專利名稱：：氣體處理生長培養基改變凍干微生物的生存力的方法氣體處理生長培養基改變凍干微生物的生存力的方法本發明涉及生產冷凍干燥的微生物(特別是冷凍千燥的細菌)的領域，本發明特別涉及冷凍干燥的乳酸細菌，本發明提出了新的操作條件用于增加冷凍干燥孩i生物在其隨后貯藏期間的生存力。應當理解，根據經驗，所有類型的微生物(細菌、酵母、霉菌等)可被冷凍干燥；冷凍千燥特別用于在微生物收集中保藏菌林。例如冷凍干燥用于乳酸細菌、益生菌菌抹和酵母，并且用于非常廣泛的工業應用。還應當理解，在下述情況下^t生物可特別用于對起始材料的生物轉化-制備成品(奶酪、酸牛乳、葡萄酒、嘩酒、面包等)，-制備用于人類或動物營養的生物質(酵母、益生菌等的提取物或粉末)，-生產目的特定分子(酶、抗生素、氨基酸、調味料等)，-純化工業污水、處理有機廢料等，等等。就下文中關于乳酸細菌的實例而言，將乳酸細菌作為發酵劑和益生菌培養物的工業開發高度依賴于所用的防腐技術，以確保穩定的培養物，即培養物可長期存活并具有活性。為此目的通常使用冷凍和冷凍千燥，但是這些技術引入了不想要的副作用，它們是蛋白質變性和降低的細胞生存力。在干燥和貯藏期間對保加利亞乳桿菌(丄actoMc說wA"/^iWcns^16.6"/g肌'c"^)上進行的研究已鑒定出影響存活的關鍵參數的因素，例如溫度和經干燥粉末的水活化(具體見Castro等人的工作，發表于1995年AppliedMicrobiologyandBiotechnology.44:172-176上)'粉末生存力的丟失是細胞損傷(偏好的靶標是細胞壁、細胞膜和DNA)以及對脂膜氧化的結果(見Carvelho等人的文章，發表于2004年，在InternationalDairyJournal.14:835-847中)。因此，對冷凍或冷凍干燥的乳酸細菌培養物存活及其長期齡藏的優化顯然在技術和經濟重要性方面都很重要。應當理解，制備冷凍干燥的菌抹從親本菌林進行，其通常包括4個步驟接種、在罐中培養、濃縮、貯藏。可以參考例如下述文獻"FreezeDryingandAdvancedFoodTechnology",Goldblith等人,AcademicPress，1975或"TraitideLyophilisation"[Dissertationonfreeze-drying，LouisRey,由Hermann于1960年發表。使用經濃縮且處于最優生理狀態的培養物來進行接種。可以使用若千技術，其包括-4吏用罐式起始物(tankstarter),-連續傳代的方法，-直接接種，-繼續接種。培養的步驟本身在罐中(可以有或沒有搖動)，在其組成適合每種微生物的特定需要的培養基中進行.例如可從上文引用的文獻中看出，培養基的組成可以有很大的變化，但是通常都存在多糖、甘油、乳、葡萄糖等中的一種或多種元素。類似地，可調節參數，例如，pH、溫度或溶解氧壓力.存在多種類型的培養-不連續或分批培養，特別用于制備乳酸酵素(ferment)或面包制作用酵母，-半連續或"補料分批"培養，例如用于制備對發酵產物敏感的酵素或用于制備對發酵底物的抑制敏感的生物質，-有或沒有再循環的連續培養，沒有再循環的連續培養特別用于制備酵素或目的分子，以及用于對廢水進行生物純化。保藏步驟可以以液體形式，通過冷凍、通過低溫保藏、通過冷凍干燥或者通過干燥進^"。使用保護劑保護^:生物免受保藏處理的有害影響。如已知的，冷凍干燥是低溫、脫7jc操作，其包括通過升華除去冷凍之后產物中含有的大部分水。此外，已知氧化還原電位(在文獻中通常稱作Eh)是由于其性質而存在于所有培養基中的物理化學參數，只要培養基含有至少一種能從氧化狀態變為還原狀態的分子，及能相反變化的分子。所以，其影響可在所有細胞功能上觀察到。其作用已顯示于多種類型的微生物上，特別是下述細菌菌林-向培養基中加入化學還原劑已使得可以顯著改變谷氨酸棒桿菌(0oTie6"cte/7'w附g/"to附/cw附)、丙酮丁醇梭菌(C7os^nV/i'"/Mflrceto6w^//cww)、鎖擲酵母屬(5^nW/o^/附)和大腸桿菌(J^c&r/c&Vio/i)的生長和代謝通量。-通過氣體固定的還原Eh可以改變釀酒酵母(Sflcc^WYwy;c"cem^iW)的代謝通量，導致甘油/乙醇比例增加，貯存的糖的積累，以及以液體狀態保藏期間酵母存活的增加(參考文獻為以本申請人名義的文件FR畫2811331)。在工業培養基中，已通過氧來間接考慮Eh，氧對于乳酸細菌的抑制作用已清楚鑒定。該作用是由于它們不能合成細胞色素和具有血紅素核心的酶導致的。還可以通過作用于Eh來改變益生菌酵素的存活、代謝通量以及調味分子的產量和/或穩定性。所有這些結果已通過由微生物自身、氧化還原分子或熱處理進行的對Eh的改變來獲得.冷凍干燥之后以及保藏期間微生物的存活取決于多種因素，包括微生物的初始濃度、生長務ff、生長培養基、干燥培養基以及再7jc化務泮'因此，在冷凍或冷凍干燥類型的保藏方法中，生長培養基是待控制的重要參數；培養基的每種組分可提供保護，特別是通過允許溶質的聚集、外泌多糖的生產以及對膜脂分布的改變來進行，特別是通過增加不飽和脂肪^/飽和脂肪酸之比來進行。之前的研究已顯示，在冷凍干燥方法中出現細胞損傷，加入到冷凍干燥培養基中的抗氧化劑可以保護膜脂抵御這種損傷，還顯示這種優點，即在冷凍干燥或在貯藏期間，向乳酸細菌的濃縮物中加入(培^M:后，即向冷凍干燥或冷凍培養基中加入)化學抗氧化劑分子，可以保護膜脂抵御氧化(參考文獻例如文獻WO03/018778或者Fonseca等人2003年發表于InternationalDairyJournal.13:917-926上的研究)。由此可見，確實需要能夠提供一種生產冷凍干燥的微生物，特別是冷凍干燥的細菌的新方法，該方法使得可以提高冷凍干燥菌抹的生存力。此外，考慮到營養藥物應用以及獸醫應用，Eh的變化應當涉及不改變產物特征以及保持產物無害的化合物。如下文中將更詳細地描述的，根據本發明，我們提出，在接種之前,使用包含惰性氣體和/或還原氣體的處理氣體，來改變菌林培養基的氧化還原電位。因此，根據本發明，在接種培養基步驟之前，用包含惰性氣體(例如氮氣、氬氣、氦氣或二氧化碳)或惰性氣體混合物，或還原氣體(例如氫氣)，或此類惰性氣體和還原氣體的混合物的處理氣體來處理培養基，以獲得比用空氣平衡的混合物獲得的值小的氧化還原電位值Eh。處理，即^/液接觸可根據本領域技術人員公知的方法之一來進行，例如使用燒結玻璃板漏斗、膜或者多孔物質進行培養基通氣，或者通過中空軸渦輪機進行攪動，使用水注射器(hydroinjector)等。因此，本發明涉及冷凍干燥的微生物(特別是冷凍干燥的細菌，特別是冷凍干燥的乳酸細菌)的一類制備方法，其中該類制備方法的一個或多個步驟中用一種或多種微生物菌林接種培養基，所述方法特征在于，在接種步驟之前，用包含惰性氣體或還原氣體，或此類氣體混合物的處理氣體處理培養基，以獲得比用空氣平衡的培養基獲得的值小的培養基氧化還原電位值Eh。在本發明的優選實施方案中，任選地，還使用一種和/或其他下述安排-所述期望獲得的氧化還原電位值比用空氣平衡的培養基獲得的值要小至少100mV;-所述期望獲得的氧化還原電位值是負值；-接種通過下迷方式間接進行之前進行預培養，隨后用該預培養物進行所述接種，并且，在接種預培養物之前，用包含惰性氣體或還原氣體，或此類氣體的混合物的預處理氣體處理預培養基，以獲得比用空氣平衡的預培養基獲得的值小的預培養基氧化還原電位Eh值；—所述處理氣體或預處理氣體是氫氣或者包含氫氣；-所述處理氣體或預處理氣體是氮氣或者包含氮氣；—所述處理氣體或預處理氣體是氫氣和氮氣的混合物；-所述處理氣體或預處理氣體是氬氣或者包含氬氣；-所述處理氣體或預處理氣體包含氫氣和/或氮氣以及其他氣體，其中的；-所述處理氣體或預處理氣體還包含其他氣體，其選自惰性氣體(特別是氦氣)以及氧氣、二氧化碳和一氧化二氮，以及它們任何比例的混合物，優選地，選自二氧化碳和氧氣及其混合物；-所述處理氣體或預處理氣體是氫氣和二氧化碳的混合物。此外，還可從下文的詳迷中看到，由此獲得的冷凍干燥的微生物具有改進的性質，特別是在菌林對于冷凍干燥的抗性以及所述菌抹隨后的保藏期間的抗性方面。本發明的其他特征和優點將從下文詳細描述的實施例中看到，所述實施例涉及乳酸細菌領域。在改良的5升的Schott瓶中，對滅菌脫脂乳(4.5升)用兩種不同氣體以150ml/分鐘的流速通氣處理1小時；還進行不通氣處理的對照條件-對照(參照)；-氮氣(根據本發明)；-氮氣/氫氣混合物，體積比96/4(根據本發明)。對每種條件進行三次測試。根據所用的氣體，用MettlerToledo探針測得的由此得到的通過關聯回到pH7的氧化還原電位的值(relatedbacktopH7)(通過本領域技術人員公知的方程，例如Leistner和Mirna等式，其可將pH=x時的培養基的Eh與其在pH7的值關#來)如下所示:對照氮氣氮^/氫氣+300mV+200mV-305mV然后用益生菌干酪乳桿菌(i^cto6ac說附casei)菌林接種培養基(滅菌脫脂乳)，然后置于37。C培養箱中72小時。72小時的生長之后，回收培養物，加入冷凍千燥填料(傳統類型的，如本說明書上文提到的)。使用氫氧化鈣溶液對混合物進行中和。將由此獲得的制品放置在盤中以進行冷凍干燥。因此在生長72小時后對培養基中的細菌進行計數，并加入冷凍千燥填料。獲得的結果示于下表l中。統計學處理三種處理獲得的計數。"ns"表示觀察到的差異不顯著(5%時的Newman-Keuls檢驗)。由此推斷，研究的兩種處理氣體混合物對生物質的生產之間無顯著差異.表l:在對培養基的3種處理下，72小時生長以及加入填料之后，在液體培養基中獲得的干酪乳桿菌的生物質，其被表示為CFU/ml(每種情況中均為3次測試的均值)_對培養基的處理生物質獲得的生物質相對對照的百分比CFU/ml%對照6，67.108(ns)N28，33,108(ns)+25%N2/H28，67.108(ns)+30%下面將檢查在D+1天時冷凍干燥的粉末上獲得的計數，這就是說，在獲得其之后保存了l天的，即，在獲得粉末的后一天進行計數。上述結果示于下表2中。統計學處理3種處理獲得的計數。其顯示，首先N2/H2處理和對照處理之間，以及其次，N2處理和對照處理之間觀察到的差異是顯著的(5%時的Newman曙Keuls檢驗)。因此觀察到，在用氮氣-氫氣處理的培養基上進行的培養獲得的粉末的計數比在對照或N2處理的培養基上進行的那些培養獲得的粉末的計數要高。應當注意到，用氮氣獲得的結果已經顯示了相對對照而言的實質性增加。因此，對用N2/H2處理培養的細胞觀察到了菌林對冷凍干燥的抗性的增加，這表明對培養基的處理在菌林對冷凍干燥的抗性方面具有正面作用。表2:1天之后干酪乳桿菌的生物質(其^L4示為CFU/g粉末)是對生長培養基的初始處理的函數(每種情況中均為3次測試的均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>隨后的測試中將檢查在D+60天(即，在獲得其之后保存了60天)對粉末獲得的計數結果。它們示于下表3中。表3:在環境溫度保藏60天之后干酪乳桿菌的生物質，其#^示為CFU/g粉末，這作為對生長培養基的初始處理的函數(每種情況中均為3次測試的均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>再次統計學處理3種處理獲得的計數。在三種不同處理之間顯示了顯著差異(5%時的Newman-Keuls檢驗)。這些結果表明較之用N2處理的培養基上培養的細胞的那些計數，用1\2/112處理的培養基上培養的細胞計數更高，用N2處理的計數還顯著高于用對照獲得的計數。可以明顯推斷出用]\2和]\2/112對菌林生長培養基的初始處理對于其對冷凍干燥的抗性的正面作用得以證實，其甚至在保藏期間擴增。這顯示了在接種步驟之前使用氣體改變生長培養基的Eh對于菌抹對冷凍干燥的抗性以及對其保藏期間的抗性有益處。權利要求1.冷凍干燥的微生物，特別是冷凍干燥的細菌的制備方法，所述方法是這樣的類型，其中在所述制備方法步驟之一中用一種或多種微生物菌林接種培養基，且特征在于，在接種步驟之前，用包含惰性氣體或還原氣體，或者此類氣體的混合物的處理氣體處理培養基，以獲得比用空氣平衡培養基時獲得的值小的培養基氧化還原電位值Eh。2.權利要求1所迷的制備方法，其特征在于所述目的氧化還原電位值比用空氣平衡培養基時獲得的值小至少100raV。3.權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述目的氧化還原電位值為負值。4.如前述任意一項權利要求所述的制備方法，其特征在于通過下迷方式間接進行接種提前進行預培養，隨后用預培養物進行所述接種，并且在接種所述預培養物之前，用包含惰性氣體或還原氣體，或此類氣體的混合物的預處理氣體處理所述預培養基，以獲得比用空氣平衡預培養基時獲得的值小的預培養基氧化還原電位值Eh。5.如前述任意一項權利要求所迷的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體是氫氣或者包含氫氣。6.權利要求1至4中任意一項所述的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體是氮氣或者包含氮氣。7.權利要求1至4中任意一項所述的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體是氫氣和氮氣的混合物，8.權利要求1至4中任意一項所述的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體是氬氣或者包含氬氣。9.如前述任意一項權利要求所述的制備方法，其特征在于所迷處理氣體或預處理氣體包含氫氣和/或氮氣以及其他氣體，所迷其他氣體從由此產生的冷凍干燥微生物之后使用的角度而言是可接受的。10.權利要求1至8中任意一項所述的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體還包含其他氣體，所述其他氣體選自惰性氣體以及氧氣、二氧化碳和一氧化二氮及其任何比例的混合物，所述惰性氣體特別是氦氣，所述其他氣體優選選自二氧化碳和氧氣及其混合物。11.權利要求1至4中任意一項所述的制備方法，其特征在于所述處理氣體或預處理氣體是氫氣和二氧化碳的混合物。全文摘要本發明涉及制備凍干微生物(例如凍干的細菌)的一類方法，其中該類方法的步驟之一中用一種或多種微生物菌株接種培養基。本發明特征在于，在接種步驟之前，用包含惰性氣體或還原氣體，或此類惰性和還原氣體混合物的處理氣體處理培養基，從而得到培養基的確定氧化還原電位值Eh，該值小于用空氣平衡的培養基時得到的值。文檔編號C12N1/04GK101124317SQ200680005524公開日2008年2月13日申請日期2006年2月16日優先權日2005年2月22日發明者C·德爾布,G·費龍,H·勒東,R·卡雄申請人:喬治洛德方法研究和開發液化空氣有限公司