肉制品或水產糜制品及其制造方法

專利名稱：肉制品或水產糜制品及其制造方法
技術領域：
本發明涉及使用蛋白質脫酰胺酶的肉食肉制品或水產糜制品及其制造方法。
背景技術：
人類利用以家畜、家禽為主體的哺乳類或鳥類的骨骼肌組織所代表的肉食、作為魚類骨骼肌組織的魚肉、其他脊椎或無脊椎動物的機體組織或器官等作為維持生命所必需的蛋白質供應源。上述動物性蛋白質食品不論起源如何，都含有肌動蛋白、肌球蛋白等共同的肌肉蛋白質，這些蛋白質在食品中表現出共同的加工特性。例如，肌肉蛋白質的功能特性可以列舉出保水性、粘結性、彈性、凝膠化性等。上述特性有助于向香腸或魚糕等糜制品中混入脂肪或水分，或者賦予肉塊接合型制品粘結性或凝膠化性等。上述具有各種功能特性的肌肉蛋白質一般通過加熱、冷凍、冷藏、加壓等加工處理而發生變性。肌肉蛋白質的變性引出肉本身的香味而賦予美味，另一方面不僅產生加工方面的不良問題如從肉組織流出汁水或隨之而來的產率下降等，而且由于原料而給感官方面帶來不良影響如肉質變硬、柔嫩度被破壞、食感變得松散等。例如，在肉食中烹調牛排或カッフラィ等較大塊的肉(肉片)時，柔軟或多汁是味美的重要要素，但這種肉具有因加熱烹飪而變硬的性質，同時肉汁也趨于流失。另外，蒸魚糕等水產糜制品若加熱過度，則食品過度硬化，柔嫩度被破壞，脫水也趨于增加。
一直以來，已知采用使用有機酸單甘油酯的方法(日本特開昭49-20353號公報)、使用卵磷脂等表面活性劑的方法(日本特開平4-148663號公報)、使用鹽類等的方法(日本特開平4-36167號公報)和使用酶的方法(日本特開平4-278063號公報)來抑制由加工處理引起的肉的硬化。作為賦予水產糜制品以柔嫩度的方法，已知將轉谷氨酰胺酶和堿金屬鹽結合使用的方法(日本特開平8-80176號公報)。另外，通過添加多磷酸鹽或糖類來解決因加工處理引起的肉的保水能力下降以及產率降低的問題已眾所周知。多磷酸鹽具有使作為肌肉蛋白質的肌球蛋白和肌動蛋白解離的作用，對于提高肉制品的粘結性和產率具有顯著效果，但由于擔心阻礙鈣的吸收作用等，從消費者的角度考慮也強烈要求排除聚合磷酸鹽。此外，采用使轉谷氨酰胺酶起作用的方法(日本專利第2630829號)、使用經凝乳酶分解的酪蛋白堿鹽和鈣離子的混合水溶液的方法(日本特開平3-94624號公報)、使含有氯化鈉和淀粉的液體被肉食吸收的方法(日本特開平6-343424號公報)等來改善肉食、魚肉加工品的保水性或凝膠化性。關于蛋白質脫酰胺酶在肉制品、水產糜制品中的應用，已知向香腸中添加利用蛋白質脫酰胺酶進行脫酰胺化的大豆蛋白質的方法(日本特開2000-50887號公報)。這樣，對于由肌肉蛋白質的變性而引起的食品加工中的各種問題，雖然對每種情況都采取了各種解決方法，但是近來消費者需求多樣化，上述對策還很難說是充分的。
尚需說明的是，日本特開2000-50887號公報中記載著蛋白質脫酰胺酶作用于肌球蛋白、肌動蛋白等肉蛋白質，但只記載著蛋白質脫酰胺酶對肉蛋白質的反應性，關于使該酶與含有肌肉蛋白質的原料作用的效果并沒有具體記載。即，日本特開2000-50887號公報中公開的技術提高了食材中添加的分離蛋白質的功能性(可溶性、分散性、起泡性、泡沫穩定性、乳化性、乳化穩定性等)，關于下述的本申請發明的效果，即針對肉制品、水產糜制品，提高其加熱后的產率、抑制保存中脫水的效果、改善食感使之順滑、柔嫩且柔軟的效果既沒有記載也沒有暗示。在日本特開2000-50887號公報中，作為原料添加的脫酰胺化大豆蛋白質在最終制品中僅含極少量，而且該蛋白質是在80℃下加熱處理30分鐘得到的，因此酶失活、在香腸中該酶對肉蛋白質并不起作用，在這方面也與本發明的制造方法有所區別這當然是不言而喻的。

發明內容
本發明提供可以抑制含有肌肉蛋白質的食品因加工(加熱、冷凍、冷藏等)、保存中產生的該蛋白質變性而引起的產率下降、脫水，保持柔嫩且柔軟的食感，抑制味道、風味劣化的食品和上述食品的制造方法。
鑒于上述課題，本發明人等進行了深入研究，結果發現通過向含有肌肉蛋白質的食材中添加蛋白質脫酰胺酶并使該酶與肌肉蛋白質發生作用可以解決上述課題，從而完成了本發明。即，本發明內容如下。
1.肉制品或水產糜制品的制造方法，其特征在于向含有肌肉蛋白質的食材中添加蛋白質脫酰胺酶，使該酶與該肌肉蛋白質發生作用。
2.上述1的方法，其特征在于肌肉蛋白質為來源于畜肉、鳥肉、魚肉、軟體動物或甲殼類的肌肉蛋白質。
3.上述1或2的方法，其特征在于相對于1g食材而言蛋白質脫酰胺酶的添加量為0.01～100單位。
4.肉制品或水產糜制品，其特征在于其是通過上述1至3中任一項的方法得到的。
5.肉食軟化劑，其特征在于該肉食軟化劑含有蛋白質脫酰胺酶。
本發明中的蛋白質脫酰胺酶具有直接作用于蛋白質的酰氨基進行脫酰胺而不伴有肽鍵斷裂和蛋白質交聯的作用。只要具有該作用即可，對其種類沒有特別限定。這種酶的例子有日本特開2000-50887號公報或日本特開2001-21850號公報中公開的酶，但并不特別受限于此。蛋白質脫酰胺酶可以使用由產生蛋白質脫酰胺酶的微生物培養液制備的酶。對蛋白質脫酰胺酶的制備中使用的微生物沒有特別限定。
關于由微生物培養液制備蛋白質脫酰胺酶的方法，可以使用公知的蛋白質分離、純化方法(離心、UF濃縮、鹽析、使用離子交換樹脂等的各種層析法等)。例如，將培養液離心除去菌體，之后組合鹽析、層析法等可以得到目標酶。當從菌體內回收酶時，例如通過加壓處理、超聲波處理等將菌體破碎，之后按照與上述同樣的方法進行分離、純化，可以得到目標酶。尚需說明的是，可以通過過濾、離心處理等事先從培養液中回收菌體，之后再進行上述一系列的工序(菌體的破碎、分離、純化)。可以通過冷凍干燥、減壓干燥等干燥方法將酶粉末化，此時可以使用適當的賦形劑、干燥助劑。
本發明的蛋白質脫酰胺酶的活性按照將日本特開2000-50887號公報記載的方法改良后的方法、即下述方法來測定。
(1)向100μl含30mM Z-Gln-Gly的176mM磷酸緩沖液(pH6.5)中添加10μl含蛋白質脫酰胺酶的水溶液，在37℃下溫育10分鐘后，加入100μl 12％TCA溶液終止反應。
(2)此時，用20mM的磷酸緩沖液(pH6.0)進行適當稀釋，使酶濃度達到0.05mg/ml，離心(12000rpm，4℃，5分鐘)后利用F-kit氨(Roche制)測定上清液中的NH3量。
(3)向100μl試劑II液(F-kit附屬品)中加入10μl上清液和190μl 0.1M的三乙醇胺緩沖液(pH8.0)，在室溫下放置5分鐘后使用100μl來測定340nm下的吸光度。向剩下的200μl加入1.0μl試劑III(F-kit附屬品，谷氨酸脫氫酶)后再在室溫下放置20分鐘，之后測定剩下的200μl在340nm下的吸光度。使用F-kit附屬的氨標準液作成的表示氨濃度和吸光度(340nm)變化量的關系的標準曲線，由該曲線求出反應液中的氨濃度。
(4)蛋白質濃度的測定使用蛋白質分析CBB(考馬斯亮藍)溶液(ナカラィテスク制)在檢測波長595nm下進行測定。使用BSA(Pierce)作為標準。
(5)通過下式求出蛋白質脫酰胺酶的活性。
比活性(U/mg)＝(反應液中的氨濃度(μmol/ml)×反應液量(ml)×酶稀釋率)÷(酶量(ml)×蛋白質濃度(mg/ml)×反應時間(min))本發明中的肌肉蛋白質為存在于肌纖維中的肌漿蛋白、與肌肉收縮有關的肌原纖維蛋白或存在于結締組織中的結締組織蛋白質。肌漿蛋白是細胞質可溶性蛋白質，其例子有含有與糖酵解系統相關的大部分酶的白蛋白、肌紅蛋白等。肌原纖維蛋白的例子有作為主要構成成分的肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、肌聯蛋白等。結締組織蛋白質的例子有作為主要構成蛋白質的骨膠原、彈性蛋白。該肌肉蛋白質通過各種加工等處理成為變性的原料、例如使骨膠原變性而得到的明膠等也包含在本發明的含有肌肉蛋白質的食品原料中。
含有肌肉蛋白質的食材是指例如畜肉、鳥肉、魚肉或軟體動物或甲殼類的肌肉、所謂的肉，是指除骨、牙齒、爪以外的包括肌肉、脂肪、血液、腱、內臟、髓、腦的部位。具體為來源于下述動物的肉牛、豬、羊等畜產動物；雞、野鴨、鴕鳥等鳥類；沙丁魚、金槍魚、鮭魚、鱈魚等魚類；章魚、墨魚等軟體動物；蟹、蝦等甲殼動物；鱷魚、蛇等爬行類；蛙等兩棲類，本發明中使用的原料不論任何種類均可。
用上述食材加工的肉制品可列舉如火腿、香腸、叉燒肉、肉丸子、漢堡包、炸肉丸(ミ-トロ-フ)、肉糕、烤牛肉、烤豬肉等，還包括分割肉食；經煮、烤等加熱加工的肉食；經過酶或機械軟化處理的肉食。水產糜制品可列舉出磨碎的魚肉、魚糕、蟹糕、魚肉山芋丸子、魚卷、炸魚糕、氽魚丸子、魚肉火腿、魚肉香腸、魚丸等，只要是由肉蛋白質制成的制品即可，對其種類沒有限定。
向食材中添加蛋白質脫酰胺酶的方法為當為香腸、魚糕等糜制品時，可以在將食材切細、磨碎、糊化的過程中將酶液或酶粉末單獨或與調料等其他原料一起添加，也可以在糊化后將酶液或酶粉末單獨或與調料等其他原料一起添加。當為火腿等時，可以將酶液注入到原料肉中，也可以將原料肉浸在酶液中。還可以將酶液或酶粉末撒在原料肉上。添加酶的方式可以是將酶粉末與粉末原料事先混合來使用，也可以將酶溶解在調味液等液體原料中來使用。
相對于1g食材即1g原料肉，蛋白質脫酰胺酶的添加量優選0.01～100單位，更優選0.1～10單位。對蛋白質脫酰胺酶的反應條件(反應時間、溫度、反應體系的pH等)沒有特別限定，優選的反應溫度為5～70℃。反應體系的pH優選2～10，更優選為4～8，進一步優選為pH5～8。反應時間優選10秒～5天，更優選為10分鐘～24小時。上述條件可以根據使用的酶的純度或食材中含有的蛋白質的種類或狀態、純度等適當變更或調節。
實施發明的最佳方式以下列舉實施例來更詳細地說明本發明。本發明并不受該實施例的任何限制。
實施例1本實施例中，蛋白質脫酰胺酶使用來源于金黃桿菌屬(Chryseobacterium)的蛋白質谷氨酰胺酶。來源于解朊金黃桿菌(Chryseobacterium proteolyticum)株的蛋白質谷氨酰胺酶(EC.3.5.1)基因的序列已經確定[Eur.J.Biochem.268.1410-1421(2001)]。以該序列為參考，進行向谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中使用頻率高的密碼子的變換，構建序列號1所示的基因序列。該序列包括蛋白質谷氨酰胺酶的信號序列(pre部分)和pro部分以及成熟型蛋白質谷氨酰胺酶的編碼區。通過合成來制作全基因序列。以構建的序列號1的基因序列信息為基礎，合成序列號5(5’-CATGAAGAACCTTTTCCTGTC-3’)和序列號6(5’-GTAAAAGGATCCATTAATTAAAATCC-3’)所示序列的引物。序列號5所示的引物包括蛋白質谷氨酰胺酶的信號序列的N末端序列，序列號6所示的引物包括成熟型蛋白質谷氨酰胺酶的C末端和BamHI的識別序列。以具有序列號1所示序列的DNA為模板，使用序列號5和序列號6所示序列的引物進行PCR，擴增蛋白質谷氨酰胺酶的pro部分和成熟型蛋白質谷氨酰胺酶的編碼區。將該PCR片段插入到日本特開平9-070291號公報記載的pVC7的SmaI部位后，導入到大腸桿菌(E.coli)JM109的感受態細胞(寶酒造公司制)中。取得保持克隆有蛋白質谷氨酰胺酶基因的質粒的菌株，回收質粒。測定該質粒中克隆片段的堿基序列，確認與序列號1所示序列一致。
來源于大腸桿菌的包括TorA信號肽的TorA基因序列已經確定(Mol.Microbiol.111169-1179(1994))。以該序列為參考，合成序列號7(5’-ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGG-3’)和序列號8(5’-CCGGATCCTGGTCATGATTTCACCTG-3’)所示的引物，以按照常規方法(齊藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制備的大腸桿菌W3110株的染色體DNA為模板，通過PCR法擴增TorA編碼區和位于其上游的包括信號序列的區域。PCR反應中使用PyrobestDNA聚合酶(寶酒造公司制)，反應條件采用本領域技術人員推薦的方案。應說明的是，序列號8的序列包括限制酶BamHI的識別序列。編碼TorA的信號序列的DNA序列如序列號3所示。
以國際公開小冊子WO01/23591記載的質粒pPKSPTG1為模板，通過使用具有序列號9(5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’)、序列號10(5’-AAGAGATCGTTATTGTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG-3’)所示序列的引物進行PCR，擴增編碼啟動子和信號肽的區域。序列號10的序列包括編碼TorA信號肽的基因的5’末端的序列。其次，將該PCR產物、以及包括由具有序列號7和序列號8所示序列的引物擴增的包括編碼TorA的基因序列和位于其上游的信號序列的區域的PCR產物按1∶1進行混合，以它們為模板，利用具有序列號8和序列號9所示序列的引物來進行交換(crossover)PCR。由此使包括含有PS2啟動子區域的序列、TorA信號序列和編碼TorA的序列的融合基因得到擴增。將該交換PCR產物用限制酶ScaI和BamHI消化后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測出約3.1kbp的DNA片段。從瓊脂糖凝膠中切出該DNA片段，使用EasyTrapVer.2(寶酒造公司制)進行回收，將其插入到日本特開平9-322774號公報記載的質粒pPK4的ScaI-BamHI部位，得到質粒pPKT-TorA。測定插入到該質粒中的基因序列的堿基序列的結果，確認構建了預想的融合基因。以該質粒為模板，使用具有序列號9和序列號11(5’-GATTTCCTGGTTGCCGTTGGAATCCGCAGTCGCACGTCGCGGCG-3’)所示序列的引物，通過PCR來擴增包括PS2的啟動子區域和編碼TorA信號肽的區域的部分。應說明的是，序列號11所示的序列具有編碼帶有pro結構的蛋白質脫酰胺酶的區域的5’末端序列。其次，以克隆有蛋白質谷氨酰胺酶的質粒為模板，通過使用具有序列號6和序列號12(5’-GATTCCAACGGCAACCAGGA-3’)所示序列的引物進行PCR，擴增編碼帶有pro結構的蛋白質谷氨酰胺酶的區域。并將這些PCR產物按1∶1進行混合，以它們為模板，通過使用具有序列號6和序列號9所示序列的引物來進行交換PCR，擴增PS2啟動子區域和TorA信號序列與編碼帶有pro結構的蛋白質脫酰胺酶的基因的融合基因。將該PCR產物用限制酶ScaI和BamHI消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測出約3.1kbp的DNA片段。從瓊脂糖凝膠中切出該DNA片段，使用EasyTrapVer.2(寶酒造公司制)進行回收，將其插入到日本特開平9-322774號公報記載的質粒pPK4的ScaI-BamHI部位，得到質粒pPKT-PPG。測定質粒中的插入序列的堿基序列，確認構建了預想的融合基因。應說明的是，帶有pro結構的蛋白質谷氨酰胺酶的氨基酸序列如序列號2所示，TorA信號肽的氨基酸序列如序列號4所示。但是，直接按照天然型蛋白質谷氨酰胺酶的氨基酸序列利用市售蛋白酶進行成熟化時，預測不能正確切斷pro序列。因此，為了將pro序列切斷使其具有與天然型蛋白質谷氨酰胺酶的N末端序列相同的序列，將pro序列的C末端序列“QTNK”變更為“FGPK”。向“FGPK”變更時使用具有序列號13(5’-CTTGGGGCCGAAGCCCTTGACTTCTTTGGTCAG-3’)和序列號14(5’-TTCGGCCCCAAGTTGGCGTCCGTCATTCCAGAT-3’)所示序列的引物。序列號13的序列是用于擴增pro序列部分的引物，序列號14的序列是用于擴增成熟體部分的引物。以pPKT-PPG為模板，使用具有序列號12和序列號13所示序列的引物來擴增蛋白質谷氨酰胺酶的pro序列部分，使用具有序列號14和序列號6所示序列的引物來擴增蛋白質谷氨酰胺酶的成熟體部分。并且，將它們的PCR產物按1∶1進行混合，以它們為模板通過使用具有序列號6和序列號12所示序列的引物來進行交換PCR，擴增帶有pro序列C末端變更為FGPK的pro結構的蛋白質谷氨酰胺酶基因。將該交換PCR產物克隆在pUC18的SmaI位點(pUCPPG(FGPK))，進行堿基序列的確認時發現pro序列已變更。其次，連接pPKT-PPG的AatII-BstPI片段(大)和pUCPPG(FGPK)的AatII-BstPI片段(小)，構建pPKT-PPG(FGPK)。
使用構建的質粒pPKT-PPG(FGPK)，對谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)ATCC13869進行轉化，選擇在含有25mg/l卡那霉素的CM2G瓊脂培養基上生長的菌株。在30℃下將選擇的菌株在含有25mg/l卡那霉素的MM液體培養基中培養48小時。用過濾器(0.45μm)過濾谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)培養液的離心上清液，使用超濾膜(排除分子量1萬以下)濃縮該濾液。用50mM的磷酸緩沖液(pH7.5)進行緩沖液交換，通過胰蛋白酶切斷蛋白質脫酰胺酶的pro結構部分，進行成熟化。之后，再次進行濃縮、緩沖液交換(20mM醋酸緩沖液，pH5.0)，將該濃縮樣品供給陽離子交換層析，回收蛋白質脫酰胺酶的活性組分，作為酶純品。按照上述方法測定酶純品中的蛋白質的活性時，活性為約100～140U/mg。
將100重量份豬腕(豚腕)肉餡、20重量份10％食鹽水裝入食物切碎機中混合15秒鐘后，加入5重量份水(對照品)。將100重量份豬腕肉餡、20重量份10％食鹽水裝入食物切碎機中混合-細切15秒鐘后，相對于1 g豬腕肉餡，將相當于0.1單位的上述蛋白質脫酰胺酶純品(100U/mg)添加到5重量份水中混合后，將其加入到豬肉中(試驗品1)。與試驗品1同樣，相對于1g豬腕肉而言，將餡添加了相當于0.2單位的蛋白質脫酰胺酶純品的試驗品作為試驗品2、添加了相當于1單位的蛋白質脫酰胺酶純品的試驗品作為試驗品3、添加了相當于10單位的蛋白質脫酰胺酶純品的試驗品作為試驗品4。將各原料合并后，用刮鏟攪拌，再次用食物切碎機混合15秒鐘。重復該攪拌、混合的操作4次，之后填充到直徑為3cm的骨膠原人造腸衣管中，在5℃下靜置1小時。之后將其經在60℃的干燥環境下干燥40分鐘、在75℃下蒸煮2小時的工序，冷卻。應說明的是，酶添加品(試驗品1～4均為本發明品)在干燥工序中進行酶反應，在蒸煮工序中酶基本失活。測定對照品和試驗品1～4的加熱產率和物理性質，并通過感官檢驗來評價食感和味道。加熱產率用加熱后重量/加熱前重量(％)表示。關于物理性質，將試驗品切成高為3cm的圓柱，使用結構分析儀(STABLEMICROSYSTEMS制，TA.XT2i)測定在斷面上以1mm/秒刺破5mm球時的斷裂應力。感官評價中將切至3cm厚的樣品讓8名訓練有素的評審員試吃，評價硬度、柔嫩度。評價結果如表1所示。
與對照品相比，試驗品2～4柔軟且順滑度提高，綜合評價也基本有所提高。試驗品2～4呈強烈的布丁樣食感，口感順滑，斷面有光澤，紋理趨于變得細膩，作為細切型香腸品質理想。相對于1g食材蛋白質脫酰胺酶的添加量為1單位以上時上述效果顯著，但即使添加0.1單位也可以達到上述效果。并且，將對照品和試驗品3密封，在90℃的水中煮10分鐘后進行感官評價時，對照品食感變硬，而試驗品3仍維持順滑的食感。
表1.香腸的感官評價結果

實施例2將FA級冷凍磨碎魚肉解碎成薄片狀，取1,000g磨碎魚肉用斯蒂芬切碎機切細，攪拌(低速1.5分鐘→中速1.5分鐘→高速1.5分鐘)。接著，加入30g食鹽和600g冰水，用斯蒂芬切碎機切細，攪拌(低速1.0分鐘→中速30秒→高速2分鐘)。其次，添加50g馬鈴薯淀粉“ェスサン銀領”(味之素(株)制)、50g砂糖、20g料酒、10g鮮味料“味之素”(味之素(株)制)和每1g原料磨碎魚肉添加5單位按照實施例1記載的方法制備的蛋白質脫酰胺酶純品(100U/mg)，之后再次用斯蒂芬切碎機以中速進行攪拌直至樣品溫度達到8～10℃。將由此得到的肉糜填充到氣密性的亞乙烯腸衣管中，在40℃下加熱放置40分鐘后，在85℃下加熱30分鐘，得到魚糕香腸(試驗品)。對照則不添加酶而以同樣的方法在40℃下加熱放置40分鐘來試制魚糕(對照品)。針對上述魚糕，使用結構分析儀測定在斷面上以1mm/秒刺破5mm球時的斷裂應力和洼陷(斷裂時的形變)。測定加熱后的產率、觀察保存兩周后的脫水狀態并進行感官評價。其結果如表2所示。
如表2所示，與對照品相比，試驗品(本發明品)的斷裂應力下降，洼陷增加。另外，本發明品其食感變得柔軟且柔嫩。加熱后測定去除脫水后的重量，結果本發明品重量變化少，相對于對照品而言加熱產率提高。另一方面，味道、風味等與對照品相同。并且，觀察在5℃下冷藏保存兩周后的脫水狀態，結果本發明品的蒸魚糕幾乎沒有脫水，食感、味道、風味等也和保存前相同。
表2.魚糕的感官評價結果

◎非常令人滿意；○令人滿意；△一般×不令人滿意±略有一些；+++多使用按照相同方法制備的魚糕進行強制脫水評價。研究高壓釜(121℃，30分鐘)處理后產生的脫水和-30℃下冷凍、融化后產生的脫水這兩個項目。脫水率以脫水重量(g)/處理前的重量(g)來計算。其結果如表3所示。本發明品的脫水率均得到抑制，特別是每1g原料添加0.2單位以上蛋白質脫酰胺酶時脫水率得到顯著抑制。這樣，添加蛋白質脫酰胺酶而制備的魚糕即使進行容易產生脫水的處理，其脫水也被抑制。
表3.魚糕的強制脫水評價

使用按照相同方法制備的魚糕，測定由電爐加熱(500W，20～60秒)引起的水分損失量，進行保水性評價。結果如表4所示。通過向每1g磨碎魚肉原料中添加0.1單位以上的蛋白質脫酰胺酶，水分損失量得到抑制，抑制效果依賴于酶濃度而提高。對照品魚糕表面干燥且硬、皺紋多，而本發明品柔嫩、維持著彈力狀態。在食感方面，對照品發生硬化、柔嫩度受到破壞，而本發明品幾乎未發現柔軟度和柔嫩度的劣化。這表明本發明品由加熱引起的水分蒸發和由此引起的食感劣化(變硬、柔嫩度受到破壞)得到抑制。由本結果可預期，利用本發明來提高實施了壓熱處理或燉等過度加工處理的含肉蛋白質食品的品質。
表4.魚糕的保水性評價

水分蒸發率(％)＝電爐處理后的重量/電爐處理前的重量×100(單位％)實施例3將100重量份豬里脊肉、20重量份10％食鹽水、5重量份水合并，真空包裝后在冷藏條件下使其在揉肉機中旋轉一晚進行鹽漬(對照品)。相對于1g豬里脊肉，將按照實施例1記載的方法制備的蛋白質脫酰胺酶純品(100U/mg)按0.1單位、1單位、5單位相當量溶解在水中，按照與對照品相同的要領鹽漬豬里脊肉(分別為試驗品1～3均為本發明品)。第二天，將鹽漬的肉填充到氣密性的圓筒亞乙烯腸衣(直徑7cm)中，經在60℃的干燥環境下干燥60分鐘，繼續在60℃下煙熏30分鐘，并在60℃下蒸煮2小時和在75℃下蒸煮30分鐘的工序，冷卻，得到火腿。測定對照品和試驗品1～3除掉脫水后的重量，算出加熱后重量/加熱前重量(％)的值，求出加熱產率。并且使用切至2mm厚的火腿，由8名評審員進行感官評價。感官評價中，首先通過手摸來評價火腿的切割面光滑度，接著試吃，對硬度、潤濕感按5個等級進行評價。試制結果如表5所示。
本發明品的加熱產率與對照品相比有所增加，酶添加量越多效果越好。本發明品火腿的切割面非常光滑，食感也柔軟。并且本發明品在咀嚼時松散感明顯減少，咽下時的吞咽次數少，因此評價為容易吞咽。
表5.火腿的感官評價結果

研究以相同的記載方法試制的火腿中每1g肉添加1單位酶而制作的火腿的再加熱脫水。即，測定將火腿真空包裝后在沸水(100℃)中加熱5分鐘后產生的脫水量，求出脫水率(脫水率(％)＝脫水量(g)/原來的重量(g))。結果如表6所示。與對照品相比，本發明品火腿的脫水率減少。該結果表明，將包裝后的火腿表面再加熱來進行殺菌時脫水受到抑制，品質可以得到提高。
表6.火腿的再加熱脫水

實施例4按表7所示的食譜制備兩種浸漬液。即，僅含食鹽的浸漬液(對照品)、含蛋白質脫酰胺酶的浸漬液(試驗品)。用作原料的豬里脊肉塊事先切斷肌腱，測定各自的重量，每100g肉原料加入各25g浸漬液，真空包裝。在4℃下靜置12小時使浸漬液充分擴散到肉中，得到腌制肉。再用電熱板(約160℃)將正反面各烤1.5分鐘，得到烤肉。通過下式計算烤制時的加熱產率。
加熱產率(％)＝(加熱后的固體部分重量)/(加熱前的總重量)并且，由7名評審員進行感官評價，對“肉的柔軟度”按5個等級進行評價。
加熱產率和感官評價的結果如表8所示。與使用對照品浸漬液的豬肉相比，使用試驗品浸漬液的豬肉(本發明品)其加熱產率提高。另外，與使用對照品浸漬液的豬肉相比，使用試驗品浸漬液的豬肉(本發明品)保持肉原本具有的纖維感，多汁且食感柔軟，嚼起來有種沙沙感。除豬里脊肉之外，即使用牛腰肉、雞胸肉來進行同樣的試制，也可得到同樣的效果。即，利用蛋白質脫酰胺酶可以軟化肉食，由此確認該酶可以用作肉食軟化劑。
表7.浸漬液配方

表8.烤肉的產率和感官評價結果

比較例1如實施例4所示，本發明中使用的蛋白質脫酰胺酶與用于使肉柔軟而經常使用的蛋白酶具有相同的效果。因此，將其與蛋白酶進行比較。向表7記載的浸漬液中溶解相對浸漬液為0.01％的蛋白酶制劑(木瓜蛋白酶，天野酶制)來代替蛋白質脫酰胺酶，按照與實施例7相同的方法制備豬里脊肉和雞胸肉的鹽漬肉。烤制豬里脊肉，雞胸肉真空包裝后在沸水中加熱10分鐘。對它們進行感官評價，發現蛋白酶使用品雖然在硬度方面均變得柔軟，但肉特有的纖維感被破壞，品質與本發明品不同。特別是雞肉，由于軟化過度，一部分雞肉溶化，肉完全沒有咬頭。這樣，若使用蛋白酶作為肉食軟化劑，當反應過度進行時會導致過度軟化、肉質(味道、食感)下降，因此問題在于該反應非常難以控制。但是蛋白質脫酰胺酶使肉保持本來的適度纖維感，當用作肉食軟化劑時反應非常容易控制，不易受流通、保存時間的影響，因此可以供應品質穩定的商品。這是由于蛋白質脫酰胺酶的軟化機制不是分解肉食蛋白質，而是緩和肉食蛋白質的加熱凝聚性。
產業應用性根據本發明，可以提供抑制含肌肉蛋白質的食品因加工(加熱、冷凍、冷藏等)、保存中發生的該蛋白質變性而引起的產率下降、脫水，保持柔嫩且柔軟的食感，抑制味道、風味劣化的食品和這種食品的制造方法，因此本發明在食品領域中是非常有用的。
序列表<110>味之素株式會社<120>肉制品或水產糜制品及其制造方法<130>2005-002<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>963<212>DNA<213>Chyrseobacterium proteolyticum<220>
<221>misc_feature<223>蛋白質谷氨酰胺酶核苷酸序列<400>1atgaagaacc ttttcctgtc catgatggcc ttcgtgaccg tcctcacctt caactcctgc 60gccgattcca acggcaacca ggaaatcaac ggcaaggaga agctttccgt taacgattct120aagctgaagg atttcggcaa gaccgttccg gttggcatcg acgaagagaa cggcatgatc180aaggtgtcct tcatgttgac tgcgcagttc tacgagatca agccaaccaa ggaaaacgag240cagtacatcg gtatgcttcg ccaggctgtt aagaacgaat ctccagtcca cattttcctc300aagccaaaca gcaatgaaat cggcaaggtg gagtctgcat ccccagagga cgtccgctac360ttcaagacga tcctgaccaa agaagtcaag ggccagacca acaaattggc gtccgtcatt420ccagatgtgg ctaccctcaa ctctctcttc aaccaaatca agaaccagtc ttgcggtacc480tctacggcgt cctccccatg catcaccttc cgctacccag tcgacggctg ctacgcacgc540gcccacaaga tgcgccagat cttgatgaac aacggctatg actgtgagaa gcaattcgtg600tacggtaacc tcaaggcatc caccggcacc tgctgcgtgg cgtggagcta ccacgttgca660atcttggtga gctacaaaaa cgcttccggc gtgacggaaa aacgcattat tgatccatcc 720
cttttttcca gcggtcctgt gaccgatacc gcatggcgca acgcttgcgt taacacctct780tgcggctctg catccgtttc ctcttacgct aacaccgcag gaaatgttta ttaccgctcc840ccatccaatt cttacctgta tgacaacaat ctgatcaata ccaactgtgt cctgactaaa900ttctccctgc tttccggctg ttctccttca cctgcaccgg atgtctccag ctgtggattt960taa 963<210>2<211>320<212>PRT<213>Chyrseobacterium roteollyticum<220>
<221>MISC_FEATURE<223>蛋白質谷氨酰胺酶氨基酸序列<400>2Met Lys Asn Leu Phe Leu Ser Met Met Ala Phe Val Thr Val Leu Thr1 5 10 15Phe Asn Ser Cys Ala Asp Ser Asn Gly Asn Gln Glu Ile Asn Gly Lys20 25 30Glu Lys Leu Ser Val Asn Asp Ser Lys Leu Lys Asp Phe Gly Lys Thr35 40 45Val Pro Val Gly Ile Asp Glu Glu Asn Gly Met Ile Lys Val Ser Phe50 55 60Met Leu Thr Ala Gln Phe Tyr Glu Ile Lys Pro Thr Lys Glu Asn Glu65 70 75 80Gln Tyr Ile Gly Met Leu Arg Gln Ala Val Lys Asn Glu Ser Pro Val85 90 95His Ile Phe Leu Lys Pro Asn Ser Asn Glu Ile Gly Lys Val Glu Ser100 105 110Ala Ser Pro Glu Asp Val Arg Tyr Phe Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu115 120 125Val Lys Gly Gln Thr Asn Lys Leu Ala Ser Val Ile Pro Asp Val Ala130 135 140Thr Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Ile Lys Asn Gln Ser Cys Gly Thr
145 150 155 160Ser Thr Ala Ser Ser Pro Cys Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly165 170 175Cys Tyr Ala Arg Ala His Lys Met Arg Gln Ile Leu Met Asn Asn Gly180 185 190Tyr Asp Cys Glu Lys Gln Phe Val Tyr Gly Asn Leu Lys Ala Ser Thr195 200 205Gly Thr Cys Cys Val Ala Trp Ser Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser210 215 220Tyr Lys Asn Ala Ser Gly Val Thr Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser225 230 235 240Leu Phe Ser Ser Gly Pro Val Thr Asp Thr Ala Trp Arg Asn Ala Cys245 250 255Val Asn Thr Ser Cys Gly Ser Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr260 265 270Ala Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Asn Ser Tyr Leu Tyr Asp275 280 285Asn Asn Leu Ile Asn Thr Asn Cys Val Leu Thr Lys Phe Ser Leu Leu290 295 300Ser Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ala Pro Asp Val Ser Ser Cys Gly Phe305 310 315 320<210>3<211>117<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>misc_feature<223>TorA信號序列核苷酸序列<400>3atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcg 117<210>4
<211>39<212>PRT<213>Escherichia coli<220>
<221>MISC_FEATURE<223>TorA信號肽<400>4Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala1 5 10 15Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu20 25 30Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala35<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>5catgaagaac cttttcctgt c 21<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>6gtaaaaggat ccattaatta aaatcc26<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>7atgaacaata acgatctctt tcagg 25<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>8ccggatcctg gtcatgattt cacctg 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>9aaattcctgt gaattagctg atttag 26<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>10aagagatcgt tattgttcat agaggcgaag gctccttgaa tag 43<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11gatttcctgg ttgccgttgg aatccgcagt cgcacgtcgc ggcg44<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>12gattccaacg gcaaccagga 20<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>13cttggggccg aagcccttga cttctttggt cag33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>14ttcggcccca agttggcgtc cgtcattcca gat3權利要求
1.肉制品或水產糜制品的制造方法，其特征在于向含有肌肉蛋白質的食材中添加蛋白質脫酰胺酶，使該酶與該肌肉蛋白質發生作用。
2.權利要求1的方法，其特征在于肌肉蛋白質為來源于畜肉、鳥肉、魚肉、軟體動物或甲殼類的肌肉蛋白質。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于相對于1g食材蛋白質脫酰胺酶的添加量為0.01～100單位。
4.肉制品或水產糜制品，其特征在于該產品是通過權利要求1至3中任一項的方法得到的。
5.肉食軟化劑，其特征在于該肉食軟化劑含有蛋白質脫酰胺酶。
全文摘要
向含有肌肉蛋白質的食材中添加蛋白質脫酰胺酶，使該酶與肌肉蛋白質發生作用，從而得到優質的食品。
文檔編號A23L1/333GK101090644SQ20068000150
公開日2007年12月19日 申請日期2006年1月11日 優先權日2005年1月13日
發明者三輪典子, 中越裕行, 廣瀨文之, 中村奈巳, 小寺智博, 若林秀彥 申請人:味之素株式會社, 天野酶株式會社