專利名稱：一種對變形鏈球菌電擊轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種電擊轉化方法，具體地說關于一種對變形鏈球菌電擊 轉化方法。
背景技術：
齲病是危害人類口腔健康的主要疾病之一，在齲病的發生發展過程 中，口腔內常駐菌變形鏈球菌具有著極強的產酸耐酸能力而起著重要作 用。作為主要致齲菌，變形鏈球菌目前受到了廣泛的重視與研究。通過
DNA重組技術向其導入外源性DNA片段以研究變形鏈球菌致病相關基 因已成為研究其致病機制的一個重要手段。
常見對變形鏈球菌的基因轉化，是通過電穿孔轉化方案進行，即利 用脈沖電場造成細胞壁的改變從而將外源DNA導入細胞內，但變形鏈球 菌作為革蘭氏陽性球菌，由于有著致密的細胞壁而影響到了常規電擊轉化
的效率與可重復性。對于革蘭氏陽性菌目前有研究報道采用甘氨酸的加入 作為胞壁弱化劑，從而增強轉化效率。大量研究表明甘氨酸(glycine)的加 入對于細胞壁的削弱有顯著的增強作用，因為甘氨酸可以置換胞壁脂雙層 中肽間橋的丙胺酸(L-ZD- alanine)，通過這一置換干擾菌細胞對胞壁的合 成與修復，有利于維持電擊轉化后在胞壁上形成的通道而增強轉化效率。
目前有研究報道培養菌細胞于含甘氨酸的培養基內可增強轉化效率，但對 于不同實驗菌抹，由于甘氨酸有著一定的細胞毒性，因此在甘氨酸的加入 時間與模式上仍有爭議。
在對于變形鏈球菌的電擊轉化研究中，研究者們發現將變形鏈球菌 培養于含甘氨酸培養基內進行電擊轉化會引致大量菌細胞死亡，從而使得
轉化的重復性不佳，推測可能正是由于甘氨酸本身具有的細胞毒性所致。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對變形鏈球菌電擊轉化方法。 本發明的目的是通過以下技術方法來實現的本發明在變形鏈球菌菌 細胞生長達對數生長期后加入最適濃度的胞壁弱化劑甘氨酸，以獲得最適 的胞壁弱化效果，而同時確保有足夠量的活細胞成為感受態細胞，從而獲 得最佳的轉化效率。本發明的具體技術方案如下
一種對變形鏈球菌電擊轉化方法，包括以下步驟 a)提供變形鏈球菌UA159抹、外源性DNA、電轉緩沖液； P)變形鏈J求菌感受態細胞的制備； (3)電擊轉化感受態細胞。
其中，步驟(2)中變形鏈球菌接種至BHI培養基內，于37。C搖床孵育
至吸光度OD660nm-0.5,加入甘氨酸溶液。甘氨酸溶液濃度為8%_12%。甘
氨酸溶液優選濃度為10°/。。步驟(l)中外源性DNA是pGL3 basic質粒。 步驟(1)中電轉緩沖液EPB配制如下5mM磷酸鉀，0.4M山梨醇，10% 甘油，調節pH至4.5， 4"C下保存，使用時冰浴中預冷。步驟(3)中電轉條件1.6KV, 25^F。
本發明所公開一種對變形鏈球菌電擊轉化方法，其優點表現在通過 在達到菌細胞對數生長期后加入胞壁弱化劑甘氨酸，以克服甘氨酸對細胞 的毒性作用，并篩選出了甘氨酸的最適加入濃度，顯著增強了對變形鏈球 菌的電擊轉化效率與可重復性。是對變形鏈球菌進行基因轉化的研究的有 效手段，可用于對變形鏈球菌致齲機制的研究。
圖1顯示不同終濃度甘氨酸對于變形鏈球菌電擊轉化效率的影響， *表示實驗組與對照組相比有統計學意義(P<0. 05)
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述。 實施例1
1.實驗菌纟朱，質粒與試劑配制
實驗采用變形鏈球菌UA159抹(從武漢大學口腔醫學院購買)，以具 有氨芐青霉素抗性的pGL3 basic質粒(pGL3 basic質粒購自美國Thermo Fisher Scientific, Inc.公司)作為轉化的外源性DNA。
電轉緩沖液(EPB)酉己制如下5mM磷酸鉀(potassium phosphate), 0.4M 山梨醇(sorbitol), 10%甘油(glycerol),調節pH至4.5, 4。C下保存，使用
時冰浴中預冷。
2. 變形鏈球菌感受態細胞的制備
挑取單菌落接種至BHI培養基內，于37。C搖床孵育至吸光度OD660nm =0.5，加入終濃度為10%的甘氨酸溶液，繼續于37。C孵育lhr。培養液 置水浴預冷15min后，于4。C下3000rpm離心15min，收集沉淀之菌細胞。 以預冷之電轉緩沖液EPB( 5mM磷酸鉀，0.4M山梨醇，10%甘油，pH 4.5 ) 洗滌沉淀兩次，于4。C下3000rpm離心15min，收集菌細胞。以EPB緩沖 液IOO倍濃縮菌細胞配制成電轉感受態細胞懸液，液氮速凍后凍存于 -70。C待用。
3. 電擊轉化感受態細胞
電擊轉化前取出5(HU感受態細胞于冰浴中解凍，加入1嗎質粒DNA, 充分混勻后加入至預冷的無菌電轉杯中。采用1.6KV, 200Q， 25pF的電 轉條件。電擊完畢后，加入lml含0.4M山梨醇(sorbitol)的BHI培養基， 于37。C低速搖床復蘇2hr后，4。C下3000rpm離心5min，取150(il懸液均 勻涂布于含1(Vg/ml的Bffl瓊脂培養基上，37"C孵育10hr后篩選陽性克 隆。
實施例2
不同終濃度甘氨酸對于變形鏈球菌電擊轉化效率影響的實驗 實驗采用變形鏈球菌UA159抹(從武漢大學口腔醫學院購買)，以具 有氨芐青霉素抗性的pGL3 basic質粒(pGL3 basic質粒購自美國Thermo Fisher Scientific, Inc.公司)作為轉化的外源性DNA。
電轉緩沖液(EPB)配制如下5mM磷酸鐘(potassium phosphate), 0.4M 山梨醇(sorbitol), 10。/。甘油(glycero1)，調節pH至4.5， 4。C下保存，使用 時冰浴中預冷。
變形鏈球菌感受態細胞的制備挑取單菌落接種至BHI培養基內，
于37。C搖床孵育至吸光度OD66Qnm-0.5，加入不同濃度的甘氨酸溶液(0，
2%, 5%， 10%, 20% ),繼續于37。C孵育lhr。培養液置水浴預冷15min后， 于4。C下3000rpm離心15min,收集沉淀之菌細胞。以預冷之電轉緩沖液 EPB (5mM磷酸鉀，0.4M山梨醇，10%甘油，pH 4.5 )洗滌沉淀兩次， 于4。C下3000rpm離心15min,收集菌細胞。以EPB緩沖液100倍濃縮菌 細胞配制成電轉感受態細胞懸液，液氮速凍后凍存于-7(TC待用。
電擊轉化感受態細胞電擊轉化前取出50pl感受態細胞于水浴中解 凍，加入l嗎質粒DNA，充分混勻后加入至預冷的無菌電轉杯中。采用 1.6KV， 200。， 25pF的電轉條件。電擊完畢后，迅速加入冰冷的lml含 0.4M山梨醇(sorbitol)的BHI培養基，于37。C低速搖床復蘇2hr后，4。C下 3000rpm離心5min,取150^1懸液均勻涂布于含10pg/ml氨芐青霉素的 BHI瓊脂培養基上，37。C孵育10hr后篩選陽性克隆。
對不同終濃度甘氨酸孵育后的感受態細胞進行電擊轉化后，比較各組 轉化克隆的菌落數，研究數據采用SPSS 10.0統計軟件分析，選用單因素 方差分析的DunneU雙側檢驗，在a=0.05的情況下比較各實驗組與對照 組之間差異有無統計學意義。結果見圖1，可見與對照組相比僅10%甘氨 酸(P〈0.05)與20。/。甘氨酸(PO.05)孵育組轉化率明顯升高，但這兩個濃度
組間并無顯著差異(PX).05)。而考慮到甘氨酸本身的細胞毒性，因此推薦 使用10%濃度的甘氨酸作為胞壁弱化劑的最適濃度。
權利要求
1. 一種對變形鏈球菌電擊轉化方法，包括以下步驟(1)提供變形鏈球菌UA159株、外源性DNA、電轉緩沖液；(2)變形鏈球菌感受態細胞的制備；(3)電擊轉化感受態細胞。
2、 根據權利要求1所述的電擊轉化方法，其特征在于步驟(2)中變 形鏈球菌接種至BHI培養基內，于37。C搖床孵育至吸光度OD660nm = 0.5，力口 入甘氨酸;容液。
3、 根據權利要求2所述的電擊轉化方法，其特征在于甘氨酸溶液濃 度為8%-12%。
4、 根據權利要求3所述的電擊轉化方法，其特征在于甘氨酸溶液濃 度為10%。
5、 根據權利要求1所述的電擊轉化方法，其特征在于步驟(l)中外 源性DNA是pGL3 basic質粒。
6、 根據權利要求1所述的電擊轉化方法，其特征在于步驟(l)中電 轉緩沖液EPB配制如下5mM磷酸鉀，0.4M山梨醇，10%甘油，調節pH 至4.5, 4X:下保存，使用時水浴中預冷。
7、 根據權利要求1所述的電擊轉化方法，其特征在于步驟(3)中電 轉條件1.6KV， 200Q， 25pF。
全文摘要
本發明涉及一種電擊轉化方法，具體地說關于一種對變形鏈球菌電擊轉化方法。該電擊轉化方法，包括以下步驟(1)提供變形鏈球菌UA159株、外源性DNA、電轉緩沖液；(2)變形鏈球菌感受態細胞的制備；(3)電擊轉化感受態細胞。其中，步驟(2)中變形鏈球菌接種至BHI培養基內，于37℃搖床孵育至吸光度OD<sub>660nm</sub>＝0.5，加入10％甘氨酸溶液。本發明所公開一種對變形鏈球菌電擊轉化方法，其優點表現在顯著增強了對變形鏈球菌的電擊轉化效率與可重復性。是對變形鏈球菌進行基因轉化的研究的有效手段，可用于對變形鏈球菌致齲機制的研究。
文檔編號C12N15/87GK101205546SQ20061014774
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月22日 優先權日2006年12月22日
發明者正 劉, 黃正蔚 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院