專利名稱：一種生產植酸酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產植酸酶的方法，尤其涉及一種利用黃藍狀菌生產植酸酶的方法。
背景技術：
植酸酶(phytase)，是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，系統名稱為肌醇六磷酸酶，屬于磷酸單脂水解酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，即可將植酸鈣鎂水解產生磷酸鹽的酶。植酸酶廣泛存在于自然界中，在動物、植物、微生物中均有發現。最早是在植物中發現的，在植物組織如谷物、豆類、蔬菜，特別是萌發的種子和花粉中都發現了植酸酶活力并對其特性進行了研究，可是研究發現植物產植酸酶酶活較低，而且在加工、貯存等因素極易遭到破壞，提取困難，酶學特性等方面也不適于應用；在動物組織中由于植酸酶抑制劑存在使得觀察該酶存在困難。所以真正具有開發價值的僅限于利用微生物發酵生產的植酸酶。
植酸酶是一種新型的食品添加劑，它能夠降解食物中的植酸而提高食物中磷、鋅、鐵等的吸收率。目前國外已開始將植酸酶作為飼料添加劑提高植物飼料中磷的利用率，并用食品級植酸酶處理糧食，提高食品的生理功能和營業價值。近年來，在我國植酸酶的應用日趨廣泛。其主要應用在飼料上，在植物來源的動物飼料中，大部分磷酸鹽是以植酸的形式存在的。而單胃動物例如豬和家禽缺少分解植酸的酶。在動物飼料中添加植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用度，也減少了動物飼料中無機磷的添加，有利于緩解我國磷資源缺乏，磷供應不足的局面；同時還能消除植酸的抗營養作用，增加鈣、鎂、鋅、錳、銅和鐵的生物利用率，促進動物對蛋白質、氨基酸及碳水化合物的消化吸收；減少磷在環境中的排泄，由此有利于降低農業生態的負擔，并減緩水生環境的富營養化；因此，植酸酶作為新型的飼料添加劑，應用前景十分誘人。
另外，在工業生產中，利用植酸酶降解米糠中的植酸從而生產肌醇磷酸鹽或肌醇距成為新的熱點；在食品中應用植酸酶可以改善鐵和鋅的吸收，這對于發展中國家的人群營養具有顯著的意義；此外，植酸酶的研究對于開發植酸酶菌肥，循環利用土壤中有機磷，及其工程菌在工業廢水處理等方面前景均很誘人。
目前，主要利用微生物生產植酸酶，因為(1)利用微生物發酵生產植酸酶不受季節條件限制，可人為控制；(2)生產周期短；(3)由微生物生產的植酸酶所耐受的PH值較寬(2.5-6.0)，并且PH為2.5時與動物胃中酸度接近，PH5.5正處于小腸PH變化范圍內。已經從十幾種微生物中分離到植酸酶，細菌中有枯草芽抱桿菌、大腸桿菌、假單孢菌等；超過200株產植酸酶的絲狀真菌被分離到，多數屬于曲霉、毛霉、青霉和根霉。一般而言，絲狀真菌植酸酶是胞外酶，容易分離提純，而細菌植酸酶往往是胞內酶。相對于細菌和絲狀真菌，酵母菌植酸酶的報道很少。但是由于現有工業生產的植酸酶制劑的酶活性低，且不能耐受高溫，限制了它在飼料添加劑中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種生產植酸酶的方法，其所生產的植酸酶酶活性較高，酶的穩定性較好，能夠很好地在飼料添加劑中應用。
本發明的目的是通過以下技術措施來實現的一種利用黃藍狀菌生產植酸酶的方法，它包括以下步驟(1)采集黃藍狀菌；(2)配制發酵培養基，培養基組分的質量百分比為碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余為水；(3)將黃藍狀菌置于步驟(2)中的培養基里培養；(4)將步驟(3)培養所得的酶液在37℃～65℃的溫度下與PH4～7的植酸鈉溶液反應10～40分鐘后，測定植酸酶的酶活性；然后酶液在4℃或常溫下保存。
本發明中酶活性的測定參照國標GB/T 18634-2002方法。植酸酶的活性定義為酶液在植酸鈉濃度為5.0mmol/L、溫度37℃、PH5.5的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放出1nmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
本發明所述的碳源是供黃藍狀菌充分生長及植酸酶產生的必須的條件，而它既可包括僅起碳源作用的糖和醇之外，也可以還包括那些即可做碳源又可做氮源的胨、肉汁提取液等。這些碳源可單獨使用，也可以組合使用。而在眾多的碳源中糖是最適合的，單糖、二糖、多糖均可使用，如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉、糊精、乳糖等，經實驗證明葡萄糖的利用能最強，因此葡萄糖為最合適碳源，且它的用量為2％～6％，優選5～6％。
本發明所述的氮源也是培養菌落不可或缺的條件之一，有機氮或無機氮均可使用，它的例子包括氨、脲、胨、銨鹽，如胰蛋白胨、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨。還有酵母提取液、肉汁提取物、酵母浸膏等也可作為氮源使用。各種有機氮和無機氮可單獨使用，也可混合使用。在實驗中發現胰蛋白胨和硫酸銨的利用率非常高，是眾多氮源中利用率最高的。因此胰蛋白胨、硫酸銨為最適合的氮源，二者可單獨使用也可結合使用，實驗反映二者結合使用的效果較優。胰蛋白胨的用量為0.2％～1.0％，優選0.2～0.4％；硫酸銨的用量為0.2％～1.0％，優選0.2～0.4％。
在本發明方法步驟(2)中培養基還可以是以下組分和質量百分比碳源2％～6％ 氮源0.2％～2％ 無機鹽0～0.8％ 其余為水本發明所述的無機鹽可以是硫酸銨、氯化鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵和一水硫酸錳中的一種或幾種的組合。
步驟(3)中的黃藍狀菌的接種量為培養基總量的2％～10％，優選2％；種齡時間為2～5天，以種齡3天為佳。培養溫度在28℃～33℃的范圍，以32℃時植酸酶的酶活性最高，PH值在為5.5時植酸酶的酶活性最高。
由于黃藍狀菌生長較慢，因此在培養的過程中可以將裝有培養液的容器放在搖床上震搖，以加速容器中液體通氧，轉速為70～90rmp/min。培養時間7～10天，以8天為佳。
本發明的有益效果(1)本發明采用黃藍狀菌生產所得的植酸酶酶活性高，37℃時可高達294U/ml。
(2)本發明所得到的植酸酶穩定性較高在不同的PH值的條件下于4℃保存24h后測酶活，在PH1～9之間比較穩定，酶活損失很少，可見所得到的植酸酶對酸堿度的穩定性較好；在4℃和常溫條件下保存酶液，24h內酶活損失較快，4℃保存24h酶活損失44.5％，常溫保存24h酶活損失34.1％，此后240h內酶活幾乎沒有新的損失，可見該酶穩定性很好。
(3)以黃藍狀菌產植酸酶，豐富了植酸酶的菌種資源，為植酸酶的開發提供了新的材料。
圖1是黃藍狀菌在察氏培養基上的形態特征圖；圖2是黃藍狀菌在麥芽汁培養基上的形態特征圖；圖3是黃藍狀菌分生孢子的形態特征圖；圖4是黃藍狀菌分生孢子梗的形態特征圖；圖5是黃藍狀菌利用各種碳源所產的植酸酶的酶活性柱形圖；圖6是黃藍狀菌利用各種有機氮源所產的植酸酶的酶活性柱形圖；圖7是黃藍狀菌利用各種無機氮源所產的植酸酶的酶活性柱形圖；圖8是黃藍狀菌利用不同濃度的鎂鹽和鉀鹽所產植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖9是黃藍狀菌利用不同濃度的鐵鹽和錳鹽所產植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖10是黃藍狀菌在不同接種量所產的植酸酶的酶活性曲線圖；圖11是黃藍狀菌在不同裝液量所產的植酸酶的酶活性曲線圖；圖12是發酵培養的PH值對黃藍狀菌產植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖13是發酵培養的溫度對黃藍狀菌產植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖14是發酵培養時間對黃藍狀菌產植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖15是溫度對植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖16是PH值對植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖17是植酸酶與底物反應的時間對植酸酶的酶活性影響的曲線圖；圖18是冷藏時的PH值對植酸酶的穩定性的曲線圖；圖19是不同的金屬離子對植酸酶的酶活性影響的柱形圖；圖20是保藏溫度對植酸酶的穩定性影響的曲線圖；圖21是白云山土壤樣品培養所得的黃藍狀菌的分生孢子及分生孢子梗形態特征圖；圖22是白云山土壤樣品培養所得的黃藍狀菌的在固體篩選培養基上形態特征圖；圖23是武漢土壤樣品培養所得的黃藍狀菌的在固體篩選培養基上形態特征圖；圖24是武漢土壤樣品培養所得的黃藍狀菌的分生孢子及分生孢子梗形態特征圖。
具體實施例方式
現結合實施例對本發明進行具體的闡述，但是本發明的保護范圍并不局限于此，本技術領域的普通技術人員通過以上內容也能實現本發明的目的。
實施例一1.采集黃藍狀菌(1)采集土壤樣品，用常規稀釋法涂平板，通過透明圈法進行初篩真菌采集廣州市蔬菜研究所玉米地表層以下10cm左右土壤樣品，按照常規稀釋法涂平板即PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)，培養2天后將平板上菌落點接于固體篩選培養基上，該培養基pH值為5.5，它的組成成分(每升)葡萄糖30g 硫酸銨5g 氯化鉀0.5g 七水硫酸鎂0.5g七水硫酸錳0.03g 七水硫酸亞鐵0.03g 瓊脂15g 植酸鈣10g培養3天后觀察是否產透明圈的單菌落。
(2)對得到的透明圈菌株進行形態學以及分子生物學鑒定(如圖1～4所示)①察氏培養基產棕紅色色素，生長慢，培養8天菌落直徑大約22mm，菌落表面有同心環，最外面的環表面為白色，第二個環(從外往內數)表面為橙色，第三個環為灰綠色，中間為灰黃色，菌落背面為棕褐色，菌落表面平滑、致密，邊緣全緣，菌落扁平，絨毛狀，培養13天后產棕色水珠②麥芽汁培養基8天時的菌落直徑約50mm，菌落正面鵝黃色，周圍為青綠色，背面黃色，菌落表面平滑、致密，有同心環，質地粉粒狀，菌落扁平，生長較在察氏培養基上生長快，短絨毛狀，14天后表面形成一層黃色顆粒狀子囊果。
其分生孢子為球形或橢圓形，分生孢子梗為掃帚狀。
根據以上形態特征查《真菌鑒定手冊》(1979年)及文獻李國慶等，菌核寄生菌Talaromyces flavus的生物學特性及寄生菌核規律初探，微生物學通報，1995，22(3)可知，該真菌與Talaromyces flavus(黃藍狀菌)的特性最為符合。
③提取該真菌的DNA，通過PCR擴增其18s rDNA序列，擴增產物送上海英駿生物技術有限公司進行測序，將得到的堿基序列在GeneBank中比對，根據比對結果，該真菌與Talaromyces flavus(黃藍狀菌)具有最高的同源性，達100％。根據上述形態學特征以及18s rDNA序列對比結果，確定該真菌為黃藍狀菌。
PCR反應體系
5μl 10×PCR緩沖液、1μl10mmol四種單核甘酸混合物(dNTP)、0.5μl嗜熱性DNA酶(Taq polymerase)、5μl25mmol氯化鎂、1μl上游引物、1μl下游引物、1μl模板DNA、35.5μl無菌水。
上游引物5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTCT-3’下游引物5’-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’PCR反應程序將PCR反應體系先在94℃下進行預變性5分鐘，再進行30次變性—復性—延伸循環反應，每個循環包括94℃反應1分鐘，56℃反應1分鐘，72℃反應2分鐘；最后，在72℃下再延伸7分鐘。
其18s rDNA序列如下cGAGTGAGGGCCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCCAACACCTGTTGCTTCGGCGGGCCCACCGGGGCCACCCGGTCGCCGGGGGACATCCGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAGGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTGATATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGGTCCCCCTGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCACATCTTTTTACAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGAAA2.研究該真菌產植酸酶的條件，以及其所產植酸酶的酶學性質。
本發明中酶活性的測定參照國標GB/T 18634-2002方法。植酸酶的活性定義為酶液在植酸鈉濃度為5.0mmol/L、溫度37℃、PH5.5的條件下，1ml酶液中每分鐘釋放出1nmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U/ml表示。
(1)配制發酵培養基，培養基的組成成分質量百分比為葡萄糖6％胰蛋白胨0.2％ 硫酸銨0.5％氯化鉀0.05％ 七水硫酸鎂0.05％七水硫酸亞鐵0.004％ 一水硫酸錳0.004％ 其余為水(2)配制好培養基后取50ml置于500ml錐形瓶中，將為培養基總量2％的黃藍狀菌置于培養基中培養，控制溫度在32℃，PH5.5，搖床轉速80rmp/min，培養8天。
(3)8天后將培養所得的酶液在37℃的溫度下與PH5.5的植酸鈉溶液反應10分鐘后，測定所得植酸酶得酶活性為294U/ml；然后將植酸酶液在4℃保存。
取所得的植酸酶進行在三個植酸酶的酶活性較高的溫度點分別保溫不同的時間，測定植酸酶的酶活性，結果如表1表1在不同溫度下保溫不同時間的植酸酶的酶活性
從表1可看出在水浴保溫10分鐘的時候，植酸酶保持溫度，并且和底物植酸鈉溶液充分反應。隨著時間延長植酸酶的酶活性雖然有所降低，但是仍具有較高的酶活度。由于37℃是畜禽消化道溫度，37℃處測的酶活對實際應用有參考價值，該酶在37℃時酶活較高，說明該酶比較適合用于飼料添加劑。
再對植酸酶進行穩定性試驗，即在4℃和常溫條件下保存24～240小時，測定它的酶活性。結果顯示，4℃保存24h酶活性損失44.5％，從原來的219U/ml降低到120U/ml，常溫保存24h酶活性損失34.1％，降低到143U/ml，此后240h內酶活性幾乎沒有新的損失，4℃保存96h后酶活性為116U/ml，保存240h殘余酶活性仍有115U/ml；常溫保存96h后酶活性為121U/ml，保存240h殘余酶活性仍有106U/ml。可見該酶穩定性很好。
實施例二取實施例一培養經鑒定后的黃藍狀菌進行以下發酵產植酸酶。
(1)配制發酵培養基，培養基的組成成分質量百分比為葡萄糖6％胰蛋白胨0.2％硫酸銨0.5％(2)配制好培養基后取100ml置于500ml錐形瓶中，將為培養基總量4％的黃藍狀菌置于培養基中培養，控制溫度在26℃，PH4，搖床轉速80rmp/min，培養8天。
(3)8天后將培養所得的酶液在37℃的溫度下與PH5.5的植酸鈉底物溶液反應10分鐘后，測定酶活性為197U/ml；然后將酶液在4℃保存。
實施例三(1)配制發酵培養基，培養基的組成成分質量百分比為麥芽糖4％蛋白胨0.3％硝酸鉀0.2％
氯化鉀0.125％七水硫酸鎂0.125％七水硫酸亞鐵0.005％ 一水硫酸錳0.005％(2)配制好培養基后取200ml置于500ml錐形瓶中，將為培養基總量10％的黃藍狀菌置于培養基中培養，控制溫度在34℃，PH7，搖床轉速80rmp/min，培養8天。
(3)8天后將培養所得的酶液在37℃的溫度下與PH5.5的植酸鈉底物溶液反應10分鐘后，測定酶活性為171U/ml；然后將酶液在4℃保存。
實施例四(1)配制發酵培養基，培養基的組成成分質量百分比為淀粉4％ 胰蛋白胨0.3％硫酸銨0.2％氯化鉀0.075％七水硫酸鎂0.075％七水硫酸亞鐵0.002％ 一水硫酸錳0.002％(2)配制好培養基后取150ml置于500ml錐形瓶中，將為培養基總量10％的黃藍狀菌置于培養基中培養，控制溫度在30℃，PH5，搖床轉速80rmp/min，培養8天。
(3)8天后將培養所得的酶液在37℃的溫度下與PH5.5的植酸鈉底物溶液反應10分鐘后，測定酶活性為103U/ml；然后將酶液在4℃保存。
實施例五(1)配制發酵培養基，培養基的組成成分質量百分比為葡萄糖4％酵母提取液0.3％硝酸鉀0.2％氯化鉀0.025％七水硫酸鎂0.025％七水硫酸亞鐵0.003％ 一水硫酸錳0.003％(2)配制好培養基后取150ml置于500ml錐形瓶中，將為培養基總量10％的黃藍狀菌置于培養基中培養，控制溫度在28℃，PH6，搖床轉速80rmp/min，培養8天。
(3)8天后將培養所得的酶液在37℃的溫度下與PH5.5的植酸鈉底物溶液反應10分鐘后，測定酶活性為112U/ml；然后將酶液在4℃保存。
實施例六不同碳源對黃藍狀菌產植酸酶影響的試驗初始發酵培養基成分為(質量百分比)葡萄糖4％；蛋白胨0.3％；硫酸銨0.2％；
氯化鉀0.05％； 七水硫酸鎂0.05％；七水硫酸亞鐵0.003％；一水硫酸錳0.003％；以不同碳源代替初始發酵培養基中的葡萄糖，添加量均為4％(質量百分比)，培養條件設定為28℃，80rpm，5d后取粗酶液測酶活，結果見圖5。由圖5可知，該菌可以利用的碳源譜比較廣，單糖、二糖、多糖均可以利用。添加葡萄糖時酶活性為67U/ml；添加麥芽糖時酶活性為62U/ml；添加淀粉時酶活性為38U/ml。其中它對葡萄糖的利用能力最強，明顯優于其它碳源；對麥芽糖的利用僅次于葡萄糖，發酵產酶活為葡萄糖的93％左右；對乳糖的利用能力最弱，發酵產酶活遠遠低于其他碳源，僅為葡萄糖的15％左右。由此，確定葡萄糖為該菌最適合的碳源，其最適濃度由正交實驗來決定。
實施例七不同氮源對黃藍狀菌產植酸酶影響的試驗以葡萄糖為碳源，添加量為4％(質量百分比)，將初始液體發酵培養基中的氮源分別用不同的氮源代替，保證氮源濃度為1％(質量百分比)，培養條件同實施例六。
從圖6、7可以看出，該菌的氮源譜也比較廣，不但可以利用有機氮為唯一氮源，也可以利用無機氮為唯一氮源進行發酵產酶。在有機氮中，對胰蛋白胨的利用最好，蛋白胨次之，對酵母浸膏利用最差，僅為胰蛋白胨的8％；添加胰蛋白胨時酶活性為40U/ml；添加蛋白胨時酶活性為21U/ml；添加酵母提取物時酶活性為16U/ml.在無機氮中，對硫酸銨的利用最好，其次是硝酸鉀，對硝酸銨利用最差，僅為硫酸銨的7％。添加硫酸銨時酶活性45U/ml；添加硝酸鉀時酶活性為24U/ml；添加硝酸鈉時酶活性為17U/ml。由此確定該菌的有機氮源為胰蛋白胨，無機氮源為硫酸銨。其最適濃度仍由后面的正交實驗確定。
實施例八鎂鹽與鉀鹽的濃度對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗以葡萄糖為碳源，添加量為4％(質量百分比)；胰蛋白胨為有機氮源，添加量為0.5％(質量百分比)；(NH4)2SO4為無機氮源，添加量為0.5％(質量百分比)。將MgSO4·7H2O和KCl設定一系列濃度，培養條件同實施例六。
由圖8可以看出，在設定的范圍0-0.125％內，MgSO4·7H2O和KCl對產酶有正促進作用，添加量為0％，0.025％，0.05％，0.075％，0.1％，0.125％時酶活性分別為47U/ml，67U/ml，74U/ml，71U/ml，56U/ml，52U/ml。其最佳濃度為0.05％。
實施例九鐵鹽與錳鹽的濃度對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗以葡萄糖為碳源，添加量為4％(質量百分比)；胰蛋白胨為有機氮源，添加量為0.5％(質量百分比)；(NH4)2SO4為無機氮源，添加量為0.5％(質量百分比)；MgSO4·7H2O和KCl添加量均為0.05％(質量百分比)。將FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O設定一系列濃度，培養條件同實施例六。
由圖9可以看出，FeSO4·7H2O和MnSO4·H2O在設定濃度范圍0-0.005％內也對酶活有促進作用，添加量為0％，0.001％，0.002％，0.003％，0.004％，0.005％時酶活性分別為7U/ml，17U/ml，26U/ml，25U/ml，36U/ml，29U/ml。在0.001％-0.005％范圍內比較適宜，而最佳濃度為0.004％。
實施例十培養基中的碳源、氮源、無機鹽的濃度選定試驗對培養基的碳源和兩種氮源進行正交試驗優化培養基，設計3水平3因素，如表2所示，表3即為此正交試驗的設計及結果。
表2 正交試驗因素與水平表
表3 正交試驗設計及結果
由表可以得出，在所設定的范圍內，即葡萄糖2％-6％；胰蛋白胨0.2％-1.0％；(NH4)2SO40.2％-1.0％，該黃藍狀菌都能產植酸酶。實驗得到碳源和氮源的最適配方為葡萄糖6％；胰蛋白胨0.2％；(NH4)2SO40.5％。則最佳培養基配方為葡萄糖6％；胰蛋白胨0.2％；(NH4)2SO40.5％；KCl0.05％；MgSO4·7H2O0.05％；FeSO4·7H2O0.004％；MnSO4·H2O0.004％。
實施例十一接種量對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗分別以2％-10％范圍內一系列接種量分別進行液體發酵，培養條件同實施例六。
由上圖10可知，酶活性與接種量有直接的關系，在2％-10％接種量范圍內都可以產植酸酶。通過實驗發現，2％、4％、6％接種量發酵酶活基本相同，分別為60U/ml，60U/ml，58U/ml。接種量高于6％后酶活開始下降，到8％時酶活性為46U/ml，10％時為37U/ml。因此確定2％為黃藍狀菌發酵產酶的最適接種量。
實施例十二裝液量對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗分別取50ml，100ml，150ml，200ml不同量的液體發酵培養基裝入500ml錐形瓶中發酵發酵條件同實施例六。
由圖11可知，在500ml錐形瓶中裝50ml-150ml培養基都能較好的產植酸酶，而最佳裝液量為50ml/500ml錐形瓶。裝液量為50ml，100ml，150ml，200ml時酶活性分別為115U/ml，60U/ml，36U/ml，19U/ml。由于黃藍狀菌生長比較緩慢，裝液量太多，不利于通氧，影響菌體充分生長，從而使得酶活較低。
實施例十三培養環境PH值對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗調節初始PH在1-9范圍內的液體發酵培養基，培養條件同實施例六。結果如圖12。從圖中可以看出，該黃藍狀菌發酵產植酸酶的適宜的初始PH范圍為4-7，在PH為4，4.5，5，5.5，6，65，7時的酶活性分別為69U/ml，67U/ml，69U/ml，72U/ml，67U/ml，66U/ml，71U/ml。其最適PH為5.5。而PH4-2之間和PH7-9之間曲線下降很快，而PH為1時曲線又有所上升，其發酵酶活性為PH5.5時的42％，推測原因可能是由于在發酵過程中產一種紅棕色的色素所致。
實施例十四培養溫度、時間對黃藍狀菌產植酸酶的影響試驗設定不同的溫度條件下，80rpm，培養5d測酶活。
由圖13、14可以看出，該黃藍狀菌在設定的溫度范圍內26℃-34℃都可以生長，并且能夠產植酸酶，26℃時酶活性為41U/ml，28℃時為60U/ml，30℃時為62U/ml，32℃時為89U/ml，34℃時為34U/ml。在發酵溫度為32℃是酶活性最高，因此確定最適發酵溫度為32℃。
通過以上實驗得出本發明中黃藍狀菌產植酸酶的最適發酵條件為培養溫度32℃；發酵培養基最適PH5.5；裝液量50ml(500ml錐形瓶)；接種量2％；種齡3d；搖床轉速80rmp/min；培養時間8d。
實施例十五不同溫度對植酸酶的酶活性的影響試驗將酶液在37℃-90℃這一范圍內的不同溫度點與底物反應30min，然后測酶活性。
由圖15可知，在37℃-65℃酶活性都較高，37℃酶活性為132U/ml，40℃酶活性為133U/ml，50℃酶活性為239U/ml，55℃酶活性為268U/ml，60℃酶活性為225U/ml，65℃酶活性為91U/ml。酶活性最高點在55℃左右，在70℃和80℃酶活性很低，而90℃又有所升高，37℃是畜禽消化道溫度，37℃處測的酶活性對實際應用有參考價值，該酶在37℃時酶活性較高，說明該酶比較適合用于飼料添加劑。
實施例十六不同PH值緩沖液對植酸酶的酶活性的影響試驗以不同的PH值緩沖液配置植酸鈉底物溶液，37℃反應30min，測酶活。結果如下由圖16可知，在PH4-7范圍內酶活性比較高，PH為4時酶活性為56U/ml，PH為5時酶活性為60U/ml，PH為5.5時酶活性為157U/ml，PH為6時酶活性為52U/ml，PH為7時酶活性僅13U/ml。曲線在PH5.5處出現了一個峰，該PH值處于單胃動物小腸的PH變化范圍內，也說明了該酶適合做飼料添加劑。
實施例十七溫度和恒溫加熱的時間對植酸酶的酶活性的影響試驗在實施例十五的基礎上挑選三個酶活性較高的溫度點，在此溫度值分別保溫不同時間，測定酶活性。
如圖17所示，經過比較可以看出，三條曲線均在水浴10min時的殘余酶活最高，這個共同點反映出此酶的特性，即在水浴10min的時候，酶蛋白保持穩定，并且和底物充分反應，因此，確定水浴10min為其最佳反應時間。37℃水浴10min，20min，30min，40min測定出酶活性分別為294U/ml，173U/ml，143U/ml，141U/ml；55℃水浴不同時間測出酶活性分別為456U/ml，336U/ml，290U/ml，264U/ml；而在65℃時水浴不同時間測得酶活性分別為264U/ml，135U/ml，95U/ml，72U/ml。并且該酶在55℃時最穩定，保溫40min后殘余酶活仍然有57.9％。
實施例十八酶液的PH值對植酸酶的酶活性的影響試驗將酶液分別調整PH為不同PH處，4℃冰箱保存24h，然后測酶活，與保存前比較。保存前各PH點酶活性同實施例12，保存后PH為4的酶活性為35U/ml，PH為5的酶活性為55U/ml，PH為5.5的酶活性為140U/ml，PH為6的酶活性為42U/ml，PH為7的酶活性僅5U/ml。
比較圖18中兩條曲線可知，此酶在2-9之間酶活比較穩定，失活損失很少，可見此酶PH穩定性比較好，適用于工業生產。
實施例十九不同金屬離子對植酸酶的酶活性的影響試驗用PH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配置不同金屬離子，濃度分別為1mM和5mM，以此配置底物溶液，測定酶活比較不同金屬離子在不同濃度時對酶活的影響。
由圖19可知，Ca2+，Mg2+，Mn2+，Fe2+，Cu2+，Zn2+，Hg2+對酶活都有一定的抑制作用，而只有EDTA對酶活有微弱的促進作用。
實施例二十保藏溫度對植酸酶的酶活性的影響試驗將酶液PH調整為5.5，分別在常溫和4℃冰箱保存酶液，取不同保存時間的酶液，測殘余酶活性。
由圖20可知，在4℃和常溫條件下保存酶液，在24h-240h內相對比較穩定。24h內酶活性損失較快，4℃保存24h酶活性損失44.5％，從原來的219U/ml降低到120U/ml，常溫保存24h酶活性損失34.1％，降低到143U/ml，此后240h內酶活性幾乎沒有新的損失，4℃保存96h后酶活性為116U/ml，保存240h殘余酶活性仍有115U/ml；常溫保存96h后酶活性為121U/ml，保存240h殘余酶活性仍有106U/ml。可見該酶穩定性很好。
實施例二十一1、采集土壤樣品，用常規稀釋法涂平板，通過透明圈法進行初篩真菌采集白云山土壤樣品，用常規稀釋法涂固體篩選培養基平板，培養基PH5.5，其組分為(質量百分比)葡萄糖2％ 硝酸銨0.3％ 氯化鉀0.05％ 七水硫酸鎂0.05％七水硫酸錳0.003％ 七水硫酸亞鐵0.003％ 瓊脂1.5％ 植酸鈣1％在28℃的溫度下培養3天后，觀察有透明圈的單菌落生成。挑取產透明圈菌落，轉接PDA培養基進行培養。
2、對得到的透明圈菌株進行形態學以及分子生物學鑒定(圖21、22)選取其中一株形態類似黃藍狀菌，挑取少量該菌的孢子，分別點接于察氏培養基和麥芽汁培養基，培養7-14天，觀察形態。方法與實施例一相同。
察氏培養基產棕紅色色素，生長慢，菌落表面有同心環，最外面的環表面為白色，第二個環(從外往內數)表面為橙色，第三個環為灰綠色，中間為灰黃色，菌落背面為棕褐色，菌落表面平滑、致密，邊緣全緣，菌落扁平，絨毛狀。
麥芽汁培養基菌落正面鵝黃色，周圍為青綠色，背面黃色，菌落表面平滑、致密，有同心環，質地粉粒狀，菌落扁平，生長較在察氏培養基上生長快，短絨毛狀，14天后表面形成一層黃色顆粒狀子囊果。
生物學鑒定的方法與實施例一相同，擴增得到的18s rDNA序列與實施例一得到的18s rDNA相同。說明該真菌為黃藍狀菌。
運用所得到的黃藍狀菌生產植酸酶，方法與實施例一相同。用國標GB/T 18634-2002規定的方法測得酶活性為183U/ml。
實施例二十二1、采集土壤樣品，用常規稀釋法涂平板，通過透明圈法進行初篩真菌采集武漢土壤樣品，用常規稀釋法涂固體篩選培養基平板，其培養基PH 5.5，其組分為(質量百分比)葡萄糖2％ 硝酸銨0.3％ 氯化鉀0.05％ 七水硫酸鎂0.05％七水硫酸錳0.003％ 七水硫酸亞鐵0.003％ 瓊脂1.5％ 植酸鈣1％在28℃的溫度下培養3天后，觀察有透明圈的單菌落生成。挑取產透明圈菌落，轉接PDA培養基進行培養。
2、對得到的透明圈菌株進行形態學以及分子生物學鑒定(圖23、24)選取其中一株形態類似黃藍狀菌，挑取少量該菌的孢子，分別點接于察氏培養基和麥芽汁培養基，培養7-14天，觀察形態。方法與實施例一相同。
察氏培養基產棕紅色色素，生長慢，菌落表面有同心環，最外面的環表面為白色，第二個環(從外往內數)表面為橙色，第三個環為灰綠色，中間為灰黃色，菌落背面為棕褐色，菌落表面平滑、致密，邊緣全緣，菌落扁平，絨毛狀。
麥芽汁培養基菌落正面鵝黃色，周圍為青綠色，背面黃色，菌落表面平滑、致密，有同心環，質地粉粒狀，菌落扁平，生長較在察氏培養基上生長快，短絨毛狀，13天后表面形成一層黃色顆粒狀子囊果。
生物學鑒定的方法與實施例一相同，擴增得到的18s rDNA序列與實施例一得到的18s rDNA相同。說明該真菌為黃藍狀菌。
運用所得到的黃藍狀菌生產植酸酶，方法與實施例一相同。用國標GB/T 18634-2002規定的方法測得酶活性為201U/ml。
權利要求
1.一種利用黃藍狀菌生產植酸酶的方法，它包括以下步驟(1)采集黃藍狀菌；(2)配制發酵培養基，培養基組分的質量百分比為碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余為水；(3)將黃藍狀菌置于步驟(2)中的培養基里培養；(4)將步驟(3)培養所得的酶液在37℃～65℃的溫度下與PH4～7的植酸鈉溶液反應10～40分鐘后，然后酶液在4℃或常溫下保存。
2.根據權利要求1所述的生產植酸酶的方法，其特征在于步驟(2)中所述的碳源為單糖、二糖和多糖中的一種或幾種的混合。
3.根據權利要求2所述的生產植酸酶的方法，其特征在于步驟(2)中所述的碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉和糊精中的一種或幾種的混合。
4.根據權利要求1所述的生產植酸酶的方法，其特征在于步驟(2)中所述的氮源為有機氮、無機氮或有機氮與無機氮的混合物。
5.根據權利要求1或2或3或4所述的生產植酸酶的方法，其特征在于步驟(2)中所述的有機氮為肉汁提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨或脲；所述的無機氮為氨或銨鹽。
6.根據權利要求5所述的生產植酸酶的方法，其特征在于所述的銨鹽為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨或磷酸銨。
7.根據權利要求1或2或3或4所述的生產植酸酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中培養基還可以是以下組分和質量百分比碳源2％～6％ 氮源0.2％～2％ 無機鹽0～0.8％ 其余為水。
8.根據權利要求7所述的生產植酸酶的方法，其特征在于所述的無機鹽為硫酸銨、氯化鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵和一水硫酸錳中的一種或幾種的組合。
9.根據權利要求1所述的生產植酸酶的方法，其特征在于所述步驟(3)中的黃藍狀菌的接種量為培養基總量的2％～10％；種齡時間為2～5天；培養溫度在28℃～33℃的范圍內，PH值為5～6；培養時間為7～10天。
10.根據權利要求1所述的生產植酸酶的方法，其特征在于步驟(3)還包括震搖裝有培養液的容器，轉速為70～90rmp/min。
全文摘要
本發明公開了一種生產植酸酶的方法，它包括以下步驟(1)采集黃藍狀菌；(2)配制發酵培養基，培養基組分的質量百分比為碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余為水；(3)將黃藍狀菌置于步驟(2)中的培養基里培養；(4)將步驟(3)培養所得的酶液在37℃～65℃的溫度下與pH4～7的植酸鈉溶液反應10～40分鐘后，然后酶液在4℃或常溫下保存。本發明采用黃藍狀菌生產所得的植酸酶酶活性高，37℃時可高達294U/ml，穩定性較高，豐富了植酸酶的菌種資源，為植酸酶的開發提供了新的材料。
文檔編號C12N1/14GK101024825SQ20061012362
公開日2007年8月29日 申請日期2006年11月17日 優先權日2006年11月17日
發明者江世貴, 李麗娟, 張殿昌, 蘇天鳳 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所