甘油通道基因及其用途的制作方法

專利名稱：甘油通道基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甘油通道(Glycerol Channel)基因及其用途，特別是涉及制造醇厚感、柔滑感等優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過控制編碼釀造酵母甘油通道Fps1p的基因FPS1，特別是啤酒酵母中特征性的nonScFPS1基因的表達量，可控制產品的醇厚感、柔滑感等的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
背景技術：
甘油除作為甜味成分以外還對酒的醇厚感、柔滑感等起作用，是重要的呈味物質之一。
至今為止，一直在進行以提高酒中甘油含量為目的的甘油生產量高的酵母的育種。為對酵母施行突變處理，高效分離甘油生產量高的酵母，已有關于以烯丙醇或吡唑抗性為指標的方法(日本特公平7-89901號公報)、以甘油一氯茚滿(ヒドリン)抗性為指標的方法(日本特開平10-210968號公報)、以耐鹽性為指標的方法(日本特開平7-115956號公報)、以氨基酸類似物抗性為指標的方法(J.Ferment.Bioeng.，80，218-222(1995))的報道。
還有，在通過利用基因操作技術的酵母育種方法中，Saccharomycescerevisiae的3-磷酸甘油脫氫酶GPD1在啤酒酵母、葡萄酒酵母等中高表達的實例的報道(FEMS yeast Res.2225-232(2002)、Appl Environ Microbiol.65143-149(1999))。

發(fā)明內容
如上所述，為使產品中甘油含量增大，獲取了突變株，但其結果顯示了未曾預期的發(fā)酵延遲和不受歡迎的香味成分等的增加，所以，作為實用性酵母還存在著問題。由此，非常期望有既不影響發(fā)酵速度、不損害產品品質，又能生產充分量甘油的酵母育種方法。
本發(fā)明者等為解決上述課題不斷銳意研究的結果，從啤酒酵母中成功地鑒定·分離出了編碼已知蛋白質中起有益作用的甘油通道的基因。另外，制備了將所得基因導入酵母并使其表達的轉化酵母，確認了甘油生成量的增加，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型甘油通道基因、該基因編碼的蛋白質、調節(jié)了該基因表達的轉化酵母、通過使用調節(jié)了該基因表達的酵母，以控制產品中甘油量的控制方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。
(1)選自以下(a)～(f)組的多核苷酸(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1中的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其選自以下(g)～(i)組成的組(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)選自以下(j)～(m)組成的組中的多核苷酸(j)編碼具有上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)轉錄產物的互補堿基序列的RNA的多核苷酸，；(k)編碼通過RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸；(l)編碼具有特異性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉錄產物活性的RNA的多核苷酸；及(m)編碼通過共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸。
(7)一種蛋白質，其由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼。
(8)一種載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(z)組成要素的表達框架(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中所述的多核苷酸，其與該啟動子以正向結合；以及(z)與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷酸化有關的、在酵母中起作用的信號。
(9)一種載體，其含有上述(6)中所述的多核苷酸。
(10)一種酵母，其中導入了上述(8)或(9)中所述的載體。
(11)上述(10)中所述的酵母，其增強了甘油的生成能力。
(12)一種酵母，其通過導入上述(9)中所述的載體，或通過破壞與上述(5)中所述多核苷酸(DNA)有關的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)的表達。
(13)上述(10)中所述的酵母，其通過使上述(7)中所述的蛋白質的表達量增加，提高甘油的生成能力。
(14)一種酒類的制造方法，其使用上述(10)～(13)中任一項所述的酵母。
(15)上述(14)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
(16)上述(14)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
(17)一種酒類，其用上述(14)～(16)中任一項所述的方法制造。
(18)評價方法，其是使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的甘油生成能力的方法。
(18a)根據(jù)上述(18)中所述的方法，選別甘油生成能力高或低的酵母的方法。
(18b)使用通過(18a)中所述方法選別的酵母制造酒類(例如啤酒)的方法。
(19)評價方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，評價被檢酵母的甘油生成能力。
(20)一種酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，對上述(7)中所述的蛋白質定量或測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，選擇與目的甘油生成能力相應的前述蛋白質量或前述基因表達量的被檢酵母。
(20a)一科酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，測定甘油生成能力或甘油通道活性，選擇目的甘油生成能力或甘油通道活性的被檢酵母。
(21)上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列的甘油通道基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達或低表達的被檢酵母。
(22)上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，對各酵母中上述(7)中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質量比標準酵母多或少的被檢酵母。即上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)多種酵母，對各酵母中上述(7)中所述的蛋白質定量，選擇其中該蛋白質量多或少的被檢酵母。
(23)一種酒類的制造方法，其特征在于，使用上述(10)～(13)中所述的酵母及通過上述(20)～(22)的方法選擇的任一種酵母，進行用于酒類制造的發(fā)酵，調節(jié)甘油生成量。


圖1是啤酒試驗釀造中酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示OD660時的值。
圖2是啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是啤酒試驗釀造中酵母的nonScFPS1基因表達變動的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示檢測出的信號輝度。
圖4是啤酒試驗釀造中酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示OD660時的值。
圖5是啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖6是啤酒試驗釀造中甘油生成量經時變化的示意圖。橫坐標表示發(fā)酵時間，縱坐標表示甘油量(g/L)的值。
具體實施例方式
本發(fā)明者等認為，通過增大或減少酵母的甘油通道活性，可控制產品中的甘油?；诖嗽O想反復進行了研究，以用日本特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎，分離·鑒定了編碼啤酒酵母特有的甘油通道的nonScFPS1基因。此堿基序列如序列號1所示。另外，由此基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列號2所示。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不限于編碼來自上述啤酒酵母的甘油通道基因的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質具同等功能的蛋白質的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質，例如，可例舉為(c)由序列號2的氨基酸序列中1個或多個的氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質。
作為此種蛋白質，在序列號2的氨基酸序列中，例如，可以舉出由1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數(shù)個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質。上述氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或付加的數(shù)量，一般優(yōu)選較小的數(shù)量。此種蛋白質，可例舉為具有(d)與序列號2的氨基酸序列有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的氨基酸序列，且具有甘油通道活性的蛋白質。上述同源性的數(shù)值一般越大越好。
甘油通道活性，例如可根據(jù)Eur.J.Biochem.271771-779，2004中所述的方法測定。
另外，本發(fā)明也包含(e)含有與序列號1堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交、且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交、且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴格條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸、或編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如，可利用MolecularCloning 3rd Ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的“嚴格條件”可為低嚴格條件、中嚴格條件、高嚴格條件中的任一種?！暗蛧栏駰l件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件?！爸袊栏駰l件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件?！案邍栏駰l件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員通過適宜選擇這些因素，均可實現(xiàn)同樣的嚴格條件。
另外，雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據(jù)試劑盒中附帶的說明方案，與標記了的探針進行一夜培養(yǎng)后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗滌緩沖液洗滌1次后，可檢測雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外，可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認值(default)計算時，可以舉出編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同一性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、堿基序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來決定。開發(fā)了基于BLAST算法、被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數(shù)例如為score＝100、wordlength＝12。另外，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認值(default)參數(shù)。
而且，本發(fā)明的多核苷酸包含(j)編碼具有上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉錄產物的互補堿基序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸；(l)編碼具有特異性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉錄產物活性的RNA的多核苷酸；及(m)編碼通過共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸。這些多核苷酸整合進載體，并可在導入了其載體的轉化細胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表達。因此，在適合抑制上述多核苷酸(例如DNA)表達的場合優(yōu)選使用。
本說明書中，“編碼具有DNA轉錄產物的互補堿基序列的RNA的多核苷酸”，是指所謂的反義DNA。反義技術，作為抑制特定的內源性基因表達的方法己為人們公知，在各種文獻中均有記載[例如，參照平島及井上新生化學實驗講座2核酸IV基因的復制和表達(日本生化學會編，東京化學同人)pp.319-347，1993等]。反義DNA的序列，優(yōu)選與內源性基因或其一部分互補的序列，但只要能有效地抑制基因的表達，即使不完全互補也可。被轉錄的RNA與靶基因的轉錄產物，優(yōu)選具有等于或大于90％，更優(yōu)選具有等于或大于95％的互補性。反義DNA的長度，至少為等于或大于15個堿基，優(yōu)選等于或大于100個堿基，更優(yōu)選等于或大于500個堿基。
本說明書中，“編碼通過RNAi作用抑制DNA表達的RNA的多核苷酸”，是指用于通過RNA interference(RNAi)抑制內源性基因表達的多核苷酸。“RNAi”是指將具有與靶基因序列同一或類似的序列的雙鏈RNA導入細胞內時，導入的外源基因及內源性靶基因的表達均被抑制的現(xiàn)象。此處使用的RNA，例如可為產生了21～25堿基長度的RNA干涉的雙鏈RNA，例如，dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此種RNA可通過脂質體等的釋放系統(tǒng)向所需位點局部釋放，且使用生成上述雙鏈RNA的載體使其局部表達。此種雙鏈RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制備方法、使用方法等已由許多文獻公開(參照特表2002-516062號公報；美國公開專利第2002/086356A號說明書；NatureGenetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，4076802，319-20，2002 Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；Proc Natl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002 May；Nucleic Acids Res.，3010，e46，2002 May 15等)。
本說明書中，“編碼具有特異性切割DNA轉錄產物活性的RNA的多核苷酸”一般是指酸性核酸。酸性核酸是指具有催化活性的RNA分子，通過切割靶DNA的轉錄產物，阻斷其基因的功能。酸性核酸的設計可參照各種公知文獻(例如參照FEBS Lett.228228，1988；FEBS Lett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature 323349，1986；Nucl.Acids.Res.196751，1991；Protein Eng 3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；Biochem Biophys Res Commun 1861271，1992等)。且“編碼由共抑制作用抑制DNA表達的RNA的多核苷酸”，是指通過“共抑制”，阻斷靶DNA功能的核苷酸。
本說明書中，“共抑制”是指細胞中通過由轉化導入與內源性靶基因具有同一或類似序列的基因，導入的外源基因及內源性靶基因的表達均被抑制的現(xiàn)象。具有共抑制作用的多核苷酸的設計，可參照種種公知文獻(例如，參照Smyth DRCurr.Biol.7R793，1997、Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本發(fā)明的蛋白質本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一個編碼的蛋白質。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質，是由序列號2中的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質。
此種蛋白質，例如，可例舉為由序列號2的氨基酸序列中上述數(shù)量的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質。另外，此種蛋白質，可例舉為含有與序列號2的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有甘油通道活性的蛋白質。
此種蛋白質，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點誘變法獲得。
本發(fā)明的蛋白質氨基酸序列中等于或大于1個的氨基酸殘基被缺失、取代、插入及/或附加，是指在同一序列中任意的、且1個或多個的氨基酸序列的位置上，有1個或多個氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或附加之意，缺失、取代、插入及附加中的2種或大于2種也可同時發(fā)生。以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質可通過Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化學合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、ProteinTechnologies Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、島津制作所公司制等的肽合成機進行化學合成。
3.本發(fā)明的載體及導入了該載體的轉化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)或上述(j)～(m)中任一項所述的多核苷酸。另外，本發(fā)明的載體通常如下構成，其含有(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向結合的、上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉錄終止及聚腺苷酸化有關的、在酵母中起作用的信號作為構成因子的表達框架。本發(fā)明中，后述的酒類(例如啤酒)釀造中，在使上述本發(fā)明的蛋白質高表達時，為促進上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達，將這些多核苷酸針對該啟動子正向導入。另外，在后述的酒類(例如啤酒)釀造中，在抑制上述本發(fā)明的蛋白質表達時，為抑制上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達，將這些多核苷酸針對該啟動子反向導入。在抑制上述本發(fā)明的蛋白質表達時，也可在載體中導入上述(j)～(m)中任一項所述的多核苷酸，使其能表達。還有，在本發(fā)明中，通過破壞上述靶基因(DNA)，可抑制上述多核苷酸(DNA)的表達或上述蛋白質的表達?；虻钠茐模赏ㄟ^參與靶基因中基因產物表達的區(qū)域，例如向編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域等的內部使附加或缺失單一或多個堿基，或使這些區(qū)域的全體缺失來進行。此種基因破壞的手法，可參照公知的文獻(例如，參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)；Methods in Enzymology，101，202(1983)；Yeast，101793-1808(1994)；日本特開平6-253826號公報等)。
導入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，作為YEp型載體，YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)；作為YCp型載體，YCp50(M.D.Rose et al.，Gene，60，237，1987)；作為YIp型載體，YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調節(jié)酵母中基因表達的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時又不受醪液中成分的影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷甘油酸激酶(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如可通過M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中詳細記載的已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標記，所以，轉化時使用的選擇性標記可利用耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍菌素基因(fas2m，PDR4)(分別參見豬腰淳嗣等，生化學，64，660，1992；Hussain et al.，Gene，101，149，1991)等。
如上所述構建的載體被導入宿主酵母。作為宿主酵母，為可用于釀造的任意的酵母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，雖可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，但在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；還可使用例如協(xié)會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會酵母、清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomycespastorianus。
酵母的轉化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養(yǎng)，使OD600nm時的值為1～6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進行預處理。將此細胞在約30℃、靜置約60分鐘后，與導入的DNA(約1～20μg)同時在約30℃、靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000Dalton的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將此細胞在約42℃、加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細胞懸浮液用標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入所定量的新鮮標準酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30℃、靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養(yǎng)基上，獲得轉化體。
有關其他一般性的克隆技術，可參照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Y east Genetics，A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒類制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒類將上述本發(fā)明的載體導入適合釀造需制造酒類的酵母中，通過使用該酵母，制造所需要的、增大了甘油含量、增加了醇厚感、柔滑感等的酒類。另外，通過下述本發(fā)明的酵母評價方法選擇的酵母也可同樣使用。作為制造對象的酒類并不限于此，例如可例舉為啤酒、發(fā)泡酒等的啤酒味飲料，葡萄酒、威士忌、清酒等。本發(fā)明中，根據(jù)需要，可通過使用抑制靶基因表達的釀造用酵母，制造使所需酒類的甘油含量降低了的酒類。即使用導入了上述本發(fā)明的載體的酵母、抑制了上述本發(fā)明多核苷酸(DNA)表達的酵母或根據(jù)下述本發(fā)明的酵母的評價方法選擇的酵母，進行用于酒類制造的發(fā)酵，通過調節(jié)(增加或減低)甘油生成量，制造所需種類的、且調節(jié)(增加或減低)了甘油含量的酒類。
制造上述酒類時，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往完全相同，不會為制造增大了甘油含量的酒類而增加成本。即，根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設施、不增加成本的情況下，制造出醇厚感、柔滑感等優(yōu)異的酒類。
5.本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的甘油通道基因堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的甘油生成能力的方法。此種評價方法的一般手法為公知，例如，如WO01/040514號公報、日本特開平8-205900號公報等的記載。以下，就此評價方法進行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Y east Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據(jù)甘油通道基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設計的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設計可使用公知的手法進行。
基因或特異性序列的檢測，可使用公知的手法進行。例如，將含有包含特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸作為一個引物使用，另一個引物使用含有包含此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸，通過PCR法擴增酵母的核酸，并測定擴增物的有無、擴增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為等于或大于10bp，優(yōu)選為15～25bp。另外，夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常為300～2000bp較適當。
PCR法的反應條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環(huán)數(shù)等于或大于10次等的條件。所得到的反應生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測定擴增產物的分子量。根據(jù)此方法，通過擴增產物的分子量是否含有特異部分的DNA分子的大小，來預測·評價其酵母的甘油生成能力。另外，通過分析擴增物的堿基序列，可進一步更正確地預測·評價上述性能。
本發(fā)明中，也可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，評價被檢酵母的甘油生成能力。還有，甘油通道基因的表達量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對甘油通道基因的產物mRNA或蛋白質進行定量來進行。mRNA或蛋白質的定量，可使用公知的手法來進行。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量的RT-PCR等，蛋白質的定量例如可通過Western印跡法來進行(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
而且，通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，選擇與目的甘油生成能力相應的前述基因表達量的酵母，可選擇適合釀造所需酒類的酵母。另外，也可培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定各酵母中前述基因的表達量，比較標準酵母和被檢酵母的前述基因的表達量，以選擇所需的酵母。具體地說，例如，可通過培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的各酵母中的表達量，通過選擇該基因比標準酵母高表達或低表達的被檢酵母，來選擇適合所需酒類釀造的酵母。
或者，通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇甘油生成能力高或低的、或甘油通道活性高或低的酵母，以選擇適合所需酒類釀造的被檢酵母。
此時，作為被檢酵母或標準酵母，例如可使用上述導入了本發(fā)明載體的酵母、調節(jié)了上述本發(fā)明的多核苷酸(DNA)表達的酵母、實施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。甘油生成能力，例如可通過Method of EnzymaticAnalysis，vol.4 1825-1831，1974中所述的方法測定。甘油通道活性，例如可通過Eur.J.Biochem.271771-779，2004中所述的方法測定。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處理的化學方法等的任何方法進行(例如，參照大島泰治編著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法，p 67-75、學會出版中心等)。
還有，可作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母(例如，Saccharomyces pastorianus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis)，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomycescarlsbergensis NCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用例如協(xié)會葡萄酒用1號、同3號、同4號等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會酵母、清酒用7號、同9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomyces pastorianus。標準酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實施例以下，通過實施例詳細敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1新型甘油通道基因(nonScFPS1)的克隆使用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫檢索的結果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的新型甘油通道基因nonScFPS1(序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎，設計用于擴增各自全長基因的引物nonScFPS1_for(序列號3)/nonScFPS1_rv(序列號4)，以基因組解讀株Saccharomycespastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScFPS1全長基因的DNA片段(約2kb)。
將如上所述得到的nonScFPS1基因片段，通過TA克隆，插入到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen公司制)。將nonScFPS1基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。
實施例2啤酒試驗釀造中nonScFPS1基因表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行啤酒試驗釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度 12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度 8.6ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母投入量 12.8×106cells/mL對發(fā)酵液經時抽樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經時變化。與此同時，對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進行生物素標記，使其在啤酒酵母DNA微陣列中雜交。信號檢測使用GCOSGeneChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)來進行。nonScFPS1基因表達模式如圖3所示。由此結果，可確認通常的啤酒發(fā)酵中nonScFPS1基因進行了表達。
實施例3nonScFPS1基因高表達株的制備將實施例1中所述的nonScFPS1/pCR2.1-TOPO用限制性內切酶SacI及BamHI酶切，制備包含蛋白質編碼區(qū)域全長的DNA片段。使此片段與用限制性內切酶SacI及BamHI処理的pYEGNot連接，構建了nonScFPS1高表達載體nonScFPS1/pYEGNot。pYEGNot是YEp型的酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達。酵母中的選擇性標記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達載體，用日本特開平07-303475中所述的方法轉化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉化體。
實施例4啤酒試驗釀造中甘油生成量的解析使用親株(34/70株)及實施例3得到的nonScFPS1高表達株，通過以下條件進行了發(fā)酵試驗。
麥汁浸出物濃度 12.8％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度 約10ppm發(fā)酵溫度 15℃一定酵母投入量 6g濕酵母菌體/L麥汁對發(fā)酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(圖4)、浸出物消耗量的經時變化(圖5)、甘油生成量的經時變化(圖6)。對醪液中甘油的定量使用F-試劑盒甘油(產品編號148270、Roche公司制)進行(參照Method of Enzymatic Analysis，vol.4 1825-1831，1974等)。發(fā)酵終止時醪液中的甘油對于親株的1.6g/L，nonScFPS1高表達株為2.1g/L，增加到約1.3倍。
實施例5nonScFPS1基因的破壞按照文獻(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，以含有抗藥性標記的質粒[pFA6a(G418r)，pAG25(nat1)，pAG32(hph)]為模板，通過PCR，制備了基因破壞用片段。
用制備的基因破壞用片段轉化啤酒酵母Saccharomyces pastorianusW34/70株、或由W34/70分離的孢子克隆株(W34/70-2)。轉化用日本特開平07-303475中所述的方法進行。選擇藥劑的濃度分別為geneticin 300mg/L、諾爾絲菌素50mg/L。
實施例6啤酒試驗釀造甘油生成量的解析使用親株及實施例5得到的nonScFPS1破壞株，按以下條件進行。
麥汁浸出物濃度 13％麥汁容量1L麥汁溶解氧濃度 約10ppm發(fā)酵溫度15℃酵母投入量 6g濕酵母菌體/L麥汁對發(fā)酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)、浸出物消耗量的經時變化、甘油生成量的經時變化。對甘油的定量使用F-試劑盒甘油(產品編號148270、Roche公司制)進行(參照Method of Enzymatic Analysis，vol.41825-1831，1974等)。
根據(jù)本發(fā)明的酒類制造法，因控制向產品賦予醇厚感、柔滑感等的甘油含量，所以，可制造出香味優(yōu)異的酒類。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>甘油通道基因及其用途(Glycerol channel gene and use thereof)<130>G06-0063CN<150>JP2005-253281<151>2005-09-01<150>JP2006-55562<151>2006-03-01<160>4<210>1<211>1986<212>DNA<213>酵母(yeast)<400>1atgagtaatc ctcaaaaggc cttaaacgat tttctgtcca atgaatcagt ccacactcat 60gagagttcta gaaaacaatc tcataataga cgctcatcgg acgaaggacg ttcttcctca 120caaccctcac atcatcattc caacggtcac aataataatg gtagccctgg taacggtaat 180gatggggaca acgatgatgg ttatgactat gagatgcaag attatagacc gtcgcaacaa 240agcgcgcttc ccacacctac atacgtccca cagtattctg taggaagtgg gccctctttc 300ccgatccagg aggtcgttcc taacgcgtac ataaacacac aagacacgaa ccataaagat 360aacggtccgc caagtgcaag tagtaataga gcattcagac caagaggcca aaccaccgta 420tcagcgaacg tacttaacgt cgaggatttt tataagaatg gagatgacgc gtatactata 480ccagagtcgc atctgtcgag aagaaggagc agatcaaggg ctgagagcaa cactggtcac 540agcgccacta cgggcgctac aaatgcaagg actactggcg ctcaaaccaa tatggaaaat 600
aacgagccgc cacgtagcgt tcctattatg gtgaagccaa aaacgctgta ccagaatcct 660caaactccaa cagttttgcc ttccacgtac catccgatca acaaatggtc ttcggtgaaa 720aacacttact tgaaggaatt tctggctgaa tttatgggaa caatggttat gattattttc 780ggtagtgccg tcgtatgtca agtcaatgtt gcgggcaaaa tacagcaaga caacttcaat 840tcagctctgg ataatattaa agtcaccgat tcctccgcag aaacgataga aactatgaag 900agtctaactt cgctagtatc ttctgttgca ggcggtacgt ttgacgatgt ggcactgggt 960tgggctgctg ccgtcgtgat gggatatttc tgtgctggtg gtagtgctat ctccggtgct1020catttgaatc catctattac attggcaaat ctggtatata gaggtttccc cctaaagaag1080gtgccctatt attttgctgg acaactgatc ggggccttta cgggtgcttt gattttgttt1140atttggtata aaagagtgct acaagaggca tacggcgata tatggataag cgaaagtgtt1200gcgggaatgt tttgtgtttt tccaaagcct tatttaagtt caggaagaca atttttttcc1260gaatttctat gtggggctat gttgcaagct ggtacatttg cgttgaccga tccttataca1320tgtttgtcat ccgatgtttt cccgttaatg atgttcattc tgatttttgt cataaatgcc1380tccatggcct atcaaacggg tacagcaatg aatttggctc gtgacttagg cccacgtctc1440gccttgtacg ctgttggatt tgaccataga atgctttgga tacaccacca tcatttcttt1500tgggtaccta tggtaggtcc atttcttggt gcattaatgg gcgggctggt ttatgatgtt1560tgtatttatc agggtcatga atctccagtc aattggtctt taccagtcta taaggaaatg1620ataatgagag cttggttcag aagacccggt tggaaaaaga gaaacagagc tagaagaaca1680tcggacttga gtgatttctc ctacaacaac gatgacgatg acgatgagtt cggtgaaaga1740atggctcttc aaaagacaaa aactaagtca tccatttcag acaacgaaaa tgaagctggt1800gaaaagaaag tccaatttaa gtctgttcag cgtggtaaaa gaacgttcgg aggtatacca1860accattcttg aagaagagga ttctatcgaa acagcttcac taggtgcgac taccacagat1920tccatgggat tgtctgatat atcttcagaa gattctcatt tcgggaattt aaagaaagta1980acgtag 1986<210>2<211>661<212>PRT<213>酵母(yeast)<400>2
Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Asn Glu Ser15 10 15Val His Thr His Glu Ser Ser Arg Lys Gln Ser His Asn Arg Arg Ser20 25 30Ser Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Asn35 40 45Gly His Asn Asn Asn Gly Ser Pro Gly Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asn50 55 60Asp Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln65 70 75 80Ser Ala Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Gly Ser85 90 95Gly Pro Ser Phe Pro Ile Gln Glu Val Val Pro Asn Ala Tyr Ile Asn100 105 110Thr Gln Asp Thr Asn His Lys Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser115 120 125Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val130 135 140Leu Asn Val Glu Asp Phe Tyr Lys Asn Gly Asp Asp Ala Tyr Thr Ile145 150 155 160Pro Glu Ser His Leu Ser Arg Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Glu Ser65 170 175Asn Thr Gly His Ser Ala Thr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Arg Thr Thr180 185 190Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu Asn Asn Glu Pro Pro Arg Ser Val Pro195 200 205Ile Met Val Lys Pro Lys Thr Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr210 215 220Val Leu Pro Ser Thr Tyr His Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys225 230 235 240Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val245 250 255Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly
260 265 270Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe Asn Ser Ala Leu Asp Asn Ile Lys Val275 280 285Thr Asp Ser Ser Ala Glu Thr Ile Glu Thr Met Lys Ser Leu Thr Ser290 295 300Leu Val Ser Ser Val Ala Gly Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly305 310 315 320Trp Ala Ala Ala Val Val Met Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala325 330 335Ile Ser Gly Ala His Leu Asn Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val340 345 350Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln355 360 365Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys370 375 380Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr Gly Asp Ile Trp Ile Ser Glu Ser Val385 390 395 400Ala Gly Met Phe Cys Val Phe Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg405 410 415Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr420 425 430Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro435 440 445Leu Met Met Phe Ile Leu Ile Phe Val Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr450 455 460Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu465 470 475 480Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe Asp His Arg Met Leu Trp Ile His His485 490 495His His Phe Phe Trp Val Pro Met Val Gly Pro Phe Leu Gly Ala Leu500 505 510Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser515 520 525
Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala530 535 540Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr545 550 555 560Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Asp Asp Glu565 570 575Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile580 585 590Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser595 600 605Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu610 615 620Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp625 630 635 640Ser Met Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ser Glu Asp Ser His Phe Gly Asn645 650 655Leu Lys Lys Val Thr660<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<223>引物(primer)<400>3gagctcatag cggccatgag taatcctcaa aaggccttaa40
<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<223>引物(primer)<400>4ggatcctatg cggccgctat acctctttgt acaaatttat at 4權利要求
1.一種多核苷酸，其選自以下由(a)～(f)組成的組中(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
2.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其選自由以下(g)～(i)組成的組(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或附加了的氨基酸序列組成的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同一性的氨基酸序列的，且具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸，在嚴格條件下雜交，且編碼具有甘油通道活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
3.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.按照權利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
5.按照權利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
6.一種多核苷酸，其選自由以下(j)～(m)組成的組(j)編碼具有權利要求5中所述的多核苷酸(DNA)轉錄產物的互補堿基序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用抑制權利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸；(l)編碼具有特異性切割權利要求5中所述多核苷酸(DNA)轉錄產物活性的RNA的多核苷酸；及(m)編碼通過共抑制作用抑制權利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達的RNA的多核苷酸。
7.一種蛋白質，其由權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼。
8.一種載體，其含有權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
9.一種載體，其含有權利要求6中所述的多核苷酸。
10.一種酵母，其中導入了權利要求8或9中所述的載體。
11.按照權利要求10中所述的酵母，其增強了甘油生成能力。
12.一種酵母，其通過導入權利要求9中所述的載體，或通過破壞與權利要求5中所述多核苷酸(DNA)有關的基因，抑制權利要求5中所述的多核苷酸(DNA)的表達。
13.按照權利要求10中所述的酵母，其通過使權利要求7中所述蛋白質的表達量增加，提高甘油生成能力。
14.一種酒類的制造方法，其使用權利要求10～13中任一項所述的酵母。
15.按照權利要求14中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
16.按照權利要求14中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
17.一種酒類，其用權利要求14～16中任一項所述的方法制造。
18.一種評價方法，其是使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的甘油生成能力的方法。
19.一種評價方法，其是通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，評價被檢酵母的甘油生成能力的方法。
20.一種酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，對權利要求7中所述的蛋白質定量或測定具有序列號1堿基序列的甘油通道基因的表達量，選擇與目的甘油生成能力相應的前述蛋白質量或前述基因表達量的被檢酵母。
21.按照權利要求20中所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的堿基序列的甘油通道基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達或低表達的被檢酵母。
22.按照權利要求20中所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標準酵母及被檢酵母，對各酵母中的權利要求7中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質量比標準酵母多或少的被檢酵母。
23.一種酒類的制造方法，其特征在于，使用權利要求10～13中所述的酵母及通過權利要求20～22中所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進行用于酒類制造的發(fā)酵，調節(jié)甘油生成量。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘油通道(Glycerol Channel)基因及其用途，特別是涉及制造醇厚感、柔滑感等優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過控制編碼釀造酵母甘油通道Fps1p的基因FPS1、特別是啤酒酵母中特征性的nonScFPS1基因的表達量，控制對產品醇厚感、柔滑感等起作用的甘油的生成能力的酵母及使用該酵母的酒類制造方法等。
文檔編號C12C11/00GK1924018SQ20061012886
公開日2007年3月7日 申請日期2006年8月31日 優(yōu)先權日2005年9月1日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社