專利名稱：一種混合菌固定化顆粒的制備方法
技術領域：
本發明涉及混合菌固定化顆粒的制備方法，具體地說是釆用沸石為載 體對混合菌進行固定化及固定化顆粒對底泥中硝基苯類污染物進行去除。
背景技術：
微生物固定化技術的發展始于上世紀70年代，在醫藥、食品、化工以 及點源污水治理方面取得了很多成果，但在污染地表水體修復特別是底泥 修復方面的研究還未見報道。
微生物固定化技術是指利用化學或物理的方法，將游離細胞(微生物) 定位于限定的空間區域內，并保持活性，且能反復使用的基本技術。固定 化技術可對完整細胞進行固定，可最大限度地維持生物酶活性和穩定性， 提高單位體積內微生物密度和流動速率，修復過程不受稀釋率高于微生物
生長率的限制，固定化微環境有利于屏蔽外界環境的不利影響，固定化顆 粒的水力性質和沉降性能可靈活控制，是一項高效實用的污染環境修復技 術。
硝基苯、苯胺類污染物，它們在水體和底泥中具有較高的穩定性。其 密度分別為1.205、 1.022,其密度>水，進入水體的硝基苯、苯胺會沉入 水底，使底泥遭受污染。它們在水中又都有一定的溶解度，隨時間延長又 會造成水體污染。
2005年11月13日吉林雙苯廠苯胺車間發生爆炸，引發大量硝基苯泄 漏。雙苯廠的含硝基苯廢水流入松花江，導致江水和底泥污染。
松花江污染區域大、土著微生物很難自發形成優勢降解菌群，污染底 泥的特殊性質無疑對生物修復提出更高的要求，必須篩選組合優勢降解菌 群，而且微生物固定化顆粒其密度>水，才能使優勢降解微生物菌群接觸 到污染底泥，達到去除有機污染物的目的。
為了實現上述微生物固定化修復技術對硝基苯類污染底泥的有效修 復，本技術發明了一種沸石為載體的微生物混合菌固定化沸石顆粒制備方 法。
發明內容
本發明的目的是提供一種沉積效果好、應用方便的混合菌固定化顆粒 的制備方法。
為了實現上述目的，本發明的技術方案是用沸石為載體將對數生長 期的混合菌進行吸附固定，即為將15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加 入到含有硝基苯類溶液中的培養基，在兼性厭氧條件下，恒溫培養4-6天， 取出40-50ml菌懸液，而后補充相同體積的含有硝基苯的培養基，在兼性
厭氧條件下、恒溫培養2-3天即為增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有
混合菌的沸石顆粒。
所述含有硝基苯類污染物的培養基中硝基苯類污染物的濃度為25-35 mg/L。
所述沸石為粒度在0.05-0.15 cm3，用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風干 的沸石。所述培養基為葡萄糖0.05-0.2%、蛋白胨0.02-0.06%、酵母嗇 0.03-0.06 %、 NaCl 0.3-0.6%、 K2HPO40.4-0.5% 、 KH2P04 0.1-0.4 %、 MgS04.7H20 0.02-0.06 0/o 、 pH7.2 ~ 7.5
原理用于修復污染底泥以無機載體沸石作為載體材料，釆用吸附固 定方法。對選擇的高效降解硝基苯的混合微生物進行固定化，制備混合菌 顆粒；將制備的固定化生物產品對硝基苯和苯胺污染的底泥進行修復。
本發明可修復污染底泥中的硝基苯、苯胺類污染物及密度〉水的有機
5虧_^物
本i:明具有如下優點
1. 本發明選擇沸石為載體，沸石平均比重為2.12g/cr^，體積在0.05-0.15
cm3范圍較合適，其孔隙度適合微生物的吸附固定，可對完整的微生物細胞 進行固定，避免人為破壞生物酶的活性和生化反應的穩定性；增殖速度快、 效果好。
2. 本發明選擇的微生物為兼性厭氧混合菌，固定化后的微生物能長期 保持活性；固定化細胞顆粒的微環境有利于屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物 質對微生物體的惡性竟爭、吞噬和毒害，使其在復雜環境條件下穩定地發 揮高效能。
3. 沸石為載體的固定化細胞顆粒對于靜止或緩流污染水體中的底泥， 可根據污染程度直接投加，操作簡單，無需改變自然環境和修筑大規模構 筑物，不產生二次污染。
4. 沸石來源豐富，價格便宜。節省投資，簡化流程，實踐上安全可靠， 經濟上費用低廉，工程投資僅為物理法、化學法修復的30-50%。
5. 本發明采用生物修復主要指微生物修復，具體為無機載體沸石吸附 固定微生物，對混合菌吸附速度快、增殖效果好。將其制備的固定化 細胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環境中，可使底泥中硝基苯和 苯胺得到有效去除，當底泥中硝基苯、苯胺初始濃度為4.41 mg/kg、 37.84mg/kg時，硝基苯的降解率可達100%，苯胺降解率為52. 51%。
圖1為本發明固定化微生物沸石顆粒降解底泥中硝基苯的處理圖。 圖2為本發明固定化微生物沸石顆粒降解底泥中苯胺的處理圖。
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。 實施例i
沸石固定微生物的方法，具體步驟為先制備種子液，同時處理無機
載體沸石；然后混合菌株在沸石中進行吸附固定增殖。具體步驟如下
U)種子液的制備
在兼性厭氧條件下，所述兼性厭氧條件，將160ml富集培養基加入到 250ml厭氧瓶中，滅菌，冷卻后加入18 ml種液，放入28'C的培養箱中恒 溫靜止培養一周，使其微生物處于對數生長期，備用。
所述厭氧瓶為醫用輸液瓶；培養基按重量百分比計為葡萄糖0.1%、 蛋白胨0.05 % 、酵母膏0.05 % 、 NaCl 0.5%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04'7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分屏。所述 種液為含有1. 5ml濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，兼 性厭氧混合微生物包括施氏假單胞菌(尸化wA/wo"os WMteerO、糞產堿菌 (」/ea/Zge""々eca/zS )、巨大芽孢桿菌(5ac/〃船)和陰溝腸桿菌 (五"fera^"erc/oacae),(上述菌種均可通過巿購得到)，其體積份數比為1: 1: 1: 1 ,加入的硝基苯溶液使其濃度達到26. 25mg/L。
(2) 載體的預處理
沸石(購自遼寧省法庫沸石礦)，將大塊沸石破碎，使粒度范圍為 0.05-0.15 cm3。用自來水洗滌3次，并用自來水浸泡過夜，次日除水后風干， 然后稱沸石30g加入到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放 入滅菌鍋中滅菌，備用。滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在沸石無機載體中的固定
將上述裝有30g沸石的100ml廣口瓶中分別加入45ml富集培養基、 0. 45ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3 mg/ml )和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28'C恒溫培養箱內靜止培養。所述富集培養基與種子液制備所 用的培養基相同，所述種子液為上述已制備好的兼性厭氧混合菌液。
(4) 固定化細胞的增殖
從上述裝有沸石載體的廣口瓶中倒出40ml殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮培養基及0. 35ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為 "."mg/L。在兼性厭氧條件下、28'C恒溫培養箱內培養約3天即為增殖一 次，共增殖三次，分別增殖69h 、 51 h和48h;所述培養基與種子液制備 所用的培養基相同。完成每次增殖時瓶中增殖液呈現渾濁，有氣體逸出， 苦杏仁味消失并產生臭味，此時需更換新鮮的培養基即為一次增殖。用上 述方法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混 合菌提供了更多的吸附固定點，提高了固定化效率，使單位質量細胞數量 增多、密度增大，經過三批增殖后固定化沸石顆粒吸附固定的微生物細胞 數可達到l.lxl08cfu/g。
(5) 對底泥的修復效果
實驗采用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數比為l: 4,所述泥為吉林石
化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標為泥水混合物，
即600g泥，2400g水，共3. OL.投加NaH2P041.5g K2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5%固定化沸石顆粒投入到 上述污染水體和底泥環境中。處理前首先測定底泥中硝基苯的初始濃度為 4.41 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C)靜止放置。固 定化沸石顆粒對底泥中硝基苯的處理效果參見圖1。從圖1看出經過5天處 理，底泥中硝基苯污染物的濃度從4.41 mg/kg (干泥)降低到0.95mg/kg， 降解率為78.46%。 7天后測定底泥中硝基苯的含量，為未檢出，全部被降 解，說明固定化沸石顆粒對底泥中硝基苯污染物修復效果是另人滿意的。 實施例2
與實施例l不同之處在于
(1) 種子液的制備
在兼性厭氧條件下，將180ml富集培養基加入到250ml厭氧瓶中，滅 菌，冷卻后加入16 ml種液，放入28'C的培養箱中恒溫靜止培養一周，使 其微生物處于對數生長期，備用。
所述培養基按重量百分比計為葡萄糖0.2%、蛋白胨0.06%、酵母 膏0.06%、 NaC10.6%、 K2HPO40.5%、 KH2P04 0.3 % 、 MgS04.7H20 0.05 % 、 pH7.2。滅菌，滅菌條件為0.1Mpa濕熱滅菌30分鐘。所述種液為含有2ml 濃度為3mg/ml的硝基苯溶液的兼性厭氧混合微生物，硝基苯的濃度為 30mg/L。
(2) 載體的預處理
沸石(購自遼寧省法庫沸石礦)，將大塊沸石破碎，使粒度范圍為 0.05-0.15 cm3。用自來水洗滌3次，并用自來水浸泡過夜，次日撈出風干， 然后稱沸石40g加入到100ml具塞的廣口瓶中，瓶口用8層紗布包好，放 入滅菌鍋中滅菌，備用。滅菌條件為0. 1Mpa濕熱滅菌30分鐘。
(3) 混合菌株在沸石無機載體中的固定
將上述裝有40g沸石的100ml廣口瓶中分別加入40ml富集培養基、 0. 40ml硝基苯溶液(硝基苯的濃度為3mg/ml)和20ml種子液，在兼性厭 氧條件下、28X:恒溫培養箱內靜止培養。
(4) 固定化細胞的增殖
從上述裝有沸石載體的廣口瓶中倒出50ml殘余菌體懸浮液，然后加入 同樣體積的新鮮增殖培養基及0.5ml硝基苯溶液，使硝基苯的濃度為 30mg/L。在兼性厭氧條件下、28X:恒溫培養箱內培養約2天即為增殖一次， 共增殖三次，分別增殖60h 、 50 h和48h;所述培養基與種子液制備所用 的培養基相同。完成每次增殖時瓶中增殖液呈現渾濁，有氣體逸出，苦杏 仁味消失并產生臭味，此時需更換新鮮的培養基即為一次增殖。用上述方 法制得的固定化沸石-混合菌，空隙合適、表面積大、吸附性好，為混合菌 提供了更多的吸附固定點，提高了固定化效率，使單位質量細胞數量多、 密度大，經過三批增殖后固定化沸石顆粒吸附固定的微生物細胞數可達到
1.4xl010cfb/g。
(5)固定化沸石顆粒使用方法及對底泥的修復效果 實驗釆用3L的廣口玻璃瓶，泥水重量份數比為1: 2，所述泥為吉林石 化二苯廠污水排放明渠中的底泥，水為自來水。其處理目標為泥水混合物， 1000 g泥，2000g水，共3. OL.投加NaH2PO41.5gK2HPO43.0g、MgSO4.7H2O 0.6g、 CaCl20.3g、 pH6. 5。然后將重量百分比為5%固定化沸石顆粒投入到 上述污染水體和底泥環境中。處理前首先測定底泥中苯胺的初始濃度分別 為37.84 mg/kg干泥。而后在兼性厭氧條件，室溫(13°C-23°C)靜止放置。 固定化混合菌沸石顆粒對底泥中苯胺的處理效果參見圖2。苯胺較難處理， 從圖2可以看出處理5天后，降解率僅為41.70%。經過2個月的處理，底 泥中苯胺污染物的濃度從37.84 mg/kg降低到17.97mg/kg，降解率為52. 51%。 結果說明混合菌固定化沸石顆粒能夠抗底泥中的不同毒物，在不良環境中 可發揮多種菌的協同作用，使底泥中污染物含量不斷降低，能夠逐漸達到 徹底去除的目標，固定化混合菌沸石顆粒修復底泥中苯胺污染物也是可行 的。
權利要求
1.一種混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于用沸石為載體將對數生長期的混合菌固定，即為將15-25ml的菌液和30-40g的沸石混合加入到含有硝基苯類溶液中的培養基，在兼性厭氧條件下，恒溫培養4-6天，取出40-50ml菌懸液，而后補充相同體積的含有硝基苯的培養基，在兼性厭氧條件下、恒溫培養2-3天即為增殖一次，共增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石顆粒。
2. 按權利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 所述含有硝基苯類污染物的培養基中硝基苯類污染物的濃度為25-35 mg/L。
3. 按權利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 對數生長期的混合菌為施氏假單胞菌、糞產堿菌、巨大芽孢桿菌和陰溝腸 桿菌，其按體積份數比計1: 1: 1: 1，在含有硝基苯類污染物的培養基中 恒溫培養4-6天得到的混合菌。
4. 按權利要求1所述的混合菌固定化顆粒的制備方法，其特征在于 沸石為用水洗滌3-5次，浸泡過夜后風干的。
全文摘要
本發明涉及混合菌固定化顆粒的制備方法，具體地說是采用沸石為載體對混合菌進行固定。具體為將制備好的種子液接種到處理過的沸石載體上，并在兼性厭氧條件下、恒溫培養4-6天條件下進行吸附、培養和增殖2-3次，得到固定有混合菌的沸石顆粒。本發明具體采用無機載體沸石吸附固定混合菌，對多種菌吸附速度快、增殖效果好，操作簡單，無需改變自然環境和修筑大規模構筑物，不產生二次污染。將其制備的固定化細胞顆粒投放到硝基苯類污染水體-底泥環境中，可使底泥中硝基苯和苯胺得到有效去除，當底泥中硝基苯、苯胺初始濃度為4.41mg/kg、37.84mg/kg時，硝基苯的降解率可達100％，苯胺降解率為52.51％。本發明的沸石來源豐富，價格便宜。
文檔編號C12N11/00GK101177680SQ200610134238
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月10日 優先權日2006年11月10日
發明者張春桂, 張海榮, 李培軍, 許華夏, 鞠京麗 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所