專(zhuān)利名稱(chēng)：花生△12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程，尤其涉及一種花生A12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá) 的方法。
背景技術(shù)：
花生是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要油料作物之一，其種子中富含油酸和亞 油酸。A12脂肪酸脫氫酶(FAD2)是亞油酸合成的關(guān)鍵酶，催化油酸(18: 1)在 A12位上脫氫生成亞油酸(18: 2)，其一般存在于植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體 膜上。不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸等，在增加膜的流動(dòng)性中發(fā)揮重要作用， 通過(guò)改變脂肪酸脫氫酶的活性，調(diào)節(jié)膜脂的不飽和程度，增加生物體抗鹽和抗 寒能力。隨著人們對(duì)高品質(zhì)植物油的需求增加，利用基因工程手段調(diào)節(jié)不飽和 脂肪酸含量的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。但由于A(yíng)12脂肪酸脫氫酶本身的特性， 目前還沒(méi)有有效的方法將其純化并在蛋白水平作進(jìn)一步的研究，尚需對(duì)其結(jié)構(gòu) 和功能之間以及表達(dá)調(diào)控進(jìn)行更深入全面的研究。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供花生A12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種花生A12脂肪酸脫氫酶 基因高效表達(dá)的方法，是把花生A12脂肪酸脫氫酶(FAD2)基因全長(zhǎng)序列插入到 大腸桿菌表達(dá)載體pRSETB中，構(gòu)建融合表達(dá)載體pRSET/HO-A，并轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌表達(dá)菌BL21 (DE3)pLysS中，最后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在構(gòu)建融合表達(dá)載體pRSET/HO-A的過(guò)程中，先把FAD2基因進(jìn)行RT-RCR 擴(kuò)增，目的片段連接入克隆載體pMD18，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，獲得陽(yáng)性克隆 pMD/H0-A，最后將pMD/HO-A與表達(dá)載體pRSETB連接。在進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，含有pRSET/HO-A質(zhì)粒的BL21 (DE3) pLysS單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度 為0.8 1.2mM， 22。C再繼續(xù)培養(yǎng)10~15h。在進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，含有pRSET/HO-A質(zhì)粒的BL21 (DE3) pLysS單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度 為lmM， 22。C再繼續(xù)培養(yǎng)12h。在上述技術(shù)方案中，發(fā)明人釆用了pRSET表達(dá)載體，PRSET表達(dá)系統(tǒng)是源 于PUC19的高拷貝質(zhì)粒，能產(chǎn)生是pET表達(dá)量5倍的基因劑量，從而導(dǎo)致大量
重組蛋白的融合表達(dá)。表達(dá)載體pRSET包含T7啟動(dòng)子，可通過(guò)表達(dá)菌株所產(chǎn) 生的T7 RNA聚合酶進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄，目的基因可插入其6XHis標(biāo)簽下游，形 成N末端融合蛋白，6Xhis標(biāo)簽序列通常不影響表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，并且還 可以方便地進(jìn)行融合蛋白的分離與純化。另外，表達(dá)菌株BL21 (DE3) pLysS 含有pLysS質(zhì)粒，能降低靶基因的背景但并不干擾由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平，能 降低外源蛋白對(duì)自身的毒害，保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。經(jīng)檢測(cè)證明，A12脂肪酸脫 氫酶基因獲得了穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)量高達(dá)15.8%，這也是目前所知的脂肪酸脫氫酶 基因在原核生物中的最高表達(dá)量。
圖1為融合表達(dá)載體pRSET/HO-A構(gòu)建圖。圖2為A12脂肪酸脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDSXPAGE分析，其 中A:蛋白標(biāo)準(zhǔn)條帶，B: pRESTB空載體，C-D:包涵體蛋白，E-G:可溶蛋白 分別在30°C、 22°C和18°C， H: 22"條件下的總細(xì)胞菌蛋白；箭頭所指為目的蛋白。圖3脂肪酸甲酯的氣相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜分析圖，其中A:油酸甲酯標(biāo) 準(zhǔn)品，B:脂肪酸甲酯分析。
具體實(shí)施方式
如圖1所示，根據(jù)FAD2同源基因序列簡(jiǎn)并引物，在其兩端各加一個(gè)特異 酶切位點(diǎn)EcoRI、 BamHI，以花生總RNA為模板進(jìn)行RT-RCR擴(kuò)增，獲得一條 約1200bp的片段，連接入克隆載體pMD18,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，挑取陽(yáng)性克 隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示該核苷酸序列包含一個(gè)1140bp的ORF，該序列遞交 GenBank，獲得接收號(hào)為AY900663，命名為pMD/HO-A。將pMD/HO-A和表達(dá) 載體pRSETB分別用EcoRI、 BamHI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回 收1140bp目的條帶和表達(dá)載體2900bp片段，將其按5: 1比例16C連接過(guò)夜后， 取lOpl轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，次日PCR檢菌，鑒定為陽(yáng)性克隆的單菌落用質(zhì)粒 提取Kit提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確定目的基因在pRSETB 中正確的讀碼框和插入方向。最后將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21 (DE3) pLysS中。感受態(tài)細(xì)胞制備采用Sangon高效感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化Kit，重組 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、酶切鑒定及陽(yáng)性克隆的篩選按常規(guī)分子生物技術(shù)進(jìn)行。重組質(zhì)粒 命名為pRSET/HO-A。挑取含有pRSET/HO-A質(zhì)粒的BL21 (DE3) pLysS單菌落在3ml LB培養(yǎng)基 中活化14h后，按2%接種到20ml培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加Amp、 Chl抗生素， 振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmM， 22。C再繼續(xù)培養(yǎng)
12h，培養(yǎng)液在4。C溫度下經(jīng)5000rpm離心10min收集菌體。菌體置于-7(TC中保存?zhèn)溆?。冷凍的菌體加100.ul 、 20mM 、 pH=7.0的磷酸鹽緩沖液，充分懸浮，液 N2速凍后42匸融化，反復(fù)凍融4次后，8000rpm 4"C離心5min，取上清液入另 一千凈離心管中，分別加100|il 2xSDS-PAGE buffer,取等量蛋白進(jìn)行 12。/。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電泳圖通過(guò)凝膠成像儀進(jìn)行分析。如 圖2所示，可以清楚地看到大小約為43KD的目的蛋白條帶，重組質(zhì)粒 pRSET/HO-A轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3) pLysS細(xì)胞總蛋白、上清和沉淀中均有相同 大小特異條帶，但在空載體中沒(méi)有相應(yīng)的目的蛋白條帶的表達(dá)。初步說(shuō)明可能 是目的基因的重組蛋白獲得了表達(dá)；并且大部分是可溶蛋白。凝膠成像儀掃描 分析表明，目的蛋白的表達(dá)量約占總蛋白表達(dá)量的15.8%。采用Clon-Tech蛋白純化Kit將重組蛋白純化，向純化出來(lái)的蛋白中加入底 物油酸和亮胰蛋白酶肽后，在2(TC搖床培養(yǎng)6h，用等體積的氯仿、水與甲醇的混合物抽提，混合物中氯仿甲醇水=2: 1: 2，取氯仿層，加入等體積1%H2S04-甲醇進(jìn)行甲基化處理，55。C水浴6h后，加入正已烷回溶。以亞油酸甲酯(Sigma) 標(biāo)準(zhǔn)品、空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行GC分析，如圖3所示，只有 前者產(chǎn)生保留時(shí)間為8.440min的特殊峰(B)，與亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間 -致，而在其他對(duì)照中沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的峰。脂肪酸甲酯的GC-MS定性分析表明 通過(guò)NIST/EPA/NIH數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)檢索，特殊峰為亞油酸甲酯，分子量為249。 這些結(jié)果表明，pRSET/HO-A所編碼的酶將外源式的油酸合成了亞油酸，具有 A12脂肪酸脫氫酶活性。培養(yǎng)條件對(duì)pRSET-HO-A/BL21 (DE3) pLysS工程菌的蛋白表達(dá)量具有很 大影響。發(fā)明人進(jìn)行了多次試驗(yàn)，確定比較適宜的培養(yǎng)條件為IPTG誘導(dǎo)的濃 度為0.8 1.2mM，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 15h，誘導(dǎo)溫度為18 30°C 。并確定IPTG 誘導(dǎo)的最適濃度為lmM，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12h，誘導(dǎo)的最理想溫度為22"C。其 中誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量和可溶性蛋白含量均有較大影響，因?yàn)闇囟容^低時(shí)有 利于蛋白質(zhì)的正確折疊，增加蛋白質(zhì)的可溶性，保持酶的活性。
權(quán)利要求
1. 一種花生Δ12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法，其特征在于把花生Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)基因全長(zhǎng)序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體pRSETB中，構(gòu)建融合表達(dá)載體pRSET/HO-A，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS中，最后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
2、 如權(quán)利要求1所述的花生A12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法，其特 征在于在構(gòu)建融合表達(dá)載體pRSET/HO-A的過(guò)程中，先把FAD2基因進(jìn)行 RT-RCR擴(kuò)增，目的片段連接入克隆載體pMD18，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，獲得陽(yáng) 性克隆pMD/HO-A，最后將pMD/HO-A與表達(dá)載體pRSETB連接。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的花生A12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法， 其特征在于在進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，含有pRSET/HO-A質(zhì)粒的BL21(DE3) pLysS單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.8 1.2mM， 22"C再繼續(xù)培養(yǎng)10 15h。
4、 如權(quán)利要求3所述的花生A12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法，其特 征在于在進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的過(guò)程中，含有pRSET/HO-A質(zhì)粒的BL21 (DE3 ) pLysS單菌落在培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度 為lmM， 22。C再繼續(xù)培養(yǎng)12h。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種花生Δ12脂肪酸脫氫酶基因高效表達(dá)的方法，是把花生Δ12脂肪酸脫氫酶(FAD2)基因全長(zhǎng)序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體pRSETB中，構(gòu)建融合表達(dá)載體pRSET/HO-A，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS中，最后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)檢測(cè)證明，采用這種方法，Δ12脂肪酸脫氫酶基因獲得了穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)量高達(dá)15.8％，這也是目前所知的脂肪酸脫氫酶基因在原核生物中的最高表達(dá)量。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101210242SQ200610128499
公開(kāi)日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者崔黨群, 殷冬梅 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)