專利名稱：一種飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物酶制劑，具體的涉及一種飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法。
背景技術(shù)：
我國是一個農(nóng)業(yè)大國，養(yǎng)殖業(yè)非常發(fā)達(dá)，因此，生產(chǎn)制造含各種生物酶制劑的復(fù)合型飼料應(yīng)用于畜牧業(yè)，對于促進(jìn)動物生長、節(jié)約糧食、減少污染、保護(hù)環(huán)境具有深遠(yuǎn)的意義?，F(xiàn)有技術(shù)中，生物酶制劑種類一般包括1.內(nèi)源性酶，與消化道分泌的消化酶相似的酶(淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等)；2.外源性酶，消化道不能分泌的類似酶(如纖維素酶，果膠酶，半乳糖苷酶，β-葡聚糖酶，木聚糖酶和植酸酶等)。其中最重要的酶制劑，目前已得到充分肯定的酶制劑主要是阿拉伯木聚糖酶(戊聚糖酶)，β-葡聚糖酶和植酸酶。這三種酶制劑是通過消除日糧中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子而改善動物的生產(chǎn)性能。阿拉伯木聚糖酶是研究最充分，并在當(dāng)前已被廣泛地商業(yè)性用于飼養(yǎng)系統(tǒng)的酶制劑。飼料原料的非淀粉多糖小麥，燕麥，稻谷，麩皮，米糠，統(tǒng)糠等都含有較多的木聚糖。大麥，黑麥，啤酒糟等含有較多的β-葡聚糖酶.這類多聚糖統(tǒng)稱為水溶性非淀粉多糖(NSP)。
現(xiàn)有技術(shù)中，對復(fù)合酶制劑酶特性的測定往往僅限于對其組成成分的單酶活性(簡稱酶活)的測定，而缺乏對其綜合特性的復(fù)合測定。現(xiàn)有技術(shù)中，也僅公開了對部分單酶酶活特性的測定方法，例如對木聚糖酶的酶活特性的測定方法，而沒有對組配后的生物酶復(fù)合制劑特性的測定方法，實踐中也不能全面地了解組配后的復(fù)合酶制劑綜合特性，尤其是不能準(zhǔn)確了解其組配、及其與底物混合后的加工特性，因此無法為篩選畜禽、魚蝦等飼料用復(fù)合酶制劑的配方，及其生產(chǎn)加工提供科學(xué)有效的依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對現(xiàn)有生物酶特性測定技術(shù)的不足，提供一種由簡到繁、用來優(yōu)化篩選復(fù)合酶制劑的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，為畜禽、魚蝦等飼料用復(fù)合酶制劑的配方及其生產(chǎn)提供科學(xué)有效的依據(jù)。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是一種飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其包括如下步驟1)測試擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑的特性，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；2)將擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑中的兩種或多種進(jìn)行分組后混合，測試該組配后該各單酶活性、能量及蛋白價值的變化，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；3)比較步驟1)及2)的結(jié)果，選擇相對特性數(shù)值變化較小的組配，將其加入到不同底物中測試，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；4)變換底物的濃度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；5)采用圖表對比法比較步驟1)～4)的測試結(jié)果，選擇適合加工的單酶制劑、組配及其濃度。
前述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其特征在于，所述的步驟1)，還包括如下步驟11)制備單酶溶液；12)測試并記錄單酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；13)測試并記錄單酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；14)測試并記錄底物濃度變化對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；15)測試并記錄加工工藝對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟12)～15)的順序不分先后。
前述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其特征在于，所述的步驟2)，還包括如下步驟21)測試并記錄該組配酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；22)測試并記錄該組配酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；23)測試并記錄底物濃度變化對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；24)測試并記錄加工工藝對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟21)～24)的順序不分先后。
本發(fā)明的有點在于本發(fā)明提供的方法，可以通過對各種單酶組分及配比的復(fù)合酶制劑的能量和蛋白價值等產(chǎn)品特性進(jìn)行檢測，特別是通過測試、對比，可以準(zhǔn)確了解復(fù)合酶制劑的組配、及其與底物混合后的加工特性，從而作為針對性地設(shè)計和篩選飼料用復(fù)合酶組合的科學(xué)依據(jù)，達(dá)到節(jié)約生物酶材料、提高飼料利潤率的目的。
圖1是本發(fā)明實施例1提供的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法的流程圖；圖2是本發(fā)明實施例1中，溫度對木聚糖酶活性的影響圖。
圖3pH對木聚糖酶活性影響圖；圖4底物濃度對木聚糖酶活性的影響；圖5是經(jīng)不同溫度處理后木聚糖酶活性存留情況圖；圖6是木聚糖酶貯存期間酶活存留情況圖；圖7是木聚糖酶在不同加工階段酶活變化情況圖；圖8是本發(fā)明實施例2中，溫度對蛋白酶活性的影響圖；圖9是pH對中性蛋白酶活性的影響圖；圖10是底物濃度對中性蛋白酶活性的影響圖；圖11是中性蛋白酶經(jīng)不同溫度處理后酶活變化圖；圖12是中性蛋白酶貯存期間酶活存留情況圖；圖13是加工工藝對中性蛋白酶活性的影響圖。
具體實施例方式
參見圖1，本發(fā)明提供的通用飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其流程包括如下步驟1)測試擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑的特性，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；2)將擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑中的兩種或多種進(jìn)行分組后混合，測試該組配后該各單酶活性、能量及蛋白價值的變化，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；3)比較步驟1)及2)的結(jié)果，選擇相對特性數(shù)值變化小的組配，將其加入到不同底物中測試，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；4)變換底物的濃度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；5)采用圖表對比法比較步驟1)～4)的測試結(jié)果，選擇適合加工的單酶制劑、組配及其濃度。
前述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，所述的步驟1)，還包括如下步驟11)制備單酶溶液；12)測試并記錄單酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；13)測試并記錄單酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；14)測試并記錄底物濃度變化對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；15)測試并記錄加工工藝對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟12)～15)的順序不分先后。
前述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，所述的步驟2)，還可以包括如下步驟21)測試并記錄該組配酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；22)測試并記錄該組配酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；23)測試并記錄底物濃度變化對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；24)測試并記錄加工工藝對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟21)～24)的順序不分先后。
其優(yōu)選的實施例1參見圖2～圖7，提供一種禽(雞、鴨等)用系列復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其包括如下步驟1)測試擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑的特性，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表，本實施例中，擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑包括蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶。
2)將擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑中，即蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶中的兩種或多種進(jìn)行分組后混合，分別測試該組配后該各單酶活性、能量及蛋白價值的變化，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；3)比較步驟1)及2)的結(jié)果，選擇相對特性數(shù)值變化小的組配，本實施例中為蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶兩兩之間的組配，將其加入到不同底物中測試，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；參見表1，本實施例中，底物分別為玉米型日糧、玉米型日糧(高濃度)、小麥型日糧、小麥型日糧(高濃度)、小麥/玉米混合型日糧、小麥/玉米混合型日糧(高濃度)。
4)變換底物的濃度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；5)采用圖表對比法比較步驟1)～4)的測試結(jié)果，選擇適合加工的單酶制劑、組配及其濃度，本實施例中優(yōu)選的單酶制劑、組配結(jié)果為蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶，如表2所示。
前述的步驟1)，還包括如下步驟11)制備蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的單酶溶液；12)測試并記錄前述各單酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；
13)測試并記錄前述各單酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；14)測試并記錄底物濃度變化對前述各單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；15)測試并記錄加工工藝對前述各單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟12)～15)的順序不分先后。
前述的步驟2)，還可以包括如下步驟21)測試并記錄該蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶中的兩種或多種組配酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；22)測試并記錄前述各組配酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；23)測試并記錄底物濃度變化對前述各組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；24)測試并記錄加工工藝對前述各組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟21)～24)的順序不分先后。
表1產(chǎn)品名稱、產(chǎn)品代號、適用動物及生長階段
表2禽用復(fù)合酶制劑系列產(chǎn)品酶組配及其酶活性指標(biāo)單位U/g
注表4中蛋白酶活性系酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性之和。
本實施例所使用的內(nèi)切阿拉伯木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是由Trichoderma longibrachiatum經(jīng)液體深層發(fā)酵，分離、提純、濃縮、干燥后制成的飼料專用單酶制品。為了更有效地應(yīng)用該木聚糖酶，現(xiàn)分別對其pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、底物濃度等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。
首先制備待測內(nèi)切阿拉伯木聚糖酶溶液，然后進(jìn)行下列測試并記錄測試結(jié)果、繪制圖表。
首先測試并記錄該單酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表，所得圖表見附圖2。經(jīng)測試，溫度對酶反應(yīng)速度有很大的影響，并且每種酶都有自己的最適溫度。因此，在不同溫度(20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃和90℃)其它條件相同的情況下(pH5.3、底物濃度1％)，測定木聚糖酶的活性。
由圖2看到木聚糖酶在不同的反應(yīng)溫度下測定的酶活，其活性變化較大，40℃時酶活大于82％，在30℃時酶活仍然大于55％，反應(yīng)溫度在高于60℃后，酶活急劇下降，在60℃到70℃之間酶活從94％下降到60％，這說明，木聚糖酶的活性對反應(yīng)溫度的變化有些敏感。因此，此產(chǎn)品提供的酶活的最適范圍溫度在40～60℃間，最佳反應(yīng)溫度為55℃，本試驗的測定結(jié)果基本反應(yīng)了此產(chǎn)品的的酶活隨溫度變化的特性。
在實際應(yīng)用中，由于動物胃腸道內(nèi)的溫度在38～40℃間，從結(jié)果來看，此時木聚糖酶活性在80％左右。一方面，雖然動物胃腸道內(nèi)酶的作用效果可因酶的作用時間較長從而可彌補酶活低的不足，另一方面，可以通過適當(dāng)提高木聚糖酶在飼料中的添加量來解決這一問題。
再來測試pH對木聚糖酶活性的影響pH也對酶反應(yīng)速度有很大影響。分別將底物和對應(yīng)的緩沖稀釋液的pH調(diào)整到3.0、4.0、5.0、5.3、6.0、6.5、7.0、8.0和9.0，然后在其它條件相同的情況下(溫度55℃、底物濃度1％)分別測其酶活，所得圖表見附圖3。
由圖3看出，木聚糖酶在pH＝4～6之間保持較高的活性，平均90％以上，在之外的范圍酶活急劇下降，pH＝4的時候，酶活接近80％，但pH＝3時酶活僅為15％，在pH＝6.5時，酶活為55％，在pH＝7時，酶活為23％左右，當(dāng)pH＝9時，基本上檢不出酶的活性。
此酶的酶活最適的pH范圍在4～6之間，最佳反應(yīng)pH的為5.3，本試驗的測定結(jié)果反應(yīng)了此酶的酶活隨pH變化的特性，說明此酶在偏酸性的條件下有較好的表現(xiàn)。在實際應(yīng)用中，由于動物胃腸道內(nèi)的pH偏酸性，所以此木聚糖酶在動物胃腸道內(nèi)的條件下能夠發(fā)揮較好的作用。
第三步測試底物濃度對木聚糖酶活性的影響將木聚糖底物分別配制成0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％五個濃度，在保證底物過飽和其它條件相同的情況下(溫度55℃、pH5.3)，加入相應(yīng)量的酶稀釋液測定酶活，所得圖表見附圖4。
由圖4可以看出，木聚糖酶的活性隨底物濃度的提高活性逐漸增強，在底物濃度達(dá)到0.6％(相當(dāng)于最高活性時底物濃度的60％)時，木聚糖酶的活性基本穩(wěn)定，并接近了酶活的最高值。這說明，木聚糖酶實際應(yīng)用中，底物濃度較低時就有可能發(fā)揮出最高的活性。
第四步測試經(jīng)不同溫度加工處理后酶活存留情況將固體木聚糖酶在從55℃～100℃(水分含量≤8％)，每間隔5℃的條件下分別處理5分鐘，然后測定(pH5.3、溫度55℃、底物濃度1％)其酶活，所得圖表見附圖5。
由圖5可以看到，木聚糖酶在干燥的狀態(tài)下經(jīng)過累積溫度處理后，在不同溫度下的酶活表現(xiàn)是先升高后下降，在70℃以前木聚糖酶的活性基本沒有損失，70℃以后酶活開始損失，到85℃時酶活存留大于88％，100℃時酶活存留在75％左右。酶活在60-70℃間有升高的現(xiàn)象待進(jìn)一步驗證。
第五步測試其它酶制劑相互混合后對木聚糖酶的影響將木聚糖酶(X1222)分別與蛋白酶(P1222)和淀粉酶(A1222)按表1體積比混合后，常溫下放置一個月后測定(pH5.3、溫度55℃、底物濃度1％)其中木聚糖酶活性，結(jié)果表明蛋白酶和淀粉酶對木聚糖酶的活性并無影響。測試木聚糖酶在貯存期間酶活存留情況將固體木聚糖酶產(chǎn)品(水分含量≤8％)常溫下保存，然后每隔兩個月取樣測定(pH5.3、溫度55℃、底物濃度1％)其酶活，結(jié)果如圖6。
由圖6可看出，木聚糖酶在一年內(nèi)酶活下降不到15％，尤其在前4個月內(nèi)，酶活下降緩慢不到7.0％，隨著時間的延長，酶活會逐漸下降，但速度較平緩。
表1其它酶制劑與木聚糖酶混合后木聚糖酶活性表
注1、表中X1222為固體木聚糖酶，P1222為固體蛋白酶，A1222為固體淀粉酶。2、水分含量小于8％。
第六步測試加工工藝對木聚糖酶活性的影響按照設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)將1.0公斤活性為25,000U/g的木聚糖酶按1kg/噸的添加量加入小豬飼料后制粒，制粒的條件及溫度(75℃左右)與商業(yè)飼料廠一致，在不同生產(chǎn)階段(混合后、調(diào)制后、制粒后及打包口)分別取樣并測定(pH5.3、溫度55℃、底物濃度1％)木聚糖酶的活性，其測試結(jié)果見圖7。
該木聚糖酶與飼料原料混合后其活性與設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)相比有明顯的下降，只有45％的活性保留下來，但此時并沒有經(jīng)過高溫及壓力的處理，說明此木聚糖酶與飼料混合后有55％的活性是在實驗室的條件下不能檢出的。經(jīng)過高溫(75℃左右)調(diào)制后，與設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)相比，此木聚糖酶在飼料中的活性保留率只有37％左右，下降幅度較大，但與混合后相比，此木聚糖酶的活性保留率為82％(45.2對37.2％)，下降幅度僅為18％左右，說明高溫(75℃左右)調(diào)制對此木聚糖酶的影響不大。制粒過程是高溫及壓力的結(jié)合，此過程對一般的木聚糖酶的活性影響巨大，但此木聚糖酶經(jīng)過高溫及高壓的制粒過程后，與調(diào)制后相比，酶活的保留率僅下降了12％左右(37.2對32.8％)，與混合后相比，酶活在飼料中的保留率也只下降了27％左右(45.2對32.8％)。打包口的酶活保留率與制粒后的保留率基本一致(32.8對33.5％)。
采用圖表對比法進(jìn)行對比圖2～圖7分析，說明本實驗飼料加工過程中的高溫及高壓的制粒過程對該木聚糖酶的影響是有限的，整個調(diào)制、制粒過程對此木聚糖酶酶活保留率的影響不大于26％(45.2對33.5％)，但此木聚糖酶與飼料原料混合的過程會影響在實驗室用現(xiàn)有的方法測定酶活保留率(100對45.2％)，影響酶活測定的原因有諸多，如金屬離子的干擾、酶與底物的作用、測定方法的靈敏度等因素。
最后分別對圖2～圖7進(jìn)行兩兩或多幅對比分析阿拉伯木聚糖酶的綜合特性；本發(fā)明實施例1所使用的內(nèi)切阿拉伯木聚糖酶(EC 3.2.1.8)的酶學(xué)特性具有以下特點(1)酶活反應(yīng)的最適溫度在40～60℃間，最佳溫度為55℃，在實際應(yīng)用中，由于動物胃腸道內(nèi)的溫度在38～40℃間，從結(jié)果來看，此時木聚糖酶活性在80％左右；(2)pH在4～6之間，酶活平均在90％以上，最佳反應(yīng)pH為5.3，在實際應(yīng)用中，由于動物胃腸道內(nèi)的pH偏酸性，所以此酶在動物胃腸道內(nèi)能夠發(fā)揮較好的作用；(3)酶的活性在底物濃度達(dá)到0.6％時活性已基本穩(wěn)定，并接近最高值，說明此酶在底物濃度較低時就可能發(fā)揮出最高的活性；(4)此酶在干燥的狀態(tài)下經(jīng)過累積溫度處理后，在70℃以前活性沒有損失，到85℃時酶活存留大于88％，100℃時酶活存留在75％左右；(5)此木聚糖酶與蛋白酶和淀粉酶按比例混合后儲存，測其樣品中的木聚糖酶活性，結(jié)果表明蛋白酶和淀粉酶對木聚糖酶的活性沒有影響；(6)在室溫條件下儲存半年，其酶活比較穩(wěn)定，但隨著時間的延長，酶活會逐漸下降，酶活平均月下降率為7.3％；(7)此木聚糖酶與飼料原料混合后其活性有明顯的下降(100對45.2％)，但飼料加工過程中的制粒過程對該酶酶活的影響有限(45.2對33.5％)，說明此木聚糖酶具有耐高溫抗高壓，并能在體溫下良好發(fā)揮作用等特點。影響酶活測定的原因有諸多，如金屬離子的干擾、酶與底物的作用、測定方法的靈敏度等因素。
再提供本實施例中采用的中性蛋白酶的加工特性的測試方法。
首先測試溫度對中性蛋白酶活性的影響分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃和80℃，而其它條件相同(pH7.5、底物濃度1％)的情況下測中性蛋白酶的酶活，結(jié)果作圖如圖8所示。
由圖8看出，中性蛋白酶的隨反應(yīng)溫度的變化其酶活變化較大，反應(yīng)溫度在40℃左右時，酶活表現(xiàn)最好，反應(yīng)溫度在35～45℃之間酶活表現(xiàn)達(dá)到了90％左右，反應(yīng)溫度超過50℃后，其酶活呈現(xiàn)直線下降趨勢，且下降幅度較大。這說明，此中性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度在35～45℃之間，且反應(yīng)活性對反應(yīng)溫度的變化較為敏感。
其次測試pH對中性蛋白酶活性的影響分別配制pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0和9.0的底物及相應(yīng)的緩沖液，在其它條件相同(溫度40℃、底物濃度1％)的情況下分別測定中性蛋白酶的活性，其結(jié)果如圖9所示。
由圖9看出，中性蛋白酶的活性在pH＝5～8間較好，pH＝6～7.5間最好。pH≤4時，中性蛋白酶活下降較快，pH≤3時已檢測不出酶的活性。因此，此中性蛋白酶的最適pH為6～7.5。
第三步測試底物濃度對蛋白酶活性的影響將底物酪素分別配制成0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％五個濃度，在保證底物過飽和并且其它條件相同的情況下(pH7.5、溫度40℃)，加入酶稀釋液測定酶活；測試結(jié)果如圖10所示。
由圖10看出，蛋白酶的活性隨著底物濃度的升高逐漸增強，在底物濃度為0.4％時活性就已達(dá)到了最高活性的80％，0.6％時就基本接近了最高活性，這說明蛋白酶對底物的濃度比較敏感，在較低的濃度下就可以表現(xiàn)現(xiàn)較高的活性。
第四步測試經(jīng)不同溫度處理后中性蛋白酶活存留情況將固體蛋白酶(水分含量≤8％)從55℃～100℃，每間隔5℃的條件下分別處理5分鐘后，測定(pH7.5、溫度40℃、底物濃度1％)其酶活，結(jié)果如圖11所示。
由圖11可以看到，中性蛋白酶分別經(jīng)過55℃到90℃處理后，酶活均處于較穩(wěn)定狀態(tài)，平均酶活在90％以上，90℃以后才急劇下降，酶活降到20％左右。
第五步測試中性蛋白酶在貯存期間酶活存留情況將固體中性蛋白酶產(chǎn)品(水分含量≤8％)常溫下保存，然后每隔兩個月取樣測定(pH7.5、溫度40℃、底物濃度1％)其酶活，結(jié)果如圖12所示，中性蛋白酶產(chǎn)品在貯存的前6個月內(nèi)酶活下降非常少，不到5％；隨著時間延長酶活會逐漸降低，一年左右酶活下降約10％。說明此中性蛋白酶在常溫下非常穩(wěn)定。
第六步測試加工工藝對中性蛋白酶活性的影響按照設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)，將2.5千克活性為40，000U/g的中性蛋白酶按2.5kg/噸的添加量加入小豬飼料后制粒，制粒的條件及溫度(75℃左右)與商業(yè)飼料廠一致，在不同生產(chǎn)階段(混合后、調(diào)制后、制粒后及打包口)分別取樣并測定(pH7.5、溫度40℃、底物濃度1％)中性蛋白酶的活性，其結(jié)果見圖13。
與前述木聚糖酶有相似的結(jié)果，采用圖表對比法對比圖8與圖13，此中性蛋白酶與飼料原料混合后其活性與設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)相比有明顯的下降(100對65％)，在實驗室的條件下，此中性蛋白酶只有65％的活性能測定，即在沒有經(jīng)過高溫及壓力處理的情況下，45％的酶活已測不到，說明混合過程會影響酶活的測定，影響酶活測定的原因有很多，未來應(yīng)注重這方面的研究。經(jīng)過高溫調(diào)制后，與設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)相比，此中性蛋白酶在飼料中的活性保留率只有47％左右，下降幅度較大，但與混合后相比，此中性蛋白酶的活性保留率為68％(65對47％)，下降幅度為30％左右，說明高溫調(diào)制對此中性蛋白酶的一定的影響，但不大。此中性蛋白酶經(jīng)過高溫及高壓的制粒過程后，與調(diào)制后相比，酶活的保留率僅下降了19％左右(47對38％)，與混合后相比，酶活在飼料中的保留率也只下降了41％左右(65對38％)。打包口的酶活保留率與制粒后的保留率都為38％。
本實驗說明飼料加工過程中的高溫及高壓的制粒過程對該中性蛋白酶的影響是有限的，整個調(diào)制、制粒過程對此中性蛋白酶活保留率的影響在40％左右，但此中性蛋白酶與飼料原料混合的過程會影響酶活保留率。
最后分別對圖8～圖13進(jìn)行兩兩或多幅對比分析中性蛋白酶酶學(xué)特性，可以得到如下總結(jié)本實施例使用的內(nèi)切中性蛋白酶(EC 3.4.21.62)的酶學(xué)特性具有以下特點(1)此酶酶活隨反應(yīng)溫度的變化而變化，在40℃時，酶活表現(xiàn)最好，在35-45℃間酶活表現(xiàn)可達(dá)90％左右，說明此酶在動物胃腸道內(nèi)的溫度下能表現(xiàn)良好；(2)中性蛋白酶的活性在pH＝5～8間較好，pH＝6～7.5間最好。pH≤4時，中性蛋白酶活下降較快，此酶在偏酸性由于動物胃腸道內(nèi)能夠發(fā)揮較好的作用；(3)此酶在底物濃度為0.4％時即可達(dá)到最高活性的80％，0.6％時接近最高活性，說明此酶對底物的濃度比較敏感，在較低的濃度下可以表現(xiàn)較高的活性；(4)中性蛋白酶在干燥的狀態(tài)下分別經(jīng)過55℃到90℃處理后，平均酶活在90％以上，90℃以后急劇下降，90℃時酶活降底到20％左右；(5)中性蛋白酶在常溫下貯存非常穩(wěn)定，前3個月酶活下降不到5％；半年后酶活的保存率仍大于65％；(6)與木聚糖酶的結(jié)果相似，此酶與飼料混合后其活性有明顯的下降(100對65％)，即在沒有經(jīng)過高溫及壓力處理的情況下，35％的酶活已測不到，說明混合過程會影響酶活的測定。經(jīng)過高溫調(diào)制后，與混合后相比，此酶的活性保留率為72％(65對47％)，經(jīng)過高溫高壓制粒后，酶活在飼料中的保留率在60％左右(65對38％)。高溫高壓的制粒加工過程對該酶酶活的影響有限，說明此酶具有耐高溫抗高壓，并能在體溫下良好發(fā)揮作用等特點。
綜上所述，內(nèi)切阿拉伯木聚糖酶和內(nèi)切中性蛋白酶具有活性高，抗逆性強，底物專一性等特點，是符合飼料專用單酶要求的制品。
對本實施例中α-淀粉酶及其他單酶的測定，及對木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶等組配后的加工特性的測定，與對木聚糖酶單酶的測定方法相似。
實施例2提供一種畜(豬等)用系列復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其基本步驟與實施例1相同，其不同之處在于，其底物的選擇如表3所示，其選擇的適合加工的單酶制劑、組配結(jié)果為蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶及β-葡聚糖酶，如表4所示。
表3產(chǎn)品名稱、產(chǎn)品代號、適用動物及生長階段
表4豬用系列酶制劑產(chǎn)品酶活性指標(biāo)單位U/g
注表5中蛋白酶活性系酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性之和。
實施例3供一種水產(chǎn)(魚、蝦等)系列復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其基本步驟與實施例1及2相同，其不同之處在于，其底物的選擇如表5所示，其選擇的適合加工的單酶制劑、組配結(jié)果為蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶及β-葡聚糖酶，如表6所示。
表5產(chǎn)品名稱、產(chǎn)品代號、適用動物及生長階段
表6水產(chǎn)類飼用酶制劑系列產(chǎn)品酶活性指標(biāo)單位U/g
注表2中蛋白酶活性系酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性之和如本發(fā)明上述實施例所述的相同或近似方法，而的得到的其他復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，及采用本發(fā)明相同或近似方法的直接啟示所得到其他復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其特征在于，其包括如下步驟1)測試擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑的特性，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；2)將擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑中的兩種或多種進(jìn)行分組后混合，測試該組配后該各單酶活性、能量及蛋白價值的變化，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；3)比較步驟1)及2)的結(jié)果，選擇相對特性數(shù)值變化較小的組配，將其加入到不同底物中測試，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；4)變換底物的濃度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；5)采用圖表對比法比較步驟1)～4)的測試結(jié)果，選擇適合加工的單酶制劑、組配及其濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其特征在于，所述的步驟1)，還包括如下步驟11)制備單酶溶液；12)測試并記錄單酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；13)測試并記錄單酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；14)測試并記錄底物濃度變化對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；15)測試并記錄加工工藝對單酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟12)～15)的順序不分先后。
3.如權(quán)利要求1或2所述的飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其特征在于，所述的步驟2)，還包括如下步驟21)測試并記錄該組配酶溶液的熱穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；22)測試并記錄該組配酶溶液的PH穩(wěn)定性，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；23)測試并記錄底物濃度變化對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；24)測試并記錄加工工藝對該組配酶活性的影響，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；所述步驟21)～24)的順序不分先后。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種飼用復(fù)合酶制劑酶加工特性的測定方法，其包括如下步驟1)測試擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑的特性，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；2)將擬組成復(fù)合酶的各單酶制劑中的兩種或多種進(jìn)行分組后混合，測試該組配后該各單酶活性、能量及蛋白價值的變化，根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；3)比較步驟1)及2)的結(jié)果，選擇相對特性數(shù)值變化較小的組配，將其加入到不同底物中測試，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；4)變換底物的濃度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制圖表；5)采用圖表對比法比較步驟1)～4)的測試結(jié)果，選擇適合加工的單酶制劑、組配及其濃度。本發(fā)明主要用來優(yōu)化篩選復(fù)合酶制劑，為畜禽、魚蝦等飼料用復(fù)合酶制劑配方及其生產(chǎn)提供科學(xué)有效的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/25GK1974787SQ200610123888
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日
發(fā)明者于鋒, 段紅偉 申請人:東莞泛亞太生物科技有限公司