專利名稱：一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及蛇毒蛋白領域，尤其是指一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法。
背景技術：
利用從蛇毒中分離純化的凝血酶用于止血藥物，目前真正大量投入臨床使用是由瑞士巴塞爾素高藥廠生產的“立血止”(Reptilase)；該品是從巴西矛頭蝮蛇(Bothropejararaca)毒中分離純化的凝血酶，在許多國家都已被廣泛用于臨床，證明是一種高效、安全的止血藥物，我國每年也有大量進口用于臨床使用。為改變這一狀況，中國專利ZL0115567.1“尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生產方法”，公開了利用中國特產尖吻蝮蛇(Agkisrodon acutus)毒中分離純化得到的尖吻蝮蛇凝血酶I，其分子量為30000，在臨床上可作為單體止血劑使用。本發明的發明人通過對尖吻蝮蛇毒的研究，發現在尖吻蝮蛇毒中還含有另一種凝血酶，可通過較為便利的工藝方法，將該凝血酶從蛇毒粗液中分離純化出來。
發明內容
本發明的目的是提供一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化的新方法，按本發明方法從尖吻蝮蛇粗毒中分離純化的尖吻蝮蛇凝血酶具有兩個分子量分別為13875Da和14581Da亞基，組成分子量為29099Da、相對含量大于95％的單一組份蛋白質，可用于止血藥物。
本發明的目的是這樣實現的一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法，其特征是包括下述步驟(1)尖吻蝮蛇粗毒加磷酸緩沖液溶解制成粗毒溶液；(2)層析柱用NaOH溶液去除熱原，用磷酸緩沖液平衡；(3)粗毒溶液上樣，用0→0.1M NaCl磷酸緩沖液梯度冼脫，進行一次純化，收集用促人血漿凝固活性，HPLC和SDS-PAGE鑒定的尖吻蝮蛇凝血酶目標組份；(4)對一次純化的目標組份進行透析；(5)透析后的目標組份進行再次層析，用0→0.1MNaCl磷酸緩沖液梯度洗脫，收集用促人血漿凝固活性、HPLC和SDS-PAGE鑒定的高純度尖吻蝮蛇凝血酶目標組份；(6)按步驟(5)的方法對收集的再次純化目標組份進行第三次純化；(7)對第三次層析后的尖吻蝮蛇凝血酶用Sephadex G-25層析柱脫鹽；(8)對純化后的尖吻蝮蛇凝血酶經促人血漿凝固活性，HPLC，SDS-PAGE電泳鑒定。
上述的一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法中所述的磷酸緩沖液為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉的混合溶液，濃度0.01M，pH7.6。
上述的一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法中步驟(4)所述的透析條件為在4℃用體積3～5倍的磷酸緩沖液透析15h，換液4～5次。
本發明的方法利用磷酸緩沖液對尖吻蝮蛇粗毒進行分離純化，分離純化的尖吻蝮蛇凝血酶純度高(大于95％)，收率較高(可達6～8％)，可以為尖吻蝮蛇毒的有效利用提供一種新途徑。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
圖1是本發明的工藝流程示意圖。
具體實施例方式
參閱圖1所示，本發明的一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法，其工藝流程為磷酸緩沖液溶解蛇毒→層析柱去除熱原后平衡→一次純化→透析→再次純化→三次純化→脫鹽→鑒定，下面通過具體實施例詳述如下實施例11.稱取尖吻蝮蛇毒50g(由廣西蛇毒研究所養蛇場提供)，加400m10.01MpH7.6的磷酸緩沖液溶解，冷藏備用。
2.DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱去除熱原處理層析柱(3.6×4.0cm)及其管道系統用200ml 1M NaOH溶液沖洗，流速約500ml/h，再用注射用水沖洗，流速約1500ml/h，直至流出口液體無堿性。
3.DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱平衡將去除熱原的層析柱，用0.01M pH7.6的磷酸緩沖液沖洗，流速約1500ml/h。大約3500ml磷酸緩沖液可使流出口pH與磷酸緩沖液的pH一致，即達到平衡。
4.DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱一次純化將蛇毒溶液泵入柱內上樣，用上述磷酸緩沖液洗脫，流速約1500ml/h，不吸附組分的蛋白峰顯著下降，接近谷底后，開始用6000ml含0→0.1M NaCl的磷酸緩沖液進行直線梯度冼脫，收集洗脫組分，用促人血漿凝固活性、HPLC和SDS-PAGE確定目標組分。
5.透析收集的目標組分倒入透析袋內，在4℃用體積5倍的上述磷酸緩沖液透析約15h，換液5次，以去除小分子物質。
6.DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱再次純化透析收集的目標組份，上樣以后，用3000ml含0→0.1M NaCl的磷酸緩沖液梯度冼脫，收集洗脫組分，同樣用促人血漿凝固活性、HPLC和SDS-PAGE確定目標組分。
7.DEAE-Sepharose Fsat Flow的三次純化實驗操作與程序與DEAE-Sepharose Fast Flow的再次純化一致。
8.Sephadex G25脫鹽Sephadex G25層析柱先用2000ml1M NaOH洗柱，去除熱原，用注射用水沖洗至流出口無堿性。純化的目標組分上樣，用注射用水洗脫，流速約1800ml/h，收集洗脫峰，即尖吻蝮蛇凝血酶的純化產品約400mg。
本發明方法分離純化的尖吻蝮蛇凝血酶鑒定結果如下1.經Waters高效液相色譜儀檢測，尖吻蝮蛇凝血酶為單一組分的蛋白質，主成分相對百分含量＞95％。
2.經SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測結果表明，尖吻蝮蛇凝血酶由15.3KD和14.2KD亞基構成的蛋白質。經飛行時間質譜儀測定，尖吻蝮蛇凝血酶由兩個亞基(分子量分別為13875Da和14581Da)組成的分子量為29099Da的蛋白質。
3.等電點測定結果表明，尖吻蝮蛇凝血酶的等電點(pI)為5.73。
4.糖測定結果表明，尖吻蝮蛇凝血酶的中性已糖含量為2.15％，表明本品是一種糖蛋白。
5.人血漿凝固時間60±20秒。
6.氨基酸序列分析檢測儀器測序儀ABI Procise 491。
末端氨基酸序列測定結果如下
7.紫外分光光度掃描尖吻蝮蛇凝血酶加水溶解，在200nm-400nm波長范圍內掃描的結果表明，本品在280nm處有最大吸收峰。
綜上所述，本發明的方法所分離純化的尖吻蝮蛇凝血酶是一種蛋白質類止血藥物。
權利要求
1.一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法，其特征是包括下述步驟(1)尖吻蝮蛇粗毒加磷酸緩沖液溶解制成粗毒溶液；(2)層析柱用NaOH溶液去除熱原，用磷酸緩沖液平衡；(3)粗毒溶液上樣，用0→0.1M NaCl磷酸緩沖液梯度冼脫，進行一次純化，收集用促人血漿凝固活性，HPLC和SDS-PAGE鑒定的尖吻蝮蛇凝血酶目標組份；(4)對一次純化的目標組份進行透析；(5)透析后的目標組份進行再次層析，用0→0.1MNaCl磷酸緩沖液梯度洗脫，收集用促人血漿凝固活性、HPLC和SDS-PAGE鑒定的高純度尖吻蝮蛇凝血酶目標組份；(6)按步驟(5)的方法對收集的再次純化目標組份進行第三次純化；(7)對第三次純化后的尖吻蝮蛇凝血酶用Sephadex G-25層析柱脫鹽；(8)對純化后的尖吻蝮蛇凝血酶經促人血漿凝固活性，HPLC，SDS-PAGE電泳鑒定。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所述的磷酸緩沖液為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉的混合溶液，濃度0.01M，pH7.6。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟(4)所述的透析條件為在4℃用體積3～5倍的磷酸緩沖液透析15h，換液4～5次。
全文摘要
本發明公開了一種尖吻蝮蛇凝血酶的分離純化方法，屬于蛇毒蛋白技術領域，分離純化的方法是磷酸緩沖液溶解蛇毒→層析柱去除熱原后平衡→一次純化→透析→再次純化→三次純化→脫鹽→鑒定。本發明的方法利用磷酸緩沖液對尖吻蝮蛇粗毒進行分離純化，分離純化的尖吻蝮蛇凝血酶純度高(大于95％)，收率較高(可達6～8％)，可以為尖吻蝮蛇毒的有效利用提供一種新途徑。
文檔編號C12N9/74GK1920017SQ20061012217
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月18日 優先權日2006年9月18日
發明者徐丹 申請人:廣東新科迪醫藥開發有限公司