專利名稱：重組畢赤酵母及其表達ngal蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及NGAL蛋白，特別是涉及重組畢赤酵母及其表達NGAL蛋白的方法。
背景技術：
中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin，NGAL)由Kjeldsen等人于1993年在中性粒細胞內發現的，是一種25kD的糖蛋白。它具有lipocalin家族的典型β-折疊桶結構，與炎癥、胚胎發育、免疫應答、趨化作用、信號轉導以及多種腫瘤的發生與發展等過程密切相關。NGAL可參與細胞分化且作為一種存活因子抑制細胞凋亡；在人類腫瘤中如肺腺癌、食管癌、胰腺癌、結腸癌和乳腺癌中可見NGAL高表達，并且NGAL蛋白可通過保護MMP-9的活性而促進腫瘤細胞的侵襲。近年來又研究證明，NGAL作為小分子鐵配合物結合蛋白直接參與了機體鐵代謝和天然免疫反應等功能(Goetz DH，2002；Yang J，2002)，與腎缺血，腎毒性損傷以及動脈粥樣硬化(Forsblad J，2002；Hemdahl AL，2006)等疾病的發生發展密切相關，且作為一種早期標志物幫助判定缺血性腎損傷程度(Mishra J，2003；Mishra J，2005)。因此，制備重組NGAL蛋白對深入研究NGAL的功能及其臨床診斷的應用具有重要的意義。
NGAL基因是單拷貝基因，定位于染色體9q34。NGAL基因的全長5869bp，其中包括1695bp的5′端非轉錄區，178bp的3′端非轉錄區及由七個外顯子和六個內含子構成的3696bp的原初轉錄區。其cDNA全序列由63bp的5′端非翻譯區和591bp的編碼區組成，編碼含197個氨基酸殘基的肽鏈，此肽鏈包括178個氨基酸殘基的成熟肽段和19個氨基酸的信號肽序列。目前，重組NGAL蛋白主要是通過大腸桿菌融合表達并進行親和層析純化而獲得(Bundgaard，1994)。該表達系統存在的主要問題是沒有翻譯后的修飾功能，而人NGAL是糖基化25kD蛋白。因此，用原核表達系統獲得的重組NGAL蛋白來研究人NGAL功能，尚存在明顯缺陷。
發明內容
本發明的目的在于克服現有原核表達NGAL蛋白方法上存在的問題，提供一種能高效表達NGAL蛋白的重組畢赤酵母。
本發明的另一個目的在于提供上述重組畢赤酵母表達NGAL蛋白的方法。
1、重組畢赤酵母的構建與高效轉化菌株的篩選(1)根據基因結構設計引物，擴增NGAL cDNA片段。然后，將擴增片段與pPIC9空載體連接，構建表達載體pPIC9-NGAL，轉化大腸桿菌后提取質粒進行雙酶切鑒定。采用雙脫氧末端終止法對pPIC9-NGAL陽性重組子進行測序(上海基康公司)，并將測序結果用BLAST程序與NCBI核酸數據庫進行序列比對，確認是NGAL編碼區且無突變。酶切pPIC9-NGAL質粒，使之線性化后，轉化畢赤酵母。
(2)鋪MM與MD平板進行篩選，采用菌落PCR鑒定重組克隆。最后，將NGAL重組酵母菌株在液體培養基中培養，甲醇誘導表達，用已知濃度的原核表達NGAL蛋白為參照物，通過對發酵液進行SDS-PAGE電泳及western blotting篩選出高效表達NGAL蛋白的酵母菌株。
2、重組畢赤酵母誘導表達NGAL與純化(1)將高效NGAL重組菌株在BMGY培養基中擴大培養，甲醇誘導，使其分泌NGAL蛋白；離心收集發酵液。
(2)往發酵液中加入硫酸銨沉淀重組NGAL蛋白；PBS透析除鹽后，陽離子交換層析純化，陽離子交換層析的固定相為SP-SepharoseFast Flow；線性梯度洗脫A液為25mM PB，pH5.8，B液為1M NaCl；流速為1.5ml/min。洗脫組分經超濾柱脫鹽后，分裝，儲存于-80℃。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明通過PCR擴增、連接、轉化與篩選，最終獲得高效表達NGAL蛋白的重組畢赤酵母菌株。該菌株能將目標蛋白分泌到培養基中，可達＞100mg/L，而且無雜蛋白。這使得接續下來的純化工藝變得十分簡單且成本低發酵液經硫酸銨沉淀、脫鹽、陽離子交換層析即可。所得蛋白優于原核表達蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及臨床NGAL檢測的標準蛋白。
圖1為pPIC9載體結構圖；
圖2為瓊脂糖凝膠電泳鑒定NGAL基因PCR產物電泳圖；圖3為瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達載體pPIC9-NGAL的電泳圖；圖4為PCR鑒定重組酵母克隆的電泳圖；圖5為western blotting檢測發酵上清中NGAL蛋白的表達電泳圖；圖6為western blotting評估發酵上清中NGAL蛋白表達產量的電泳圖；圖7為陽離子交換層析梯度洗脫記錄圖；圖8為SDS-PAGE電泳檢測陽離子交換層析后的目標蛋白電泳圖。
其中，圖2中，1，100bp DNA ladder；2，PCR產物。圖3中，1，100bp DNA ladder；2，pPIC9-NGAL/XhoI+EcoRI；3，λDNA/EcoRI+HindIII DNAmarker。圖4中，1，100bp DNA ladder；2-9，1-8號克隆。
圖5中，1，2ng/μl原核表達NGAL蛋白；2-9，1-8號克隆發酵上清。
圖6中，1-7，1/258、1/128、1/64、1/32、1/16和1/4稀釋的樣品；8-9，1ng/μl和2ng/μl原核表達的NGAL蛋白。圖8中，Y，層析樣品原液；26-34，洗脫峰各管。
具體實施例方式
實施例1重組畢赤酵母的構建1.擴增NGAL cDNA片段以pGEX-NGAL為模板，除去了信號肽序列的NGAL編碼區用下列引物擴增P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’；P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’。PCR引物兩端分別引入XhoI和EcoRI酶切位點(下劃線標記)，而且產物的5′端引入了畢赤酵母內切肽酶KEX2的酶切序列Glu-Ala-Arg*。25μl的PCR反應體系成分為2×PCR mix 12.5μl，pGEX-NGAL 1μl，P1(12.5 μM)1μl，P2(12.5μM)1μl，PCR water 9.5μl。PCR反應條件是95℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30個循環；72℃5min。反應結束后用1％的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，見圖22.構建重組pPIC9-NGAL表達載體取經過XhoI和EcoRI雙酶切的NGAL cDNA PCR產物和線型pPIC9空載體(見圖1)的連接反應PCR產物3μl，pPIC9空載體1μl，2×ligation buffer 5μl，T4 ligase 1μl。混勻后室溫下連接1h，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞和鋪LB(Amp+)板。次日挑取單克隆接種于2ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養液中，37℃振蕩培養(250rpm/min)14h。堿裂解法提取質粒并進行XhoI和EcoRI雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組表達載體pPIC9-NGAL，見圖3。所獲得的pPIC9-NGAL重組子進行測序，并進行BLAST分析，確認序列的正確性。
3.pPIC9-NGAL質粒轉化畢赤酵母pPIC9-NGAL質粒分別用SacI、SalI和BglII酶進行酶切使之線性化，并用瓊脂糖凝膠電泳回收，備用。然后，從YPD平板上挑畢赤酵母單克隆于10ml的YPD培養基中30℃搖床振蕩培養約16h，當其OD600值＞0.6時，室溫2,000g離心5min收集菌體；用4ml無菌水重懸菌體，室溫1,500 g離心10min，去除無菌水，重復洗滌一次；加160μl 0.1M LiCl重懸菌體，室溫下14,000rpm離心15s；去除上清，加64μl 0.1M LiCl重懸菌體，取21μl分裝到1.5ml的離心管中，此為制備好的酵母感受態細胞。最后，取6μl鮭魚精DNA(10μg/μl)沸水煮5min后，馬上置于冰上，以制備擔體DNA；室溫下8,000rpm將上述酵母感受態細胞離心1min收集菌體；每個離心管按順序加入以下物品50％PEG3350 96μl，1M LiCl 14.4μl，鮭魚精DNA2μl，線性化pPIC9-NGAL0.74-0.9μg于50μl的無菌水中；劇烈渦旋和移液器打散至液體充分混勻；30℃水浴孵育30min；42℃熱休克25min；8,000rpm離心1min收集菌體；400μl無菌水重懸菌體，分別取100μl或200μl鋪于RDB平板；平板倒置培養于30℃恒溫培養箱中，培養2-4天。PCR鑒定重組畢赤酵母，見圖4。
4.篩選高效表達的重組畢赤酵母用滅菌牙簽挑取RDB平板上的單克隆依次分別接種于MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)和MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)平板上，再將牙簽置于裝有5ml BMGY培養液的50ml離心管中于30℃250rpm振蕩培養。上述兩種平板倒置培養于30℃恒溫培養箱中，培養2-4天。對于BMGY培養菌液，則在24h后先取1ml菌液測其OD600，并且8,000rpm離心1min收集菌體，加500μl PBS重懸菌體，2,500g離心3min，棄上清，加100μlTE重懸菌體，沸水煮10min，馬上置于-70℃冷凍30min，取出放于沸水再煮10min，1,500g離心5min，取上清為模板進行PCR反應。25μl的PCR反應體系成分為2×PCR mix12.5μl；酵母裂解上清1μl；P1(12.5μM)1μl；P2(12.5μM)1μl；無菌水9.5μl。PCR反應條件同上。反應結束后，取5μl PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后，剩下的菌液繼續振蕩培養，并每隔24h加入終濃度為1％的甲醇進行誘導，120h后，菌液2,500g離心5min，收集上清，取5μl進行western blotting檢測NGAL的表達水平，鑒定出高表達菌株，見圖5和圖6。
實施例2重組畢赤酵母表達生產NGAL及NGAL的純化1.從上述MD平板挑取經western blotting鑒定為高表達的重組克隆接種于BMGY培養基中30℃，250-300rpm/min培養，當OD600＞2.0時，25℃下2000g，5min離心，棄上清，加入BMMY培養基稀釋至OD600為1，30℃，250-300rpm/min繼續培養，每隔24h加入終濃度為1％的甲醇進行誘導，120h后，25℃，5000g，10min離心，收上清。
2.NGAL蛋白純化將發酵上清液按5g/10ml加入硫酸銨固體，搖動使充分溶解，4℃靜置過夜。然后4℃下10,000g離心10min，小心棄上清。將沉淀用25mM PB(pH＝5.8)溶解后，在25mM PB(pH＝5.8)中透析48h，其間換液三次。所得樣品按如下步驟進行SP-Sepharose fast flow陽離子交換A.預處理Sepharose。取25ml SP-Sepharose fast flow傾去上層20％乙醇液，加50ml 25mMPB(pH＝5.8)，攪勻，傾去上層液。再用10ml25mMPB(pH＝5.8)洗兩次。加7ml 25mMPB(pH＝5.8)，混勻。
B.裝柱。關閉下端，柱內留5ml 25mMPB(pH＝5.8)，沿柱壁加入膠漿液，完畢后，用25mMPB(pH＝5.8)加滿柱子，打開下端出口，以400cm/h的流速裝柱。待柱高固定后，跑柱60ml.檢查流出液pH值是否與加入時一樣(若不同，繼續跑柱至pH值一樣)C.上樣。打開柱蓋，讓柱中緩沖溶液流至接近柱床平面時(二者相差約1mm)，加入樣品溶液。加壓使樣品液進入柱床中，此時加滿緩沖溶液，蓋緊柱蓋，即可跑柱。
D.洗柱。25mMPB(pH＝5.8)洗柱，流速1.5ml/min，每管2min收集，至基線水平。
E.1MNaCl梯度洗脫。A液25mMPB(pH＝5.8)，B液1MNaCl。流速1.5ml/min，每管2min收集。
F.取洗脫峰樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色鑒定目標蛋白，并合并目標蛋白。陽離子交換層析洗脫記錄，見圖7。
G除鹽。將層析得到的純化蛋白移入Ultra-15 5K中，4℃下4000g離心20min。然后用PBS(pH 7.4)洗三次，每次10min。取出截留液，稀釋至一定體積，Bradford法測蛋白含量，分裝后，置于-80℃保存。SDS-PAGE電泳檢測離子交換層析后的目標蛋白見圖8。
權利要求
1.一種重組畢赤酵母，其特征在于由如下方法制備而成(1)PCR擴增NGAL的cDNA；(2)PCR產物與載體pPIC9連接，構建重組質粒pPIC9-NGAL；(3)重組質粒pPIC9-NGAL轉化畢赤酵母，得到重組畢赤酵母。
2.如權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述NGAL為人源NGAL。
3.如權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于所述PCR擴增的引物為P15’-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA-3’，P25’-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC-3’；模板為pGEX-NGAL。
4.一種利用權利要求1所述的重組畢赤酵母表達生產NGAL蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟(1)篩選高效表達NGAL蛋白的重組畢赤酵母；(2)將高效表達的重組畢赤酵母用BMGY培養基培養，用甲醇誘導培養獲得含有NGAL蛋白的發酵液；(3)往發酵液中加入硫酸銨，沉淀，收集沉淀物；(4)透析除鹽；(5)陽離子交換層析。
5.如權利要求4所述的表達方法，其特征在于所述陽離子交換層析的固定相為SP-Sepharose Fast Flow；線性梯度洗脫A液為25mMPB，pH5.8，B液為1M NaCl；流速為1.5ml/min。
全文摘要
本發明涉及NGAL蛋白，公開了重組畢赤酵母及其表達NGAL蛋白的方法。本發明通過PCR擴增、連接、轉化與篩選，最終獲得高效表達NGAL蛋白的重組畢赤酵母菌株。該菌株能將目標蛋白分泌到培養基中，可達＞100mg/L，而且無雜蛋白。這使得接續下來的純化工藝變得十分簡單發酵液經硫酸銨沉淀、脫鹽、陽離子交換層析即可。所得蛋白優于原核表達蛋白，糖基化完整，可用于人NGAL功能研究以及臨床NGAL檢測的標準蛋白。
文檔編號C12N15/12GK1978632SQ20061012367
公開日2007年6月13日 申請日期2006年11月21日 優先權日2006年11月21日
發明者李恩民, 張丕顯, 吳炳禮, 杜則澎, 許麗艷 申請人:汕頭大學醫學院