專利名稱：一種磁性納米細胞自動分選裝置及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物醫學技術領域，特別是涉及利用磁性納米粒子進行細胞分選的裝置。
背景技術：
自20世紀80年代起，造血干細胞移植成為惡性腫瘤(如一些惡性血液病和非血液系統的實體瘤等)大劑量放療、化療后造血支持治療的主要措施。有了造血干細胞移植的支持，臨床醫生就可以使用超大劑量的放療、化療，最大限度地消除患者體內的癌細胞，然后植入造血干細胞，重建被破壞的造血和免疫系統，提高了惡性腫瘤的治療效果和病人的生存期。由于成人體內造血干細胞主要存在于骨髓中，因此最初最多采用骨髓來源的造血干細胞進行移植。后來動員的外周血成為造血干細胞移植的另一來源。與骨髓移植相比，外周血干細胞移植具有幾個顯著的有點，如采集方便、造血功能重建快、免疫功能恢復早、并發癥輕等。1988年，第一例應用人類臍帶血移植治療凡科尼貧血癥的成功開創了人類臍帶血移植的先河。臍帶血含有豐富的造血干細胞/祖細胞，并且其免疫細胞的抗原性較弱，移植相關的移植物抗宿主病(GVHD)相對骨髓和外周血發生較低、嚴重程度較弱，因此被認為是極具潛力的繼骨髓和外周血后的第三種造血干細胞的來源。隨著同胞間臍帶血移植的發展，人們又把目光轉移到非血緣臍帶血移植上來。其前提是建立臍帶血庫。2005年6月4日青年報報導了上海市臍帶血采集重新啟動。臍帶血造血干細胞是用來根治白血病的有效手段，據統計，我國白血病患者以每年十萬分之四的速度增長，每年新發病的患者就達4萬-5萬人，其中少年兒童占50％。雖然造血干細胞捐獻者資料庫的入庫人數已經達到了26萬人，但還是遠遠滿足不了白血病患者移植的需求。
進行造血干細胞移植前首先必須對干細胞進行分離純化，其目的在于在異體PBSCT中它可去除T細胞、減少和減輕GVHD發生、尤其是提高了供受者2-3個HLA位點不合間移植的安全性；在自體PBSCT中它可凈化殘留腫瘤細胞而減少移植后的復發；對難治性自身免疫性疾病可經干細胞純化除去異常免疫細胞；同時經純化后可以提高干細胞體外擴增及基因轉導的效率等。最初分離富集造血干細胞的方法是依據造血干細胞具有細胞體積小，浮力密度低等物理學特性。采用包括速度離心沉淀，密度梯度離心以及后來的逆流離心淘洗等技術進行分離。七十年代中后期流式細胞分析及分選技術和單克隆抗體的出現和發展，使細胞分離技術出現了質的飛躍。應用單克隆抗體熒光染色與流式細胞分選相結合的熒光激活細胞分選技術極大地提高了細胞分離純化的效率，使得高效快速分離純化一些含量極少的細胞群成為可能。近年出現的免疫磁珠細胞分離技術，進一步簡化了分離的程序并提高了分離效率。在此基礎上，我們研發了一種利用磁性納米粒子進行造血干細胞自動分選的裝置，可以在密閉系統內無菌地分選大量細胞。其主要特性是自動、省時、安全、高效。可廣泛應用于生物學、醫學等多個領域。
發明內容
所要解決的技術問題本發明所要解決的技術問題是提供一種磁性納米細胞自動分選裝置及其應用，以克服現有分選系統無法實現自動化和大量細胞的分選。
技術方案本發明的技術方案之一是提供一種磁性納米細胞自動分選裝置，至少由磁性分選系統、樣品傳輸系統和電腦控制系統組成，其特征在于，所說的磁性分選系統中至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動磁場，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性納米粒子。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之一為，所說的可移動磁場強度為4000-6000高斯。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之二為，所說的磁性納米粒子-生物分子復合物粒徑范圍為50～200nm。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之三為，所說的磁性納米粒子-生物分子復合物為磁性納米粒子表面連接CD34單克隆抗體所構成的復合物。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之四為，所說的磁性納米粒子-生物分子復合物為γ-Fe2O3磁性納米粒子表面用殼聚糖包裹繼而連接CD34單克隆抗體所構成的復合物。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之五為，所說的磁性分選系統由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成，且所說的磁性納米分離液中含有磁性納米粒子-生物分子復合物。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之六為，所說的分選單元至少由一個永久性磁鐵和一個鐵磁化的基材組成。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之七為，所說的樣品傳輸系統是由蠕動泵、閥門及管道組成的細胞懸液輸送和洗滌系統。
上述的磁性納米細胞自動分選裝置的優選方案之八為，所說的電腦控制系統由主控模塊控制電磁閥、蠕動泵和步進電機。
本發明的技術方案之二是提供一種利用上述裝置進行磁性納米細胞自動分選的方法。
本發明是通過如下方式實現的自動細胞納米磁性分選裝置由磁性分選系統、樣品傳送系統、電腦控制系統和外殼組成。
(1)磁性分選系統磁性分選系統由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成。特別地，可以有如下部件和性質1)分選單元磁性分選單元由一個特制、高效的永久性磁鐵和一個鐵磁化的基質組成。這種系統可產生強磁性，并且又可快速退磁，當分選單元移出磁場后，柱基質的快速退磁可使吸附有細胞的粒子得以解離。
2)磁性納米分離液可以由化學沉淀法合成具有超順磁性的γ-Fe2O3磁性納米粒子，用殼聚糖包裹磁性納米粒子，形成核殼型超順磁性磁性納米粒子。該磁性納米粒子具有生物相容性和生物降解功能。在核殼型磁性納米粒子上連接生物大分子構建納米粒子-生物分子復合物，以造血干細胞自動磁分選系統為例，生物大分子為CD34單克隆抗體，納米粒子-生物分子復合物與合適的懸浮溶液配制成磁性納米細胞分離液。利用免疫反應，對目的造血干細胞進行磁性標記，從而在磁場中將造血干細胞從細胞混合群體中分離出來。
(2)樣品傳輸系統樣品傳輸部分是由蠕動泵、多個閥門及連接管道組成的血樣懸液輸送和分離洗滌系統。
以上述所說的造血干細胞自動磁分選系統為例，蠕動泵及電磁閥可以采用美國科爾帕默Cole-Parmer公司的產品，Cole-Parmer的Masterflex@系列蠕動泵已有50多年的生產歷史，在美國、歐洲占有市場主導地位，目前在中國被廣泛應用于科研、制藥、監測、生物、環境保護、化學反應過程等廣闊領域，全部符合國際IS9001、CE、UL標準。Masterflex變速數控蠕動泵，無刷免維護電極，雙向運轉，液晶顯示轉速可調，是針對于制藥、血液、組織及細胞培養的Pharmed TC衛生泵，可抵抗臭氧及紫外線輻射，無細胞毒素及無溶血劑，管道可重復高壓消毒不影響壽命。流速可調。
(3)電腦控制系統電腦控制系統負責整個儀器的運作流程，根據該儀器用于醫療衛生領域的要求，所以需要根據產品設計的可靠性、穩定性、準確性和可操作性進行硬件選型及功能設計。具體而言，電腦控制系統由主控模塊控制電磁閥、蠕動泵和步進電機。其模塊結構見附圖1所示。各模塊功能如表1所示。
表1電腦控制系統各模塊功能
(4)自動細胞納米磁性分選裝置還可以配置便于操作各項功能和帶有調節樣品流速、磁場強度和管道/樣品清洗過程的儀器控制表盤的外殼。
有益效果本發明設計開發的大量細胞自動分選儀采用微型計算機和現代控制技術，對分離過程和管道清洗進行全程自動控制，可以批量、安全、精確、快速地對干細胞進行分離，采用該分離系統后，可以使造血干細胞分離成本成倍地降低。用于臨床后可為眾多的腫瘤和免疫疾病的患者帶來治療和治愈的機會，用該分選系統分選后，在異體PBSCT中它可去除T細胞、減少和減輕GVHD發生、尤其是提高了供受者2-3個HLA位點不合間移植的安全性；在自體PBSCT中它可凈化殘留腫瘤細胞而減少移植后的復發；對難治性自身免疫性疾病可經干細胞純化除去異常免疫細胞后行自體移植；還可提高干細胞體外擴增及基因轉導的效率等。
用該分選系統分選后，由于采用的納米粒子具有巨大的表面積，所以對目標細胞的結合速度和結合效率大大提高。分離采用的磁場強度為4000-6000高斯，使磁性納米粒子的磁聚集效果更佳。實驗證實，無論外周血還是骨髓有核細胞分離產物CD34+細胞的純度和回收率皆分別在90％和60％以上，T細胞去除率在90％以上，分離產物CD34+細胞經體外培養證明有很強的增殖能力。磁性納米粒子-生物分子復合物在分選后的細胞溶液中殘留極低，特別是由于采用殼聚糖包裹在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，所以具有生物相容性和生物降解功能，對分選細胞和移植受體安全無毒性。臨床移植后所有移植物皆較快植活，且在未給預防GVHD的情況下移植也是安全的。利用大量細胞自動分選儀分離CD34+細胞，并進行體外擴增，在前期擴增造血干細胞的基礎上中藥蛋白質，加入以人骨髓基質細胞為基礎的體外擴增體系中，研究骨髓基質層和中藥蛋白質對造血干細胞的擴增數量的影響，并不斷調整體系中的各種成分的比例，篩選出一種新的培養體系，擴增出能夠滿足臨床移植要求的造血干細胞。
圖1為電腦控制系統各模塊示意圖。
圖2是帶有磁性納米粒子的CD34+細胞SEM照片。借助SEM可以看到，分離后的CD34+細胞仍保持正常形態，而且同時我們還可以看到細胞表面連接的磁性納米粒子。
圖3是在顯微鏡下觀察經過體外液體培養的CD34+細胞擴增圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1磁性納米粒子的合成FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液采用共沉淀法形成γ-Fe2O3納米粒子，然后采用反向微乳液法使正硅酸乙酯水解的同時將殼聚糖包裹在γ-Fe2O3外面，以形成核殼型的磁性納米粒子，并通過TEM和穆斯堡爾譜儀表征。
實施例2磁性納米粒子上連接抗CD34單克隆抗體將一定量上述連接氨基的磁性納米粒子分散在磷酸緩沖液(Phosphatebuffered saline，PBS，0.1M，pH7.4)中，加入一定量的戊二醛，反應4-5個小時后，將多余的戊二醛洗去，重新分散在PBS中，然后加入一定量的抗CD34單克隆抗體，反應1.5-2.5小時，再將多余的抗體用PBS充分洗去，同時收集殘液(抗體與磁性納米粒子反應后殘余的液體)、兩次的漂洗液(分別稱為一洗、二洗)。
實施例3分離出的CD34+細胞形態圖2是帶有磁性納米粒子的CD34+細胞SEM照片。借助SEM可以看到分離后的CD34+細胞仍保持正常形態，而且同時我們還可以看到細胞表面連接的磁性納米粒子。從圖中我們還可以看出磁性納米粒子相對于細胞粒徑很小，在復雜的生物體系中磁性納米粒子雖有一定團聚現象存在，但不影響細胞的分離效果和對細胞的形態沒有太大的影響。因此，采用磁性納米粒子分離CD34+細胞，對細胞的形態幾乎沒有影響。
實施例4分選裝置的工作流程將磁珠的粒徑由微米級縮小至納米級，制備出磁性納米粒子用于細胞分離。其分離原理是在磁性納米粒子表面修飾著能識別、結合細胞的生物分子。構成磁性納米粒子-生物分子復合物。用該復合物去捕獲目標細胞，再通過磁性納米細胞自動分選裝置中的可移動磁場將目標細胞吸附、洗脫分離出來。
實施例5CD34+細胞的液體培養2mL RPMI1640體系中含20％胎牛血清(FBS，Gibco)，干細胞因子(SCF)40ng/mL，粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)30ng/mL，白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)各20ng/mL，促紅細胞生成素(EPO)5U/mL，5％牛血清白蛋白(BSA)，細胞2×105/mL，將上述體系接種于培養瓶中。置37℃，5％CO2飽和濕度下培養一周，倒置顯微鏡下觀察。經過液體培養的CD34+細胞，經過五天，在液體培養基中有核細胞總數可擴增20多倍，如圖3。表明經過磁性納米粒子分離的CD34+細胞保持高度增殖能力和自我更新能力。
權利要求
1.一種磁性納米細胞自動分選裝置，至少由磁性分選系統、樣品傳輸系統和電腦控制系統組成，其特征在于，所說的磁性分選系統中至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動磁場，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ-Fe2O3磁性納米粒子。
2.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的可移動磁場強度為4000-6000高斯。
3.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的磁分選溶液中的磁性納米粒子-生物分子復合物粒徑范圍為50～200nm。
4.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的磁性納米粒子-生物分子復合物為磁性納米粒子表面連接CD34單克隆抗體所構成的復合物。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的磁性納米粒子-生物分子復合物為γ-Fe2O3磁性納米粒子表面用殼聚糖包裹繼而連接CD34單克隆抗體所構成的復合物。
6.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的磁性分選系統由永磁鐵、分選單元和磁性納米分離液組成，且所說的磁性納米分離液中含有磁性納米粒子-生物分子復合物。
7.根據權利要求6所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的分選單元至少由一個永久性磁鐵和一個鐵磁化的基材組成。
8.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的樣品傳輸系統是由蠕動泵、閥門及管道組成的細胞懸液輸送和洗滌系統。
9.根據權利要求1所述的磁性納米細胞自動分選裝置，其特征在于，所說的電腦控制系統由主控模塊控制電磁閥、蠕動泵和步進電機。
10.一種利用權利要求1所述裝置進行自動細胞分選的方法。
全文摘要
本發明涉及一種磁性納米細胞自動分選裝置及其應用，該裝置至少由磁性分選系統、樣品傳輸系統和電腦控制系統組成，磁性分選系統至少包括磁分選溶液、分選柱和可移動磁場，所說的磁分選溶液含有殼聚糖包裹的γ－Fe
文檔編號C12N5/08GK101041814SQ20061014831
公開日2007年9月26日 申請日期2006年12月29日 優先權日2006年12月29日
發明者沈鶴柏, 潘建國, 董亞明, 朱龍章, 韓林峰 申請人:上海師范大學