專利名稱：生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物及其鑒定方法
技術領域：
本發明涉及生藥學領域，具體涉及一種生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物及其鑒定方法與用途。
背景技術：
百合科蔥屬植物約有500余種，廣泛分布于北半球，我國境內約有110種(包括變種和引進的外來種)，主要分布于東北、華北、西北及西南地區，用做蔬菜及調味品。其中作藥用的約20種，如小根蒜、蒜、韭、蔥、洋蔥等。蔥子Semen Allii Fistulosi為百合科蔥屬植物蔥Alliumfistulasum L.的干燥成熟種子。蔥子，味辛，性溫。用于溫腎，明目，解毒；治療腎虛陽毒，遺精，目眩，視物昏暗，瘡癰等病癥。韭子SemenAllii Tuberosi為百合科蔥屬植物韭Allium tuberosum Rottl.ex Spreng的干燥成熟種子。韭子味辛、甘，性溫。歸肝、腎經。用于補益肝腎，壯陽固精；治療腎虛陽痿，腰膝酸軟，遺精，尿頻，尿濁，帶下清稀等癥。兩者藥理作用不同，功能有一定差別。然而兩者在外觀形態上非常相似，很難分辨，連多年從事生藥學分類的老同志都會弄錯(如圖1所示)。因而，確立行之有效的方法來鑒別生藥的真偽和品質，是解決品種混亂、凈化種子市場、保證中藥材產業可持續發展的有效途徑和根本措施。
發明內容
本發明的目的是提供一種生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物。本發明的另一目的是提供一種使用上述引物對生藥韭子進行鑒定的方法，以及在區分生藥蔥子和韭子上的用途。
近年來發展起來的利用擴增片段長度多態性AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphism)技術，確定蔥子和韭子的特異性差異條帶。在此基礎上，將AFLP標記轉換成簡單實用的SCAR(特征性片段擴增區域，sequence characterized amplified region)標記。
將SCAR標記片段進行膠回收，PCR或克隆測序，然后根據序列特點設計特異性引物，通過簡單的PCR，即可鑒別蔥子和韭子。該方法可以大大提高檢測和篩選的效率，為藥材的真偽鑒別提供了保障，具有很高的實用價值。
本發明利用AFLP技術對采自全國不同產地的蔥子與韭子進行了DNA多態性的分析。如圖2所示，產生多條蔥子和韭子的AFLP特異性差異條帶，根據這些特異片段序列分別設計相應的SCAR引物，通過對蔥子和韭子的PCR擴增檢驗，有一個AFLP標記成功轉化為SCAR標記，此可作為分子標記通過常規PCR技術用于兩個種的快速區分。本發明利用該SCAR分子標記，產生了一對特異性引物P1和P2。
本發明提供了一種生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物，該鑒定引物的DNA序列為引物15′-AATTCACCAGGGTCATATTGAGTG-3′引物25′-TAACAAAACACTAGTTGGTTAAGG-3′本發明還提供了一種使用上述的鑒定引物對生藥韭子進行鑒定的方法，鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取；B用上述鑒定引物對DNA模板對進行PCR擴增，其中的退火溫度為65℃-71℃，退火時間為30秒-55秒；C電泳檢測。
本發明使用的鑒定材料的DNA模板提取技術為公知技術，參見(植物基因工程第二版，科學出版社出版，王關林，方宏筠主編)。
本發明使用的聚合酶鏈式擴增體系為常規PCR體系，不需要特殊的PCR儀和特殊的反應試劑，任何公司生產的PCR儀和任何生物試劑公司生產的試劑均可以使用而達到目的。
本發明PCR反應條件中對擴增效果影響最大的是退火溫度，所以為了減少非特異性擴增，采用了相對比較高的退火溫度(退火溫度65℃-71℃，退火時間30-55秒)，這種條件下PCR的反應效率相對較低。因此如果出現沒有擴增條帶的情況，可以降低退火溫度，使反應效率增高。但同時要注意隨著退火溫度的降低，非特異性擴增也會增強，可能會出現假陽性的情況。在使用本發明推薦的PCR反應退火溫度時，可以先使用具有已知的樣品，這樣可以在增加PCR反應效率的同時防止出現因為退火溫度過低而導致的假陽性現象。
本發明使用的電泳檢測，可用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
本發明還提供了上述的鑒定引物在區分生藥蔥子和韭子上的用途。
韭子樣品在使用上述引物1和引物2時能擴增出條帶，而蔥子樣品在使用上述引物1和2時不能擴增出條帶(如圖3所示)。
本發明利用特異性引物鑒別蔥子和韭子，設計了兩條引物，結構簡明使用方便。基于聚合酶鏈式擴增反應，利用兩種物種基因組DNA序列差異和PCR反應的快速高效，在短時間內能精確檢測蔥子和韭子基因組中是否含有來自于韭子的特異性SCAR分子標記片段。
本發明使用方便，效果快捷明顯，有良好的推廣應用前景。
圖1是蔥子和韭子形態鑒別檢測2是實施不同產地蔥子與韭子的AFLP分析檢測3是實施引物對P1+P2的SCAR檢測圖
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述實施例1一、不同產地蔥子與韭子的AFLP分析1.植物材料收集全國不同產地的9份蔥子和13份韭子材料。
蔥子
韭子
2 模板DNA制備CTAB法提取基因組DNA操作程序如下稱取材料各0.1g，液氮研磨三至四次將粉末放到裝有800μL提取緩沖液的2mL離心管中加入60μL巰基乙醇混勻，60℃預熱30min其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置待樣品冷卻到定溫加入800μL氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液振蕩混勻，12000rpm離心15min取上清到一新2mL EP管中加入1.5倍體積1×CTAB放置20～30min，12000rpm離心15min將沉淀晾干溶于200μL TE-buffer(溶解)加入400μL 95％乙醇，20μLNaAC，-20℃沉淀1h12000rpm離心15min500μL 75％乙醇洗，12000rpm離心10min加入30-50μL TE-buffer基因組DNA質量檢測取5μL DNA溶液上樣，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳條帶；紫外分光光度計(Pharmacia，LKB Ultrospec III)分別測定OD260，OD280，OD230值。
3 雙酶切及連接限制性酶切及連接一步進行，反應體系如下在0.5mL離心管中加入(20μL反應體系)模板DNA 4(50ng/μL)Adapter 1μLEcoR I/Mse I2μL(25pmol/μL)
10×Reaction buffer2.5μL10mM ATP 2.5μLT4 Ligase 1μL(1U/μL)AFLP-Water 7μL混勻離心數秒，37℃保溫5hr，8℃保溫4hr，4℃過夜。
4 預擴增用預先選好的引物(EcoR I和Mse I)在稀釋后的限制性連接反應產物中進行預擴增，引物序列如下EcoR I預擴增引物序列5’＞GAC TGC GTA CCAATT C＜3’Mse I預擴增引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTAA＜3’預擴增反應體系如下在0.2mL離心管中按下列方式加入(25μL反應體系)模板DNA2μLPre-ampmix1μLdNTPs 1μL10×PCR buffer2.5μLTaq DNA polymease 0.5μLH2O 18μL離心數秒，按下列參數進行PCR擴增循環30輪。
預擴增反應條件如下變性94℃2min變性94℃30S復性56℃30S延伸72℃80S延伸72℃5min5 選擇性擴增將預擴增產物1∶20稀釋，作為選擇性擴增模板，按以下參數進行選擇性擴增。選擇性擴增體系如下在0.2mL離心管中，按下列方式加入(25μL反應體系)預擴增稀釋樣品 2μL10×PCR buffer2.5μLdNTPS 0.5μL
EcoR I引物1μL(共4種)Mse I引物 1μL(共8種)Taq酶 0.5μLH2O 17.5μL以上混勻，離心數秒，按下列參數PCR循環。
1.一輪擴增參數94℃ 30S，65℃ 30S，72℃ 80S2.以后每輪循環溫度遞減0.7℃，擴增12輪。
3.接著按下列參數擴增23輪94℃ 30S，55℃ 30S，72℃80S選擇性擴增引物對在3′端出現三個附加的核苷酸序列。在所有反應中，僅Mse I引物的5′端被熒光染色劑6-FAM(fluorescent 6-carboxyfluorescein)標記為藍色。
6電泳、成像用6.0％的聚丙烯酰胺膠100mL加入10％過硫酸銨500μL和TEMED100μL制膠。用ABI PRISM 377測序儀在3V，50mA，200W，51℃條件下進行PCR產物電泳。每個DNA模板至少進行兩次重復。
7特異片斷的回收測序與AFLP SCAR的轉化特異性擴增產物取8μL上聚丙烯酰胺凝膠大板電泳銀染后，小心刮下特異性目標條帶于1.5mL EP管中，加入10μL MilliQ H2O于60℃水浴10min后放置-20℃保存。取其中2μL為模板，以選擇性擴增PCR條件(改為50μL體系)進行目標片斷富集擴增，瓊脂糖凝膠電泳后回收目標片斷，連接到PMD-18T載體后轉化大腸桿菌DH5α涂平板挑陽性克隆測序，根據測序結果設計AFLP SCAR(Sequence CharacteredAmplified Region，序列特征化擴增區域，簡稱SCAR標記)引物，取單份材料DNA為模板按常規PCR條件進行驗證。
二AFLP SCAR標記的獲得目前通過將聚丙烯酰胺凝膠上的特征性片斷回收測序，成功獲得了一條韭子特有條帶的序列，即利用選擇性擴增引物P1+P2得到了一段大小為160 bp大小的韭子中獨有的片斷，即序列表SEQ ID NO.3所示的堿基序列，此為SCAR標記(加下劃線部分表示AFLP引物核心序列，加方框部分表示內切酶點特異序列，加陰影部分表示選擇性核苷酸序列) 根據該序列設計了一對引物引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
從蔥子與韭子供試材料中各取5份，以其DNA為模板進行常規PCR驗證結果表明，該序列僅在不同產地韭子中出現，因此通過該SCAR標記PCR擴增條帶的有無可以快速將兩種生藥區分。
實施例2利用特異性引物P1和P2鑒定蔥子和韭子基因組是否含有來自于韭子的SCAR分子標記。
引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取(同實施例1中方法)；B用上述鑒定引物對DNA模板對進行PCR擴增；使用反應體系如下PCR反應條件、程序如下(20ul體系)1×PCR緩沖液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1 U Ex-Taq DNA polymerase250ng特異性擴增引物(P1+P2)DNA模版(適量)加水至20ulPCR程序為
1)94℃預變性4分鐘2)94℃變性1分鐘3)退火溫度65℃-71℃，退火時間30-55秒4)72℃延伸1分鐘5)72℃延伸7分鐘循環步驟為2)，3)，4)，40個循環C電泳檢測1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
樣品組成蔥子
韭子
由上述實驗結果可見，韭子具有特異性SCAR分子標記用引物P1+P2可以擴增出條帶，而蔥子不具有此標記用引物P1+P2擴增不出條帶。SCAR分子標記的結果和原植物形態的結果相吻合，表明用該方法可以準確鑒定蔥子和韭子的區別。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物及其鑒定方法<130>說明書，權利要求書<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aattcaccag ggtcatattg agtg24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2taacaaaaca ctagttggtt aagg24<210>3<211>160<212>DNA<213>人工序列<400>3gactgcgtac caattcacca gggtcatatt gagtgtaccc cggggttgaa gccacattta 60ccatgtgctg accccagtgt tccccaatga tttacctagt gtctatttga gtttttcccg120gaaccttaac caactagtgt tttgttactc aggactcatc 160
權利要求
1.一種生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物，其特征在于鑒定引物的DNA序列為引物1具有SEQ ID NO.1所示的堿基序列引物2具有SEQ ID NO.2所示的堿基序列。
2.一種使用權利要求1所述的鑒定引物擴增得到的韭子特異性SCAR分子標記，其特征在于該SCAR分子標記具有SEQ ID NO.3所示的堿基序列。
3.一種使用權利要求1所述的鑒定引物對生藥韭子進行鑒定的方法，其特征在于鑒定步驟為A鑒定材料的DNA模板提取；B用上述鑒定引物對DNA模板對進行PCR擴增，其中的退火溫度為65℃-71℃，退火時間為30秒-55秒；C電泳檢測。
4.權利要求1所述的鑒定引物在區分生藥蔥子和韭子上的用途。
全文摘要
本發明涉及生藥學領域。百合科蔥屬植物中韭和蔥的干燥成熟種子藥理作用不同，功能有一定差別。然而兩者在外觀形態上非常相似，很難分辨，連多年從事生藥學分類的老同志都會弄錯。本發明的目的是提供一種生藥韭子聚合酶鏈反應鑒定引物，該鑒定引物具有SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的堿基序列。本發明還提供使用上述引物對生藥韭子進行鑒定的方法，韭子樣品在使用上述引物時能擴增出條帶，而蔥子樣品不能擴增出條帶，本發明在短時間內能精確區分出蔥子和韭子，有效地鑒別了生藥的真偽和品質。
文檔編號C12N15/11GK1986833SQ20061014753
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月20日 優先權日2006年12月20日
發明者黃蓓蓓, 陳萬生, 孫蓮娜, 來威, 郭晶 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學