成核^/探針雜合體。可以檢測這種雜合體的形成(例如標記核酸或探針)，由此這種雜合體的形成指示著A2704-12的存在。基于使用特異性探針(在固相載體或者溶液中)的雜交的此類鑒定方法在本發明中已有描述。特異性探針優選地是在優化條件下與原種事件5，或3，側翼區內的并且還優選包含與"M目連的部分外源DNA(以下稱作"特異性區域")的區域雜交的序列。優選地，特異性探針包含50和500bp間、優選100至350bp的與特異性區域核苷酸序列至少80%、優選地在80和85%之間、更優選地在85和卯％之間、特別優選地在卯和95°/。之間、最優選地在95%和100%之間相同(或互補)的序列。優選地，特異性揮:針將包含約15至約100個與原種事件的特異性區域相同(或互補)的連續核苷酸。如本文所用的"試劑盒"指用于開展本發明方法，更加具體而言是鑒定生物學樣品中的原種事件A2704-12的一組試劑。更加具體而言，本發明試劑盒的優選實施方案包含如上所述的至少一個或兩個特異性引物。任選地，試劑盒還可包含用于PCR鑒定方案的本文所述的任何其它試劑。備選地，根據本發明的另一個實施方案，試劑盒可包含如上所述的特異性探針，該特異性探針與生物學樣品中的核酸雜交以鑒定其中A2704-12的存在。任選地,試劑盒還可包含用于使用特異性探針鑒定生物學樣品中A2704-12的任何其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液、標記物)。為了質量控制(例如種子批的純度)、檢測植物材料或包含或衍生自植物材料的材料(例如但不限于食品或飼料產品)中的原種事件，可使用本發明的試劑盒，并且其成分可以特別調整。如本文所用，關于核苷酸序列(DNA或RNA)的"序列同一性"指具有相同核苷酸的位置數目除以兩個序列中較短序列的核苷酸數目。兩個核苷酸序列的比對通過Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann,1983，Proc.Nat.Acad.Sci.USA80:726)使用如下參數開展窗口大小20個核苷酸；字長4個核苷酸以及開口罰分4。計算機輔助分析以及序列數據的解釋(包括上述的序列比對)可以例如使用IntelligeneticsTMSuite(IntelligeneticsInc.，CA)或GeneticsComputerGroup的序列分沖斤軟件包(GCG,UniversityofWisconsinBiotechnologycenter)程序常規開展。當此類序列具有至少約75%、特別地至少約80%、更加特別地至少約85%、十分特別地約90%、尤其約95%、更加尤其約100%的序列同一性時，指示著序列是"基;M目似的"。很明顯，當說RNA序列與DNA序列基;M目似或者RNA序列與DNA序列具有一定程度的序列同一性時，認為DNA序列中的胸苷(T)等于RNA序列中的尿苷(U)。如本文所用的術語"引物"包含能夠在模板依賴的過程(例如PCR)中引發新生核酸合成的任何核酸。一般地，引物是10至30個核苷酸的寡核苷酸，但是可以采用更長的序列。引物可以以雙鏈形式提供，但優選單鏈形式。探針可用作引物，但是探針被設計成結合至靶DNA或RNA，并且不需要用于擴增過程。如本文所用的術語"識別，，當指特異性51物時是指在方法中所述條件下(例如PCR鑒定方案的條件)下特異性引物特異性雜交至原種事件中的核酸序列的事實，由此通過存在陽性和陰性對照來確定特異性。如本文所用的術語"雜交，，當指特異性探針是時指在標準嚴格條件下探針結合至原種事件核酸序列的特異性區域的事實。如本文所用的標準嚴格條件指用于本文所述雜交的條件或者指如Sambrooketal.，1989(MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NY)所述的常規雜交條件，其例如包含下列步驟1)將植物基因組DNA片段固定于濾器上；2)將濾器在50%甲酰胺，5xSSPE，2xDenhardt試劑和0.1%SDS中于42。C預雜交1至2小時，或者在6xSSC，2xDenhardt試劑和0.1%SDS中于68°C預雜交1至2小時；3)加入已經標記的雜交探針；4)孵育16至24小時；5)在lxSSC，0.1%SDS中室溫洗滌濾器20分鐘；6)在0.2xSSC，0.1%SDS中于68。C洗滌濾器三次，每次20分鐘；和7)將濾器在增感屏中于-70。C將X-光膠片曝光24至48小時。如本文所用，生物學樣品是植物、植物材料或包含植物材料的產品樣品。術語"植物"旨在包括任何成熟階段的大豆植物組織，以及從此組織取出或衍生的任何細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、拫、單細胞、結合體、細胞培養物、組織培養物或原生質體。如本文所用的"植物材料"指M物得到或衍生的材料。包含植物材料的產品涉及使用植物材料產生或摻有植物材料的食品、飼料或其它產品。在本發明上下文中應當理解，測試了此類生物學樣品中A2704-12特異性核酸的存在，暗示著樣品中存在核酸。因此，在本文中提到用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的方法指鑒定生物學樣品中包含原種事件的核酸。如本文所用的"包含"解釋為存在所指的確定特征、整數、步驟、試劑或成分，但不排除存在或加入一個或多個特征、整數、步驟或成分或其組。因此，例如包含核苷酸或M酸序列的核酸或蛋白質可以包含比實際所引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即包含更大的核酸或蛋白質。包含功能或結構明確的DNA序列的嵌合基因可以包含額外的DNA序列，等等。本發明還涉及在大豆中發生原種事件A2704-12，涉及包含該事件的植物、從這些植物得到的后代，以及涉及從該事件衍生的植物細胞或植物材料。包含原種事件A2704-12的植物如實施例1所述得到。包含A2704-12的大豆植物或植物材料可以根據在實施例2中對于A2704-12描述的PCR鑒定方案鑒定。簡言之，通過使用特異性識別A2704-125，或3'側翼序列內的序列的引物(例如具有SEQIDNO:4序列的引物)和識別外源DNA內序列的引物(例如具有SEQIDNO:8序列的引物)的PCR擴增生物學樣品中存在的大豆基因組DNA。擴增部分內源大豆序列的DNA引物用作PCR擴增的陽性對照。如果在擴增時從材料中獲得了預期大小的片段，則材料包含來自帶有原種事件A2704-12的大豆植物的植物材料。帶有A2704-12的植物通過其對草銨膦的耐受而^^征，其在本發明上下文中包括耐受除草劑LibertyTM的植物。對LibertyTM的耐受可以以不同方式測試。當需要辨別抗性植物和敏感植物而又不殺死敏感植物時，如本文所述的涂葉法是最有用的。備選地，可以通過Liberty噴霧施用測試耐受。噴霧處理應該在V3和V4葉階段間進行以便取得最佳結果。耐受植物通過如下事實表征，即用至少200克活性成分/公項(g.a丄/ha)、優選400g.a丄/ha和可能最多1600g.a丄/ha(4x正常的田間比率)向植物噴霧而不殺死植物。播,用應當以28-34ozLiberty的比率進行。最好使用扁扇型噴嘴以每英畝20加侖水的體積施用，同時注意不要向植物的輪生體內直接噴霧施用以避免表面活性劑灼傷葉子。除草劑的影響將在48小時內出現，并且在5-7天明顯可見。帶有A2704-12的植物可進一步通過其細胞中草銨膦乙酰轉移酶的存在來表征，草銨膦乙酰轉移酶的存在如通過PAT分析法(DeBlock等，1987)所確定。帶有A2704-12的植物還可以通過在缺乏雜草壓力和使用LibertyTM(用于雜草控制)的情況下具有與在美國可商業獲得的大豆變體中的農學特性可比的農學特性來表征。已經觀察到，如本文所述在大豆植物基因組的插入區域內存在外源DNA賦予包含該事件的植物特別感興趣的表型和分子特性。更加具體而言，在這些植物的該特定基因組區域內存在外源DNA導致產生目的基因穩定表型表達的植物，而植物的任何方面的期望農學特性沒有受到明顯損害。下列實施例描述了對用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的工具進行的鑒定。除非另外指出，所有重組DNA技術按照如Sambrook等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NY以及Ausubel等，(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA,第1和2巻中所述的標準方案進行。用于植物分子操作的標準材料和方法描述于PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，R.D.D.Croy編，BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications出版，UK。在說明書和實施例中，提到了下列序列SEQIDNo.1:包含A2704-125，側翼區的核香酸序列SEQIDNo.2:包含A2704-123，側翼區的核苦酸序列SEQIDNo.3:引物HCA148SEQIDNo.4:引物DPA021SEQIDNo.5:引物KVM176SEQIDNo.6:引物KVM174SEQIDNo.7:引物KVM177SEQIDNo.8:引物DPA024SEQIDNo.9:引物MDB390SEQIDNo.10引物HCA023SE(3IDNo.11引物DPA007SEQIDNo.12引物YTP007SEQIDNo.13引物MDB452SEQIDNo.14引物HCA014SEQIDNo.15引物MDB402SEQIDNo.16引物HCA074SEQIDNo.17引物SM0017SEQIDNo.18引物SM0027SEQIDNo.19引物SM0033SEQIDNo.20用于擴增對照片段的引物lSEQIDNo.21.用于擴增對照片段的引物2附圖簡述下面的實施例不旨在將本發明限制于所述的特定實施方案，可以結合附圖(在本文中整合作為參考)來理解下列的實施例。在附圖中圖l:所引用核苷^列和引物之間關系的框圖。黑條外源DNA;亮條植物來源的DNA;條下的數字代表核苷酸位置；(c)指所指出核苷^列的的互補序列。圖2:開發用于A2704-12的PCR鑒定方案。膠的上樣順序泳道l:來自包含轉基因事件A2704-12的大豆植物的DNA樣品；泳道2:來自不包含原種事件A2704-12的轉基因大豆植物的DNA樣品；泳道3:來自野生型大豆植物的對照DNA;泳道4:無模板對照；泳道5:分子量標準。實施例1.鑒定原種事件A2704-12的側翼區通過用包含/W基因編碼序列的載體轉化大豆開發出除草劑抗性大豆，其中/w,基因編碼草銨膦乙酰轉移酶并且處于花椰菜花葉病毒組成型35S啟動子的控制之下。基于大量的選擇過程選擇出原種事件A2704-12,這些選擇過程基于除草劑抗性基因的良好表達和穩定性以及其與最優化農學特性的相容性。使用Liu等(1995,PlantJ.8(3):457-463)所述的熱不對稱交錯(TAIL-)PCR方法確定A2704-12事件中外源DNA側翼區序列。該方法在連續的反應中使用3個巢式引物以及更短的任意簡并引物，從而通過熱來控制特異和非特異產物的相對擴增效率。選擇用于與外源DNA邊界退火的特異性引物，并且基于它們的退火條件來選擇。少量(5jil)的未純化(第二和第三)PCR產物在1%瓊脂糖皿上分析。第三PCR產物用于制備型擴增，純化后在自動序列儀上用DyeDeoxyTerminator循環試劑盒測序。1.1.右(5，)側翼區通過TAIL-PCR方法獲得的經鑒定包含5'側翼區的片段被完全測序(SEQIDNo.1)。核苷酸1和209間的的序列相當于植物DNA，而核苷酸210和720間的序列相當于外源DNA。1.2.左(3，)側翼區通過TAIL-PCR方法獲得的經鑒定包含3，側翼區的片段被完全測序(SEQIDNo.2)。核苷酸1和568間的序列相當于外源DNA，而核苷酸569和1000間的序列相當于植物DNA。2.開發聚合酶鏈式反應鑒定方案2.1.引物開發了識別原種事件內序列的特異性引物。更加具體而言，開發了識別A2704-125，側翼區內序列的引物。然后在外源DNA的序列內選擇第二個引物，使兩個引物跨越約183個核苷酸的序列。發現下列引物在對A2704-12DNA進行的PCR反應中能得到特別清楚和可重復性的結果DPA021:5，-ggC.gTT.CgT.AgT.gAC.TgA.gg-3，(SEQIDNo.:4)(耙植物DNA)DPA024:5，-gTT.TTA.CAA.CgT.gAC.Tgg-3，(SEQIDNo.:8)(乾插入的DNA)靶向內源序列的引物優選地包括在PCR混合物中。這些引物用作未知樣品中的內部對照和DNA陽性對照。使用內源性引物對出現陽性結果表明，對于待產生的PCR產物而言，基因組DNA制備物中存在足夠質量的充足DNA。選擇識別大豆看家基因的內源引物SOY01:5，誦gTCAgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3，(SEQIDNo.:20)(位于大豆肌動蛋白1基因中(登錄號J01298))SOY02:5，-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3，(SEQIDNo.:21)(位于大豆肌動蛋白1基因中(登錄號J01298))2.2.擴增的片段在PCR反應中預期擴增片段為對于引物對SOY01-SOY02:413bp(內源性對照)對于引物對DPA021-DPA024:185bp(A2704-12原種事件)2.3.模板DNA根據Edwards等(NucleicAcidResearch,19，p1349，1991)從用打孔器得到的葉子制備模板DNA。當使用用其它方法制備的DNA時，應該使用不同量的模板開展試驗。通常50ng的基因組模板DNA會得到最佳結果。2.4.指定的陽性和陰性對照為避免假陽性或假陰性，決定在PCR反應中加入下列陽性對照和陰性對照-MasterMix對照(DNA陰性對照)這是在反應中不加入DNA的PCR。當觀察到預期結果，即無PCR產物時表明PCR混合物沒有污染耙DNA。-DNA陽性對照(已知包含轉基因序列的基因組DNA樣品)該陽性對照得到成功擴增表明PCR在允許耙序列擴增的條件下運行。-野生型DNA對照這是所提供的模板DNA為從非轉基因植物制備的基因組DNA的PCR。當觀察到預期結果，即無轉基因PCR產物擴增但有內源PCR產物擴增時表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測的轉基因背景擴增。2.5.PCR條件最優化結果在下列條件下得到-對于25^U反應，PCR混合物包含2.5nl模板DNA2.5pi10x擴增緩沖液(Taq聚合酶提供)0.5|il10mMdNTP，s0.5piDPA021(lOpmo,0.5piDPA024(10pmol/|il)0.25fxlSOY01(10pmol/|xl)0.25jilSOY02(lOpmol/juI)0.1(ilTaqDNA聚合酶(5單位/pl)水補至25|il-對于最佳結果熱循環參數如下95。C4分鐘然后95。C1分鐘57°C1分鐘72°C2分鐘5個循環然后92°C30秒57。C30秒72。C1分鐘25個循環然后72°C5分4中2.6.瓊脂糖凝膠分析為了最佳觀察PCR結果，決定將10和20jal間的PCR樣品以及適當的分子量標準(例如lOObpladderPHARMACIA)上樣于1.5%瓊脂糖^^上(Tris-硼酸緩沖液)。2.7.結果驗證決定不接受在一次PCR運行和一次PCR混合物中從轉基因植物DNA樣品中得到的數據，除非1)DNA陽性對照出現預期PCR產物(轉基因和內源片段)，2)DNA陰性對照沒有出現PCR擴增(無片段)和3)野生型DNA對照出現預期結果(內源片段擴增)。當遵照如上所述的用于A2704-12的PCR鑒定方案時，在泳道中出現了可見量的預期大小的轉基因PCR產物和內源PCR產物，表明用于制備基因組模板DNA的相應植物具有可遺傳的A2704-12原種事件。泳道中顯示沒有可見量轉基因PCR產物但有可見量內源PCR產物，表明用于制備基因組模板DNA的相應植物不包含原種事件。泳道中沒有出現可見量內源PCR產物和轉基因PCR產物，表明基因組DAN的質量和/或數量不允許產生PCR產物。這些植物不可用。應當重復制名、基因組DNA并用適當對照開展PCR。2.8.使用鑒別性PCR方案鑒定A2704-12在篩選未知樣品之前，必須開展帶有適宜對照的試驗。所開發的方案需要對因實驗室不同而不同的成分(模板DNA制備、TaqDNA聚合酶、引物質量、dNTPs、熱循環儀等)進行優化。內源序列的擴增在方案中起到至關重要的作用。人們必須獲得擴增已知轉基因基因組DNA模板內的等摩爾量內源序列和轉基因序列的PCR和熱循環條件。只要靶向內源片段沒有擴增或者只要靼向的擴增沒有達到同樣的溴化乙錠染色強度(如通過瓊脂糖凝膠電泳所判斷)，則需要對PCR條件進行優化。根據上述方案測試了大量大豆植物的葉材料，在其中一些植物包含A2704-12。來自原種事件A2704-12和野生型大豆樣品分別用作陽性和陰性對照。圖2闡明了用對于A2704-12的原種事件PCR鑒定方案對諸多大豆植物樣品(泳道l-4)進行PCR的結果。由于在泳道1中檢測到了185bp的條帶，所以泳道l中的樣品包含原種事件，而泳道2、3和4中的樣品不包含A2704-12。泳道2包含另一大豆原種事件；泳道3代表非轉基因大豆對照；泳道4代表陰性對照(7jc)樣品；泳道5代表分子量標準(IOObp)。3.使用特異性整合片段作為探針用于檢測包含A2704-12的材料A2704-12的特異性整合片段通過使用特異性引物DPA021(SEQIDNo.4)和DPA024(SEQIDNo.8)的PCR擴增得到，或者通過化學合成得到，并標記。該整合片段用作檢測生物學樣品中A2704-12的特異性探針。根據標準步驟從樣品提取核酸。然后將核酸與特異性探針在經優化允許雜合體形成的雜交條件下接觸。然后檢測雜合體的形成，表明樣品中存在A2704-12核酸。任選地，在樣品中的核酸與特異性^:針接觸之前，將核酸用特異性引物擴增。備選地，在與特異性探針接觸之前，將核酸標ii，而不是將整合片段標記。任選地，在與樣品接觸之前，將特異性探針附著于固體載體上(例如但不限于濾器、試條(strip)或珠)。權利要求1.用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的方法，其中方法包括用特異性識別A2704-125’或3’側翼區的特異性引物或探針檢測A2704-12特異性區域。2.權利要求l所述的方法，所述方法包括使用至少2個引物的聚合酶鏈式反應從所述生物學樣品所存在的核酸中擴增100和500bp之間的DNA片段，所述引物之一識別A2704-12的5，側翼區或A2704-12的3，側翼區，所述5，側翼區具有SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列，所述3，側翼區具有SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷^列，所述引物中的另一個識別外源DNA內的序列，所述外源DNA具有SEQIDNo.1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的核苷^列。3.權利要求2所述的方法，其中所述的識別A2704-125，側翼區的引物由選自SEQIDNo1中從核苷酸l至核普酸209的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成，或所述的識別A2704-123，側翼區苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成，并且所述的識別外源DNA內序列的引物由選自SEQIDNo.1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸組成。4.權利要求2所述的方法，其中所述的識別A2704-125，側翼區的引物在其最3，末端包含選自SEQIDNo1中從核苷酸1至核普酸209的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核香酸序列，或所述的識別A2704-123，側翼區的引物在其最3，末端包含選自SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，并且所述的識別外源DNA內序列的引物在其3，末端包含選自SEQIDNo.　1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸。5.權利要求4所述的方法，其中所述引物分別包含SEQIDNo.4和SEQIDNo.8的序列。6.權利要求5所述的方法，其中方法包括使用A2704-12鑒定方案擴增約185bp的片段。7.用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的試劑盒，所述試劑盒包含識別A2704-125，側翼區的一個引物或者識別A2704-123，側翼區的一個引物和一個識別外源DNA內序列的引物，所述5，側翼區具有SEQIDNo1中從核普酸1至核苷酸209的核苷酸序列，所述3，側翼區具有SEQIDNo2中>^核香酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列，所述外源DNA具有SEQIDNo.1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。8.權利要求7所述的試劑盒，其中所述的識別A2704-125，側翼區的引物由選自SEQIDNol中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成，或所述的識別A2704-123，側翼區的引物由選自SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成，并且所述的識別外源DNA內序列的引物由選自SEQIDNo.1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的核香酸序列中的17至200個連續核苷酸組成。9.權利要求7所述的試劑盒，其中所述的識別A2704-125，側翼區的引物在其最3，末端包含選自SEQIDNol中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或所述的識別A2704-123，側翼區的引物在其最3，末端包含選自SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核苷^列，并且所述的識別外源DNA內序列的引物在其3，末端包含選自SEQIDNo.1中從核苷酸210至核苷酸720的互補序列的核苷酸序列或SEQIDNo　2中從核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸。10.權利要求7所述的試劑盒，包含由SEQIDNo.4的序列組成的引物和由SEQIDNo.8的序列組成的引物。11.用于A2704-12PCR鑒定方案的引物，具有在最優化PCR條件下特異性識別A2704-125，或3，側翼區內序列的序列，所述5，側翼區具有SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列并且所述3，側翼區具有SEQIDNo2中從核苷酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列。12.權利要求ll所述的引物，其中所述引物由選自SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成，或由選自SEQIDNo2中從核苷酸569至核普酸1000的互補序列的核苷酸序列中的17至200個連續核苷酸的核苷酸序列組成。13.權利要求11所述的引物，其中所述引物在其最3，末端包含選自SEQIDNo1中從核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列，或選自SEQIDNo2中從核香酸569至核苷酸1000的互補序列的核苷酸序列中的至少17個連續核苷酸的核苷酸序列。14.在其最3，末端包含SEQIDNo.4的序列的引物。15.在其最3，末端包含SEQIDNo.8的序列的引物。16.權利要求l所述的方法，其中方法包括用A2704-12特異性探針與生物學樣品的核酸雜交。17.權利要求16所述的方法，其中所述特異性探針的序列與包含A2704-12的部分5，側翼序列或3，側翼序列以及與^M目連的外源DNA序列的序列具有至少80%序列同一性。18.權利要求17所述的方法，其中所述特異性^針的序列與SEQIDNo.1中從核苷酸160至260或SEQIDNo.2中從核苷酸520至620或所述序列的互補序列具有至少80%序列同一性。19.用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與A2704-12特異性區域特異性雜交的特異性探針。20.權利要求19所述的試劑盒，其中所述特異性探針的序列與包含A2704-12的部分5，側翼序列或3'側翼序列以及與4^目連的外源DNA序列的序列具有至少80%序列同一性。21.權利要求20所述的試劑盒，其中所述特異性探針的序列與SEQIDNo.1中從核苷酸160至260或SEQIDNo.2中從核苦酸520至620或所述序列的互補序列具有至少80%序列同一性。22.用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的特異性探針。23.權利要求22所述的揮:針，其與包含A2704-12的部分5'側翼序列或3，側翼序列以及與^目連的外源DNA序列的序列或者其互補序列具有至少80%序列同一性。24.權利要求23所述的探針，其與SEQIDNo.1中從核苷酸160至260或SEQIDNo.2中從核苷酸520至620或所述序列的互補序列具有至少80%序列同一性。25.用于鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的特異性探針，其序列與SEQIDNo.1中從核苷酸160至260或SEQIDNo.2中從核苷酸520至620或所述序列的互補序列基本相似。26.用于證實種子純度的方法，所述方法包括用特異性識別A2704-125，或3，側翼區的特異性引物或探針在種子樣品中檢測A2704-12特異性區域。27.用于篩選存在A2704-12的種子的方法，所述方法包括用特異性識別A2704-125，或3，側翼區的特異性引物或探針在種子批樣品中檢測A2704-12特異性區域。28.在其基因組中包含原種事件A2704-12的大豆植物或其細胞、部分、種子或后代。全文摘要提供了快速且明確鑒定生物學樣品中原種事件A2704-12的工具。文檔編號C12N15/82GK101151373SQ200680010143公開日2008年3月26日申請日期2006年4月4日優先權日2005年4月8日發明者M·德博克勒爾申請人:拜爾生物科學公司