專利名稱：質粒dna的純化方法
技術領域：
本發明涉及從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的一種方法，所述方法包括(a)裂解含有超螺旋質粒DNA的微生物宿主細胞，形成宿主細胞溶胞產物；和(b)通過絮凝宿主細胞碎片來澄清步驟(a)中所述的溶胞產物。裂解微生物宿主細胞可以在溶菌酶存在下或者在沒有溶菌酶存在的情況下進行。在本發明的一個實施方案中宿主細胞碎片用聚乙二醇(PEG)進行絮凝。用于澄清細胞溶胞產物的絮凝劑，包括但不僅限于聚乙二醇，可以作為溶解緩沖液(例如標準STET緩沖液)的一個組成成份包括在內，或者在裂解細胞后再加入溶胞產物中。絮凝的宿主細胞碎片能以如沉降、傾倒或離心的方法，包括但不限于連續離心，從宿主細胞溶胞產物中除去，最后得到澄清的溶胞產物。在去除絮凝的細胞碎片后，澄清后的細胞溶胞產物中的超螺旋質粒DNA用下游純化工藝可進一步從殘留污染物中純化出來。因此，本發明的一個實施方案涉及使用此處描述的上游純化工藝生產含超螺旋質粒DNA的澄清的宿主細胞溶胞產物的一種方法。
本發明還涉及從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的一種方法，所述方法包括(a)裂解含超螺旋質粒DNA的微生物宿主細胞，形成宿主細胞溶胞產物；(b)調節步驟(a)中得到的宿主細胞溶胞產物至堿性pH，然后再中和；(c)通過絮凝宿主細胞碎片，來澄清步驟(b)所述的pH調節后的細胞溶胞產物。在此描述的調至堿性pH然后再中和的步驟有助于制備宿主細胞溶胞產物來用于絮凝過程；不過，所述的溶胞產物的pH調節既可在加入絮凝劑之前進行，也可以在加入之后進行。在本發明的一個實施方案中，用一定濃度的堿溶液將最初細胞溶胞產物的pH值調至堿性(比如，大概12-13)，使可溶的宿主細胞染色質DNA能夠變性。然后將已調至堿性的細胞溶胞產物加入一定濃度的酸溶液中和至接近初始裂解緩沖液的pH值，優選使細胞溶胞產物的pH介于8-9之間。因此，本發明的一個實施方案涉及到一種從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的方法，所述方法包括(a)在生理緩沖液中裂解含有超螺旋質粒DNA的微生物宿主細胞，形成宿主細胞溶胞產物；(b)將步驟(a)的宿主細胞溶胞產物調節至堿性pH值，即向所述的溶胞產物中加入堿，升高其pH值至約12至約13之間；(c)中和步驟(b)中堿化的細胞溶胞產物，使其pH值大約為細胞裂解時的生理緩沖液的pH；(d)通過加入絮凝劑，包括但不僅限于PEG，絮凝宿主細胞碎片，澄清所述的堿化又中和后的溶胞產物。
應用本發明所述的上游裂解和溶胞產物澄清技術后，能進行多種下游的純化過程，包括但不僅限于(i)使用陽離子去垢劑，包括但不僅限于CTAB，來從澄清后的溶胞產物中沉淀質粒DNA；(ii)用鹽溶液溶解質粒；(iii)用水合硅酸鈣吸附殘留雜質；(iv)在進行最后臨床級質粒制備前，使用聚乙二醇或醇來沉淀純化的質粒DNA。
本發明還涉及一種從大規模發酵方案中提取臨床級質粒DNA的新型下游純化工藝，即使用最后的濃縮/精加工步驟得到粉狀的質粒DNA產品。本發明的下游純化工藝的作用是，從前期純化所得到的富含超螺旋質粒DNA的溶胞產物中除去殘留雜質。因此，本發明涉及一種從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的方法，所述方法包括(a)沉淀所述的超螺旋質粒DNA；(b)用切向流過濾模式的微孔過濾濃縮所述的沉淀后的超螺旋質粒DNA。在步驟(a)中沉淀超螺旋質粒DNA可用大家熟知的方法，使用聚乙二醇或醇類包括但不僅限于乙醇、甲醇和異丙醇。步驟(b)中的微孔過濾可直接替代在質粒DNA純化工藝中最后濃縮/交換緩沖液過程中常用的超濾法，能減小循環率、濾膜面積以及整個批次的體積。
在本發明的一個實施方案中，作為在此公布的新型下游濃縮/精加工純化工藝的第一步驟，使用PEG將超螺旋質粒DNA從富含它的澄清細胞溶胞產物(即通過上游工藝和前期的下游純化工藝富集超螺旋質粒DNA的宿主細胞溶胞產物)中沉淀出來。然后將所述的沉淀質粒DNA進行切向流過濾模式下的微孔過濾。因此，本發明的一個實施方案涉及一種從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋質粒DNA；(b)使用切向流過濾模式下的微孔過濾濃縮該沉淀后的超螺旋質粒DNA。本發明提涉的微孔過濾可能是一種分級過濾工藝的一部分。因此，在本發明的一個實施方案中，上述PEG沉淀的超螺旋質粒DNA通過一種分級過濾工藝得以濃縮，該分級過濾工藝包括第一個過濾步驟，其中使用微孔過濾和后續的透析過濾濃縮沉淀的質粒DNA漿液，并清除殘留的RNA和雜質。第二個過濾步驟用乙醇置換DNA沉淀中的聚乙二醇，并進一步濃縮質粒DNA，最后得到一種脫水質粒DNA的濕品，其可干燥后獲得細粉狀質粒DNA。該第二步過濾可以在一種過濾干燥設備中進行，在攪動細胞的操作下(如，單板Nutsche過濾干燥器)允許加壓過濾和真空干燥。因此本發明涉及一種從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用PEG沉淀所述的超螺旋質粒DNA；和(b)用分級過濾工藝，包括切向流過濾模式下的微孔過濾，濃縮所述的沉淀后超螺旋質粒DNA。所述的分級過濾工藝包括(a)第一個過濾濃縮步驟，包括切向流過濾模式下的微孔過濾；(b)第一個透析過濾步驟，使用含有PEG的透析過濾緩沖液進行透析過濾，該透析過濾緩沖液中含有足夠濃度的PEG和任選鹽以保持所述的超螺旋質粒DNA的沉淀狀態；(c)脫水步驟，加入乙醇對沉淀的超螺旋質粒DNA進行部分脫水；(d)第二次的過濾濃縮步驟；和(e)第二次的透析過濾步驟，用100％(v/v)乙醇進行透析過濾。在其它實施方案中，第二次的過濾和透析過濾，步驟(d)和步驟(e)，是在一個過濾干燥器中，包括但不僅限于單板Nutsche過濾干燥器，以加壓和攪動細胞模式進行的。
本發明涉及從大規模微生物發酵的細胞溶胞產物中純化超螺旋質粒DNA的方法，所述方法包括(a)使用醇類，包括但不僅限于乙醇、甲醇和異丙醇，沉淀超螺旋質粒DNA；(b)使用切向流過濾模式下的微孔過濾來濃縮所述沉淀的質粒DNA。在本發明該部分的一個實施方案中，所述微孔過濾濃縮步驟是一個分級過濾工藝的一部分，包括(a)第一次過濾濃縮步驟，包括切向流過濾模式下的微孔過濾；(b)使用乙醇溶液進行第一次透析過濾步驟，其中該溶液的乙醇濃度足以保持所述超螺旋質粒DNA的沉淀狀態；(c)第二次過濾濃縮步驟；和(d)使用100％(v/v)乙醇進行第二次透析過濾步驟。在另一個實施方案中，第二次過濾和透析過濾，步驟(c)和步驟(d)，是在一個過濾干燥器中，包括但不僅限于單板Nutsche過濾干燥器，以加壓和攪動細胞模式進行的。
作為本處可交替使用的術語“臨床級質粒DNA”和“藥用級質粒DNA”指從宿主細胞中分離制備的質粒DNA，其純度能夠達于用于人體進行任何已知的預防和治療的要求，包括但不僅限于基因治療和/或多聚核苷酸疫苗的應用。
這里使用的“非超螺旋質粒DNA”指任何不是超螺旋質粒DNA的DNA，包括任何其它形式的，比如缺刻的、開環的、線性的質粒DNA，以及宿主基因組DNA。
這里使用“NTU”指標準化濁度單位。濁度定義為使用一種光學領域的液面下探頭對液體中顆粒的“計數”。溶液濁度能用基于激光的光散射裝置進行測定。
這里使用的“PEG”指聚乙二醇。
這里使用的“OD600”是600nm處的光密度值，由一種光散射分光光度計測定的每毫升細胞數。
這里使用的“L.O.D.”指檢測極限。
這里使用的“MW”是道爾頓分子量。
這里使用的“LRATM”指除脂試劑TM 這里使用的“CTAB”指溴化十六烷基三甲銨或西曲溴銨。
這里使用的“hcCaSiO3”指水合結晶硅酸鈣。
這里使用的“IPA”指異丙醇。
這里使用的“MF”指微孔過濾。
這里使用的“UF”指超濾。
這里使用的“STET緩沖液”指含有約50mM Tris-HCl(pH 7.0-9.0)、約50-100mM EDTA、約8％蔗糖以及約2％
-X-100的緩沖液。
圖1展示了沉降超過兩天的大腸桿菌溶胞產物。在瓶1中的溶胞產物是用STET緩沖液(本處定義的)重懸細胞并與溶菌酶(500U/mL)在20℃孵育得到。瓶2中的溶胞產物與瓶1中的相似，只是在用溶菌酶孵育后，先加堿將pH調至pH 12，再加酸中和。瓶3中的溶胞產物用含3％PEG 3000的STET緩沖液重懸細胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。瓶4中的溶胞產物與瓶3中相似，只是像瓶2描述那樣，先后加入堿和酸進行堿化后再中和。本圖顯示了PEG作為絮凝劑從堿性溶胞產物中絮凝細胞碎片的潛力。
圖2展示了裝有不同細胞溶胞產物的50ml離心管，這些溶胞產物的起始OD600都是45，然后在16,000×g下離心了5min。管1中的溶胞產物是用STET緩沖液重懸細胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。管2中的溶胞產物與管1中相同，只是與溶菌酶孵育后進行了堿化再中和(如圖1中所述)。管3中的溶胞產物是用含3％PEG 3000的STET緩沖液重懸細胞并與溶菌酶在20℃孵育得到。管4中溶胞產物與管3中相同，只是與溶菌酶孵育后進行了堿化再中和。管5中的溶胞產物與管2中的相同，只是在堿化再中和步驟后加入了PEG。管6中的溶胞產物與管2中的相同，只是在堿性pH調節/中和步驟后加入了終濃度為5％的PEG 3000。
圖3顯示了圖2中展示的溶胞產物的濁度測量值。
圖4A和圖4B顯示了PEG分子量和絮凝大腸桿菌細胞碎片的效果。細胞與溶菌酶孵育后，進行堿性pH調節/酸中和。將不同分子量(PEG 400-6000)的PEG貯液分別加入10ml等份試樣的溶胞產物中，得到PEG終濃度大概介于1.0％至15.0％之間。所得混合物在室溫下沉降大約16小時，然后測定各OD600值(圖4A)。圖4B顯示了只用PEG3000時OD600依賴性與溶液中DNA濃度的相關曲線。
圖5顯示了對于溶菌酶/pH調節后的溶胞產物中提高的PEG 6000濃度(0-8％w/v)，質粒DNA沉降曲線。
圖6A和6B對比了大規模質粒DNA純化工藝中兩種終濃縮/精加工步驟的一般過程流程圖。
圖7A和7B描述了DNA在不同PEG溶液中的溶解性。圖7A顯示在PEG 8000溶液中，當PEG濃度大于2％w/v時，DNA的溶解性將大幅下降。但在所研究范圍內，溶液溫度和DNA濃度則對DNA的溶解性沒有影響。圖7B顯示，在所研究范圍內，DNA完全溶于400分子量的PEG中；而隨著分子量的增加，沉淀DNA所需PEG的臨界質量降低。
圖8描述了在PEG 8000中DNA沉淀的動力學。圖8顯示了5分鐘后，初始DNA有大于99％的都發生了沉淀。
圖9A和9B顯示了質粒DNA在水-乙醇混合物中的溶解性數據。NaCl濃度是基于無乙醇時的濃度。圖9A顯示了NaCl濃度從1.8到3.4M時對質粒的溶解性幾乎沒有什么影響。在圖9B中，對低濃度的NaCl與幾種不同濃度的乙醇一起進行了研究。虛線表示質粒的濃度，如沒有沉淀，在每個溶液中都應出現。
圖10顯示了在不同濃度的乙醇中NaCl的溶解性。
圖11顯示了在兩個IPA濃度不同的IPA-NaCl系統中，“鹽析”和“鹽溶”的極限。
圖12A與12B描述了質粒在含有氯化鈉和醋酸鈉的25％(A)或67％(B)IPA中的溶解度。
圖13顯示了質粒DNA從3M NaCl溶液中沉淀(0.22μm的纖維素膜，2.1cm2的過濾面積，20in.Hg真空)死端式過濾數據的Vmax曲線。該過濾數據首先從初始濃度為40％的乙醇中校準，然后再增加乙醇至50％濃度。在t/V對V的關系曲線上，相對直的線性表明了一個幾乎不可壓縮的濾餅。在50％乙醇中，可以觀察到過濾效率顯著增高。
圖14A顯示了沉淀質粒的微孔過濾期間隨時間變化收集到的滲透體積。對每個數據組都出示了沉淀懸濁液的初始DNA濃度；初始懸濁液體積為500ml。在整個實驗過程中沒有降低滲透流出量并在過濾時一直維持壓力讀數為10psig，懸濁液可以很容易地以15mL/min流速進行過濾。圖14B顯示了沉淀質粒的80％v/v乙醇懸濁液在進行透析過濾時乙醇和NaCl的濃度。
圖15A-C顯示了在切向流過濾模式(TFF)條件下的微孔過濾時進行三種連續乙醇沉淀的嘗試，在過濾期間使用Masterflex size 14(5/16″)管輸送和加入乙醇。圖15A顯示了使用100kD PES膜和40％v/v乙醇沉淀進行連續沉淀/微孔過濾研究的結果。輸送至濾筒的流速大約為30ml/min。大約收集到200ml滲透液時，流量需下降至初始值的20％。圖15B顯示了使用0.1微米PVDF膜和40％v/v乙醇沉淀進行連續沉淀/微孔過濾研究的結果。輸送流速也大約為30ml/min，但在容器和濾器之間含1分鐘延遲時間。圖15C顯示了一個與圖15B相似實驗的結果(0.1微米PVDF膜，1分鐘延遲時間)，但使用了50％的乙醇而不是40％的乙醇來進行質粒DNA的沉淀。在用40％v/v乙醇嘗試時，滲透液流量的下降程度輕微減弱(圖15B)，但壓力的升高使過濾實驗難以連續進行超過30分鐘。
圖16A和16B顯示了使用TFF模式的微孔過濾所進行的兩種連續乙醇沉淀的嘗試，在過濾期間使用HPLC管道輸送和加入乙醇。圖16A顯示了使用40％濃度乙醇進行的連續沉淀/微孔過濾并沒有延遲時間。
圖17A和17B顯示了使用實施例8所述的質粒DNA純化工藝的兩個純化流程中的過程產量(A)和雜質含量(B)。每個質粒的純化都開始于由17.5-18.6L的發酵液處理出來的75-80L OD600＝70的大腸桿菌溶胞產物。圖17A比較了在純化藝中的不同階段超螺旋質粒DNA質量數(“scDNA(g)”)和超螺旋DNA百分比(“％scDNA”)細胞溶胞產物(“Lys”)；通過絮凝宿主細胞碎片后的澄清溶胞產物(“CL”)；由硅酸鈣第一次吸附和過濾后的DNA漿(“LRA1F”)；由硅酸鈣第二次吸附和過濾后的DNA漿(“LRA2F”)；重懸在PEG沉淀和后續微孔過濾步驟中成為干粉的DNA(“FRB”)。圖17B在圖17A描述的純化工藝的同一階段比較了內毒素的量(log EU/mL)，蛋白含量(％)和RNA含量(％)。
圖18顯示了用BCA法測定在PEG 6000絮凝的細胞溶胞產物經最終CTAB沉淀后的蛋白含量，這里的CTAB是由加入含2％(w/v)CTAB的40mM NaCl溶液的方式引入的。
發明詳述 本發明涉及一種純化臨床級質粒DNA的可調節的方法學，該方法可降低生產成本并提高生產工藝的穩定性。通常認為質粒DNA純化的主要單元操作包括細胞溶解、過濾(微孔過濾/超濾)以及色譜分離。然而，在大規模分離藥用級質粒DNA時，所述的被確認為是主要單元操作的方法一定要適應生產目標，即高產量和最低單位成本下的高質量。比如，原材料的花費，如樹脂和緩沖液，在應用于大規模質粒DNA純化工藝時，已發現多步層析造成了高昂單位成本以及低下的生產量。在最近公開的一份美國專利申請No.09/875,379(美國
發明者D·B·博伊德, A·J·克里斯托佩特, R·J·蘭德, J·C·墨菲, M·A·溫特斯 申請人:默克公司