專利名稱：超聲波協同改性纖維素酶催化木質纖維素糖化的方法
技術領域：
本發明涉及一種超聲波協同改性纖維素酶催化木質纖維素糖化的方法。屬于木質纖維素糖化的技術。
背景技術：
燃料乙醇的生產工藝可分為兩個過程，分別是原料的糖化和糖的發酵過程，即將原料轉化為可發酵糖類的過程和利用糖類進行微生物發酵生產乙醇的過程。在整個生產過程中，生物催化技術被廣泛采用。傳統燃料乙醇的生產以糧食為原料，主要使用淀粉酶為催化劑將淀粉轉化成可發酵的糖類，其產量受到糧食資源的限制，難以長期滿足能源需求。含木質纖維素的生物質廢棄物是生產燃料乙醇的另一原料來源，它包括農作物秸稈、林業加工廢料、甘蔗渣及城市垃圾中所含的廢棄生物質等。第三代燃料乙醇以各種木質纖維素作為生產原料，由于木質纖維素具有木質素、纖維素、半纖維素相互包裹的復雜結構并且纖維素本身存在穩定的結晶結構，使木質纖維素難于分解為可用于發酵乙醇的糖類。木質纖維素的糖化是轉化燃料乙醇的主要問題之一。
目前木質纖維素的糖化主要包括酸水解和生物酶催化兩種方式，酸水解工藝由于成本高、污染嚴重，已經逐漸放棄使用，現在正被廣泛研究的是利用纖維素酶生物催化分解木質纖維素的糖化工藝。此工藝具有低能耗、無污染的優勢，但由于木質纖維素結構復雜，難于分解；纖維素酶作用效率低，并且其作用效率主要依賴于原料的預處理工藝；高效、低成本、的污染的預處理工藝有待開發，所以提高酶催化的效率以及降低酶的用量從而降低成本都是目前木質纖維素糖化工藝所存在的主要問題。使用復合酶催化是提高酶催化效率的有效手段，但由于不同酶制劑的使用條件有差異，使得復合酶催化工藝十分復雜或是難以完全發揮酶的催化作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用超聲波協同改性纖維素酶催化木質纖維素糖化的方法。該法具有催化效率高、原料綜合利用、環境污染低的特點。
為達到上述目的，本發明是通過下述技術方案加以實現的。一種超聲波協同改性纖維素酶催化纖維素糖化反應的方法，其特征在于包括以下過程1、原料的預處理將玉米秸稈粉碎成20～40目顆粒，取粉碎好的原料，按克/毫升固液比為1∶10～20，用質量濃度3％～10％NaOH于25℃反應3h～8h，抽濾得濾渣和濾液，濾渣水洗至pH值為7～8，備用。用質量濃度98％濃硫酸將濾液調至pH值為3～6，加熱到30～80℃，沉淀30～60min離心分離得到木質素。
2、纖維素酶改性配制質量濃度為6％～15％的三聚氯氰苯溶液，2～20℃重結晶兩次，得到純化的三聚氯氰。按單甲氧基聚乙二醇4000與4A分子篩和無水碳酸鈉的質量比為1∶(2～6)∶(4～10)將單甲氧基聚乙二醇4000、4A分子篩和無水碳酸鈉加入溶劑苯中，常溫攪拌30～60分鐘后，過濾，去除4A分子篩和碳酸鈉得到濾液，然后按照聚甲氧基乙二醇4000與純化的三聚氯氰的摩爾比為2～2.5∶1將純化的三聚氯氰加入到濾液中，常溫條件下反應20～50小時。溶液再經濃縮，過濾，低溫干燥，得到活化的單甲氧基聚乙二醇。將纖維素酶和活化單甲氧基聚乙二醇按照質量比為1∶2～6加入到pH為5.0～7.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，控制溫度為0℃～8℃，反應1～5小時。采用截留分子量為5000～10000的超濾膜分離出與單甲氧基聚乙二醇膠連得到的改性纖維素酶，低溫冷凍干燥得到改性纖維素酶。
3、酶的活化按改性纖維素酶與β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果膠酶的質量比為10∶1∶5∶5混合后，于40～60℃水中活化5～15min，得到復合酶液。
4、原料纖維素的糖化向步驟1得到的濾渣中按顆粒原料與水的質量比1∶8～10加入水，調節溫度至45～55℃，用質量濃度98％濃硫酸pH值為5～6。按玉米秸稈重量的0.5～1％加入活化后的混合酶液，利用超聲振蕩促進酶催化水解反應，超聲振蕩功率為80～800w，振蕩頻率為20～40kHz，反應時間為3～8h。抽濾得糖液備用。
5、糖液的濃縮步驟4的糖液40℃～70℃，減壓蒸發得到質量濃度為25～35％糖液，用于燃料乙醇的發酵工藝。
本發明的優點在于整個糖化工藝避免了高溫高壓及酸處理過程，設備成本降低，且能耗相對較低，污染小；改性纖維素酶對環境的適應能力增強，能與其他輔助酶制劑同時加入并達到較高的活性；超聲振蕩可以有效的提高酶催化反應的效率，減少反應時間；對原料綜合利用，可以得到木質素產品；最終糖化液濃度較高，且不含對發酵酵母有害的毒性成分。
具體實施例方式
實施例一將玉米秸稈粉碎成40目顆粒，取10g粉碎好的原料，加入8％NaOH150ml于25℃反應8h，抽濾得濾渣和濾液。用6.5ml質量濃度98％濃硫酸將濾液pH值調整為3，溫度50℃，沉淀30min離心分離得到純凈的木質素0.92g，提取率為84.4％，產品純度為82％。濾渣水洗至pH值為8，再向濾渣中加入80mlH2O，調整溫度至50℃，用1.2ml濃度2mol/L硫酸將pH值調至6.5。
將20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，20℃重結晶兩次后，得到純化的三聚氯氰17.9g。在1000mL的三口燒瓶中加入5.0g的4A分子篩，10.0g無水碳酸鈉，500mL苯和20.0g單甲氧基聚乙二醇4000，常溫攪拌30分鐘后，布氏漏斗過濾，除去4A分子篩和碳酸鈉；濾液收集到三口燒瓶中，然后加入純化的三聚氯氰0.4613g，常溫條件下反應36小時。溶液經濃縮，布氏漏斗過濾，然后在溫度為-14℃下低溫干燥，得到活化的單甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的燒瓶中加入4.0g的活化單甲氧基聚乙二醇4000和pH為6.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液100mL，調節溫度為4℃，活化單甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入1.0g纖維素酶，反應2小時后利用截留分子量為5000的聚砜超濾膜分離得到改性纖維素酶。
分別取改性纖維素酶50mg、β-葡萄糖苷酶5mg、淀粉酶25mg、果膠酶25mg、于20ml、50℃水中活化15min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超聲場中進行酶催化反應，超聲振蕩功率為80w，振蕩頻率為20kHz，反應8h。抽濾得濾液，濾液55℃減壓蒸發得到還原糖濃度為35.5％的糖液12ml，該糖液用于燃料乙醇的發酵工藝。測得木質纖維素的降解率為67.2％，糖化率44.3％。
實施例二將玉米秸稈粉碎成20目顆粒，取10g粉碎好的原料，加入5％NaOH150ml于25℃反應3h，抽濾得濾渣和濾液。用4.2ml質量濃度98％濃硫酸將濾液pH值調整為3，溫度50℃，沉淀30min離心分離得到純凈的木質素0.73g，提取率為67％，產品純度為79％。濾渣水洗至pH值為8，再向濾渣中加入80mlH2O，調整溫度至50℃，用1.1ml濃度2mol/L硫酸將pH值調至6.5。
將10.0g三聚氯氰溶解于150mL苯中，12℃重結晶兩次，得到純化的三聚氯氰8.7g。在1000mL的三口燒瓶中加入2.5g的4A分子篩，8.0g無水碳酸鈉，400mL苯和10.0g單甲氧基聚乙二醇4000，常溫攪拌40分鐘后，布氏漏斗過濾，除去4A分子篩和碳酸鈉；濾液收集到三口燒瓶中，然后加入純化的三聚氯氰0.2306g，常溫條件下反應38小時。溶液經濃縮，布氏漏斗過濾，溫度為-14℃下低溫干燥，得到活化的單甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的燒瓶中加入8.0g活化單甲氧基聚乙二醇4000和pH為7.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液200mL，調節溫度為4℃，活化單甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纖維素酶，反應2小時后用截留分子量為4000的聚砜超濾膜分離得到改性纖維素酶。
分別取纖維素酶50mg、β-葡萄糖苷酶5mg、淀粉酶25mg、果膠酶25mg、于20ml、50℃水中活化10min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超聲場中進行酶催化反應，超聲振蕩功率為300w，振蕩頻率為40kHz，反應4h。壓濾得濾液，濾液加溫減壓蒸發得到還原糖濃度為30.2％的糖液12ml，可用于燃料乙醇的發酵工藝。測得木質纖維素的降解率為54.2％，糖化率36％。
實施例三將玉米秸稈粉碎成40目顆粒，取10g粉碎好的原料，加入3％NaOH120ml于25℃反應3h，抽濾得濾渣和濾液。用3.6ml質量濃度98％濃硫酸將濾液pH值調整為6，溫度30℃，沉淀30min離心分離得到純凈的木質素0.66g，提取率為60.6％，產品純度為72％。濾渣水洗至pH值為8，再向濾渣中加入80mlH2O，調整溫度至50℃，pH值為6.5。
將20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，3℃重結晶兩次，得到純化的三聚氯氰18.3g。在1000mL的三口燒瓶中加入8.0g的4A分子篩，12.0g無水碳酸鈉，600mL苯和30.0g單甲氧基聚乙二醇4000，常溫攪拌60分鐘后，布氏漏斗過濾，除去4A分子篩和碳酸鈉；濾液收集到三口燒瓶中，然后加入純化的三聚氯氰0.5535g，常溫條件下反應40小時。溶液經濃縮，布氏漏斗過濾，溫度為-14.2℃下低溫干燥，得到活化的單甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的燒瓶中加入8.0g活化單甲氧基聚乙二醇4000和pH為6.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液200mL，調節溫度為4℃，活化單甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纖維素酶，反應2小時后利用截留分子量為4000的聚砜超濾膜分離得到改性纖維素酶。
分別取纖維素酶100mg、β-葡萄糖苷酶10mg、淀粉酶50mg、果膠酶50mg、于20ml50℃水中活化5min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超聲場中進行酶催化反應，超聲振蕩功率為500w，振蕩頻率為20kHz，反應3h。壓濾得濾液，濾液加溫減壓蒸發得到還原糖濃度為28％的糖液15ml，可用于燃料乙醇的發酵工藝。測得木質纖維素的降解率為56.3％，糖化率42％。
權利要求
1.一種超聲波協同改性纖維素酶催化纖維素糖化反應的方法，其特征在于包括以下過程1)、原料的預處理將玉米秸稈粉碎成20～40目顆粒，取粉碎好的原料，按克/毫升固液比為1∶10～20，用質量濃度3％～10％NaOH于25℃反應3～8小時，抽濾得濾渣和濾液，濾渣水洗至pH值為7～8，備用，用質量濃度98％濃硫酸將濾液調至pH值為3～6，加熱到30～80℃，沉淀30～60分鐘離心分離得到木質素；2)、纖維素酶改性配制質量濃度為6％～15％的三聚氯氰苯溶液，重結晶兩次，得到純化的三聚氯氰，按單甲氧基聚乙二醇4000與4A分子篩和無水碳酸鈉的質量比為1∶2～6∶4～10將單甲氧基聚乙二醇4000、4A分子篩和無水碳酸鈉加入溶劑苯中，常溫攪拌30～60分鐘后，過濾，去除4A分子篩和碳酸鈉得到濾液，然后按照聚甲氧基乙二醇4000與純化的三聚氯氰的摩爾比為2～2.5∶1將純化的三聚氯氰加入到濾液中，常溫條件下反應20～50小時，溶液再經濃縮，過濾，低溫干燥，得到活化的單甲氧基聚乙二醇，將纖維素酶和活化單甲氧基聚乙二醇按照質量比為1∶2～6加入到pH為5.0～7.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，控制溫度為0℃～8℃，反應1～5小時，采用截留分子量為5000～10000的超濾膜分離出與單甲氧基聚乙二醇膠連得到的改性纖維素酶，低溫冷凍干燥得到改性纖維素酶；3)、酶的活化按改性纖維素酶與β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果膠酶的質量比為10∶1∶5∶5混合后，于40～60℃水中活化5～15分鐘，得到復合酶液；4)、原料纖維素的糖化向步驟1)得到的濾渣中按顆粒原料與水的質量比1∶8～10加入水，調節溫度至50℃，用質量濃度98％濃硫酸pH值為6.5，按玉米秸稈重量的0.5％加入活化后的混合酶液，利用超聲振蕩促進酶催化水解反應，超聲振蕩功率為80～800w，振蕩頻率為20～40kHz，反應時間為3～8小時，抽濾得糖液備用；5)、糖液的濃縮步驟4)的糖液40℃～70℃，減壓蒸發得到質量濃度為25～35％糖液，用于燃料乙醇的發酵工藝。
全文摘要
本發明公開了一種超聲波協同改性纖維素酶催化木質纖維素糖化的方法。屬于木質纖維素糖化的技術。該方法主要包括以下步驟通過粉碎和堿預處理分離原料中的木質素。用活化后的單甲氧基聚乙二醇與纖維素酶在檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液中反應得到改性纖維素酶，將改性纖維素酶與β－葡萄糖苷酶、淀粉酶和果膠酶混合得到復合酶液。將復合酶按照相應的比例加入預處理后的原料中，配合超聲波進行酶催化反應，最后經過濾、減壓蒸發，得到濃縮糖液。本發明的優點在于改性纖維素酶能與其他輔助酶制劑同時加入并達到較高的活性；超聲振蕩提高酶催化反應的效率，減少反應時間；可以得到木質素產品；最終糖化液濃度較高。
文檔編號C12N9/42GK1970781SQ20061012991
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月7日 優先權日2006年12月7日
發明者張裕卿, 梁江華, 李濱縣 申請人:天津大學