半胱氨酸合成酶基因及其用途的制作方法

專利名稱：半胱氨酸合成酶基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進一步具體地說，本發明涉及通過提高編碼釀造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特別是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因或ScYGR012W基因的表達量，提高產品香味的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
背景技術：
市售的pilsner type淡色啤酒制造中使用的啤酒酵母具有在主發酵過程中生成硫化氫的特性。該硫化氫是造成啤酒品質上不受歡迎的嫩啤酒味的原因之一，將其降低到閾值以下的對策可為延長后發酵乃至貯酒期間。
為減少啤酒中的硫化氫，以往即有關于影響硫化氫生成的因子的研究(Jangaard，N.O.，Gress，H.S.and Coe，R.W.；Amer.Soc.Brew.Chem.Proc.，p46，1973；Kuroiwa，Y.and Hashimoto，N.；Brew.Dig.，45，44，1970；Hysert，D.W.and Morrison，N.M.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，34，25，1976)、使用突變法或細胞融合法進行生成硫化氫少的酵母的育種研究(Molzahm，S.W.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，35，54，1977)的報告。
這些方法均不只減少了酵母的硫化氫生成量，還影響了酵母的其他釀造特性(發酵速度、啤酒香味)，所以至今還未得到適合作為啤酒釀造用酵母的酵母。近年來也利用基因操作技術進行釀造用酵母的育種，特開平5-244955號公報中公開了導入編碼胱硫醚β-合成酶的DNA片段的啤酒酵母可減少硫化氫的生成。但其減少程度輕微，轉化株的硫化氫生成量仍為親代株生成量的60％～80％左右。
酵母的物質代謝中，硫化氫是在從培養基中吸收的硫酸離子(SO42-)的還原過程中生成的。該代謝系統是蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸的生物合成途徑，且有關于各階段的酶及其基因(MET17基因)的詳細的報道(Tabor，H.and Tabor，C.W.(eds.)；Methods in Enzymology Vol.17B，Academic Press，London，1971；Jakoby，W.B.and Griffith，O.W.(eds.)；Methods in EnzymologyVol.143，AcademicPress，London，1987)。
O-乙酰高絲氨酸巰基酶是將硫原子從硫化氫轉移到O-乙酰高絲氨酸(O-acetyl homoserine)的酶，由MET17基因編碼。該酶還具有向O-乙酰絲氨酸轉移硫原子的活性。有報道指出使來源于Saccharomycescerevisiae X2180-1A的MET17基因進行組成性表達的啤酒酵母株中，硫化氫的生成量減少到了親代株的2％左右(特開平7-303475號公報)。
半胱氨酸合成酶是將硫原子從硫化氫轉移到O-乙酰-L-絲氨酸的酶。該基因在其他微生物中已被鑒定，但在Saccharomyces cerevisiae中還未被鑒定。
近年來，大量的基因組已被確定，根據確定的全堿基序列，通過基因的鑒定、與公知基因的比較，進行功能推測。還有，通過比較分析大量的生物基因組堿基序列中存在的基因，進行orthologue基因(2個生物種中存在的基因，在共有的祖先種中是同一的基因，現在的功能也同一時為各自的基因)的推斷，通過微生物基因組的orthologue分析，推測編碼Saccharomycescerevisiae的半胱氨酸合成酶的基因是YGR012W(R.L.Tatusov.，M.Y.Galperin.，D.A.Natale.，E.V.Koonin.；Nucleoc.Acids.Research.，28，33，2000)。但是，本基因的功能未經實驗確認，與硫化氫生成量的關系也不清楚。

發明內容
如上所述，為使產品中硫化氫生成量減少，獲取了突變株，但其結果造成了未曾預期的發酵延遲和不受歡迎的香味成分的增加，所以作為實用性酵母還存在著問題。由此，非常期望有既不影響發酵速度、不損害產品品質，又能減少硫化氫生成量的酵母的育種方法。
本發明人為解決上述課題不斷銳意研究的結果，從啤酒酵母中成功地鑒定、分離出了編碼半胱氨酸合成酶的基因。還有，制備了將所得基因導入酵母并使其表達的轉化酵母，確認了硫化氫生成量的減少，從而完成了本發明。
即，本發明涉及啤酒酵母中存在的新型半胱氨酸合成酶基因、該基因編碼的蛋白質、調節了該基因表達的轉化酵母、通過使用調節了該基因表達的酵母以控制產品中硫化氫生成量的方法等。具體地說，本發明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導入了該載體的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒類的制造方法等。
(1)從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸，其為(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1中的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列、或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)蛋白質，其由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸編碼。
(7)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(z)的組成要素的表達框架(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，其與該啟動子以正向或反向結合；以及(z)與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷酸化有關的、在酵母中起作用的信號。
(8)載體，其含有從以下(j)～(l)組成的組中選擇的多核苷酸(j)含有編碼由序列號6的氨基酸序列或序列號6的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號6的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(l)含有與序列號5的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號5的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
(9)酵母，其中導入了上述(7)或(8)中所述的載體。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通過導入上述(7)或(8)中所述的載體降低硫化氫生成能力。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通過使上述(6)中所述的蛋白質的表達量增加降低硫化氫生成能力。
(12)酒類的制造方法，其使用上述(9)～(11)中任一項所述的酵母。
(13)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
(14)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
(15)酒類，其使用上述(12)～(14)中任一項所述的方法制造。
(16)評價方法，其為使用根據具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。
(16a)根據上述(16)中所述的方法，選別硫化氫生成能力低的酵母的方法。
(16b)使用通過(16a)中所述的方法選別的酵母制造酒類(例如啤酒)的方法。
(17)評價方法，其為通過培養被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，以評價被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。
(18)酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母，對上述(6)中所述的蛋白質定量或測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，選擇與目的硫化氫生成能力對應的前述蛋白質的量或前述基因表達量的被檢酵母。
(18a)培養被檢酵母，測定硫化氫生成能力或半胱氨酸合成酶活性，選擇目的硫化氫生成能力或半胱氨酸合成酶活性的被檢酵母的酵母的選擇方法。
(19)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母。
(20)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母及被檢酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質的量比標準酵母多的被檢酵母。即培養復數的酵母，對各酵母中上述(6)中所述的蛋白質定量，選擇其中該蛋白質的量多的被檢酵母。
(21)酒類的制造方法，其特征在于，使用上述(9)～(11)中所述的酵母及通過上述(18)～(20)中所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進行用于酒類制造的發酵，調節硫化氫的生成量。


圖1是啤酒試驗釀造中酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖2是啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是啤酒試驗釀造中酵母的nonScYGR012W基因表達變動的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示檢測出的信號輝度。
圖4是啤酒試驗釀造中親代株、nonScYGR012W高表達株酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖5是啤酒試驗釀造中親代株、nonScYGR012W高表達株浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖6是啤酒試驗釀造中酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660的值。
圖7是啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖8是啤酒試驗釀造中酵母的ScYGR012W基因表達變動的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示檢測出的信號輝度。
圖9是啤酒試驗釀造中親代株、ScYGR012W高表達株酵母增殖量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示OD660時的值。
圖10是啤酒試驗釀造中親代株、ScYGR012W高表達株浸出物消耗量經時變化的示意圖。橫坐標表示發酵時間，縱坐標表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
具體實施例方式
本發明人認為，通過使酵母的半胱氨酸合成酶活性增大，可更高效地減少硫化氫。基于這個設想反復進行了研究，以用特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎，分離、鑒定了編碼啤酒酵母特有的半胱氨酸合成酶的non-ScYGR012W基因。該堿基序列如序列號1所示。由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列號2所示。而且分離、鑒定了編碼啤酒酵母的半胱氨酸合成酶的ScYGR012W基因。該堿基序列如序列號5所示。由該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列號6所示。
1.本發明的多核苷酸首先，本發明提供(a)含有由序列號1或序列號5的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有編碼由序列號2或序列號6的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可為DNA、也可為RNA。
作為本發明對象的多核苷酸，不只限于編碼來自上述啤酒酵母的半胱氨酸合成酶基因的多核苷酸，還包含編碼與該蛋白質具同等功能的蛋白質的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質，例如，可例舉為(c)由序列號2或序列號6的氨基酸序列中1個或多個的氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。
這種蛋白質，在序列號2或序列號6的氨基酸序列中，例如，可為由1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1～數個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。且上述氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或付加的數量，一般優選較小的數量。這種蛋白質可例舉為具有(d)與序列號2或序列號6的氨基酸序列有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的氨基酸序列，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。上述同源性的數值一般越大越好。
半胱氨酸合成酶活性，例如可根據J.Biol.Chem.4528187-28192(1994)中所述的方法來測定。
另外，本發明也包含(e)含有與序列號1或序列號5的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2或序列號6的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴格條件下雜交的多核苷酸”，是指以與序列號1或序列號5的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸、或編碼序列號2或序列號6的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。作為雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本說明書中所述的“嚴格條件”可為低嚴格條件、中嚴格條件、高嚴格條件中的任一種。“低嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件。“中嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件。“高嚴格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，本領域技術人員通過適宜選擇這些因素，均可實現同樣的嚴格條件。
另外，雜交中使用市售的試劑盒時，例如可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據試劑盒中附帶的說明方案，與標記了的探針進行一夜培養后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗滌緩沖液1次洗滌，之后可檢測雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外可雜交的多核苷酸，通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認值(default)計算時，可為與編碼序列號2或序列號6的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、堿基序列的同源性，可使用根據Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來決定。開發了基于BLAST算法、被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數例如為score＝100、wordlength＝12。還有，使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，使用各程序的默認值(default)參數。
2.本發明的蛋白質本發明也提供由上述多核苷酸(a)～(l)中任一個編碼的蛋白質。本發明的優選蛋白質，是由序列號2或序列號6中的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。
這種蛋白質，例如，可例舉為由序列號2或序列號6的氨基酸序列中上述數量的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。還有，這種蛋白質，可例舉為含有與序列號2或序列號6的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質。
這種蛋白質，可使用(《分子克隆》第3版)、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點誘變法來獲得。
本發明的蛋白質的氨基酸序列中等于或大于1個的氨基酸殘基被缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中任意的，且1個或多個的氨基酸序列的位置上，有1個或多個氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加之意，缺失、取代、插入及添加中的2種或大于2種也可同時發生。
以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
還有，本發明的蛋白質可通過Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化學合成法來制造。也可利用Advanced ChemTech公司制、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、ProteinTechnologies Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、島津制作所公司制等的肽合成儀進行化學合成。
3.本發明的載體及導入了該載體的轉化酵母其次，本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體，是涉及含有上述(a)～(l)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的載體。本發明的載體通常如下構成，其含有(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；(y)與該啟動子以正向或反向結合的、上述(a)～(l)中任一項所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉錄終止及多聚腺苷酸化有關的在酵母中起作用的信號作為構成因子的表達框架。本發明在后述的啤酒釀造中，使上述本發明的蛋白質高表達時，為促進上述(a)～(l)中任一項所述的多核苷酸(DNA)的表達，將這些多核苷酸針對該啟動子正向導入。
導入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型載體中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調節酵母中基因表達的啟動子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時又不受醪液中成分的影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如可通過M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中詳細記載的已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標記，所以，轉化時使用的選擇性標記可利用耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍菌素基因(fas2m，PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述構建的載體被導入宿主酵母。宿主酵母，可例舉為可用于釀造的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，雖可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，但在本發明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；還可使用例如協會葡萄酒用1號、協會葡萄酒用3號、協會葡萄酒用4號等的葡萄酒酵母；例如協會酵母、清酒用7號、清酒用9號等的清酒酵母，但不限于這些。本發明中，啤酒酵母例如可優選使用Saccharomyces pastorianus。
酵母的轉化方法，可利用一般使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p 1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于這些。
更具體地說，將宿主酵母置于標準酵母營養培養基(例如YEPD培養基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養，使OD600nm時的值為1～6。將該培養酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優選鋰離子進行預處理。將該細胞在約30℃條件、靜置約60分鐘后，與導入的DNA(約1～20μg)同時在約30℃條件、靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優選加入約4,000Dalton的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將該細胞在約42℃條件、加熱處理約5分鐘。優選將該細胞懸浮液用標準酵母營養培養基洗滌后，放入所定量的新鮮標準酵母營養培養基中，在約30℃、靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基中，獲得轉化體。
其他有關一般性的克隆技術，可參照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發明的酒類制造方法及根據其制法獲得的酒類將上述本發明的載體導入適合釀造所需制造對象的酒類的酵母中，并可通過使用其酵母，制造所需要的、且減少了硫化氫含量、增加了香味的酒類。而且也可同樣使用通過下述本發明的酵母評價方法選擇的酵母。作為制造對象的酒類并不限于此，例如可例舉為啤酒、發泡酒等的啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒類時，除使用本發明中所得到的釀造酵母代替親代株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造設備、制造管理等可與以往完全相同，不會為制造減少硫化氫含量的酒類而增加成本。即根據本發明，可在使用已有設施、不增加成本的情況下，制造出香味優異的酒類。
5.本發明的酵母的評價方法本發明涉及使用根據具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。這種評價方法的一般手法為公知，例如WO 01/040514號公報、特開平8-205900號公報等的記載。以下，就該評價方法進行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對象，使用根據半胱氨酸合成酶基因的堿基序列(優選ORF序列)設計的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設計可使用公知的手法進行。
基因或特異性序列的檢測，可使用公知的手法進行。例如，將含有包含特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸作為一個引物使用，另一個引物使用含有包含該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸，通過PCR法擴增酵母的核酸，并測定擴增物的有無、擴增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數通常為等于或大于10bp，優選為15～25bp。還有，夾在兩引物間的堿基數，通常以300～2000bp為宜。
PCR法的反應條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環數等于或大于10次等的條件。所得到的反應生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測定擴增產物的分子量。根據該方法，通過擴增產物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來預測、評價其酵母的硫化氫生成能力。還有，通過分析擴增物的堿基序列，可進一步更正確地預測、評價上述性能。
本發明中，可通過培養被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，評價被檢酵母的硫化氫生成能力。另外，半胱氨酸合成酶基因的表達量的測定，可通過培養被檢酵母，對半胱氨酸合成酶基因的產物mRNA或蛋白質定量來進行。mRNA或蛋白質的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR，蛋白質的定量例如可通過Western印跡法進行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
還有，通過培養被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，選擇與目的硫化氫生成能力相應的前述基因表達量的酵母，可選擇適合釀造所需酒類的酵母。也可培養標準酵母及被檢酵母，測定各酵母中前述基因的表達量，比較標準酵母和被檢酵母的前述基因的表達量，以選擇所需的酵母。具體地說，例如，可通過培養標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母，來選擇適合所需酒類釀造的酵母。
或者可通過培養被檢酵母，選擇硫化氫生成能力低的、或半胱氨酸合成酶活性高或低的酵母，以選擇適合所需酒類釀造的被檢酵母。
此時，作為被檢酵母或標準酵母，例如可使用上述導入了本發明載體的酵母、抑制了上述本發明的多核苷酸(DNA)表達的酵母、實施了突變處理的酵母、自發突變的酵母等。硫化氫生成量，例如可通過Brauwissenschaft.31.1(1978)、Applied.Environm.Microbiol.664421-4426(2000)、J.Am.Soc.Brew.Chem.5358-62(1995)中任一個所述的方法來測定。半胱氨酸合成酶活性，例如可通過J.Biol.Chem.4528187-28192(1994)中所述的方法測定。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學方法等的任何方法進行(例如，參照大島泰治編著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法、p67-75、學會出版中心等)。
另外，可作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用例如協會葡萄酒用1號、協會葡萄酒用3號、協會葡萄酒用4號等的葡萄酒酵母；例如協會酵母、清酒用7號、清酒用9號等的清酒酵母，但不限于這些。本發明中，啤酒酵母例如可優選使用Saccharomyces pastorianus。標準酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實施例以下，通過實施例詳細敘述本發明，但本發明不局限于以下實施例。
實施例1新型半胱氨酸合成酶基因(nonScYGR012W)的克隆使用特開2004-283169中記載的比較數據庫檢索的結果，發現了啤酒酵母中特有的新型半胱氨酸合成酶基因nonScYGR012W(序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎，設計用于擴增各自全長基因的引物nonScYGR012W_for(序列號3)/nonScYGR012W_rv(序列號4)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株(有時簡稱為“W34/70株”)的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScYGR012W全長基因的DNA片段(約1.2kb)。
將如上所述得到的nonScYGR012W基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制)。將nonScYGR012W基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。
實施例2啤酒試驗釀造中nonScYGR012W基因表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行啤酒試驗釀造，將從發酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度 12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度 8.6ppm發酵溫度 15℃酵母投入量 12.8×106cells/mL對發酵液經時抽樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經時變化。且與此同時對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進行生物素標記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GCOS；Gene ChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)進行。nonScYGR012W基因表達模式如圖3所示。由此結果，可確認通常的啤酒發酵中nonScYGR012W基因進行了表達。
實施例3nonScYGR012W基因高表達株的制備將實施例1中所述的nonScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性內切酶SacI及NotI酶切，制備了包含蛋白質編碼區域全長的DNA片段。使該片段與用限制性內切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構建了nonScYGR012W高表達載體nonScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達。酵母中的選擇性標記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r、大腸桿菌中的選擇性標記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達載體，用特開平07-303475中所述的方法轉化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培養基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉化體。
實施例4啤酒試驗釀造中硫化氫生成量的解析使用親代株(W34/70株)及由實施例3得到的nonScYGR012W高表達株通過以下條件進行了發酵試驗。
麥汁浸出物濃度12％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度約8ppm發酵溫度 15℃恒定酵母投入量5g濕酵母菌體/L麥汁對發酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(圖4)、浸出物消耗量的經時變化(圖5)。對發酵終止時硫化氫的定量參考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。測定含有預知濃度的硫化氫的試樣，從檢測出的硫化氫峰面積來制成硫化氫的校正曲線，用與標準試樣的分析條件相同的條件測定發酵醪液，從檢測出的硫化氫的面積與校正曲線的關系對硫化氫量進行定量(表1)。
表1.發酵終止時發酵醪液中的硫化氫量

如表1所示，發酵終止時硫化氫生成量相對于親代株的22.1ppb，其nonScYGR012W高表達株為3.3ppb。由該結果可知，通過nonScYGR012W高表達，硫化氫的生成量約減少了85％。
實施例5半胱氨酸合成酶基因(ScYGR012W)的克隆使用特開2004-283169中記載的比較數據庫檢索的結果，發現了啤酒酵母中的半胱氨酸合成酶基因ScYGR012W(序列號5)。以所得到的堿基序列信息為基礎，設計用于擴增各自全長基因的引物ScYGR012W_for(序列號7)/ScYGR012W_rv(序列號8)，以基因組解讀株Saccharomycespastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有ScYGR012W全長基因的DNA片段(約1.2kb)。
將如上所述得到的ScYGR012W基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制)。將ScYGR012W基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進行分析，以確認堿基序列。
實施例6啤酒試驗釀造中ScYGR012W基因表達分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行啤酒試驗釀造，將從發酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測。
麥汁浸出物濃度12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度8.6ppm發酵溫度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL對發酵液經時抽樣，觀察酵母增殖量(圖6)、表觀浸出物濃度(圖7)的經時變化。且與此同時對酵母菌體抽樣，對制備后的mRNA進行生物素標記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GCOS；Gene ChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)進行。ScYGR012W基因表達模式如圖8所示。由該結果，可確認通常的啤酒發酵中ScYGR012W基因進行了表達。
實施例7ScYGR012W基因高表達株的制備將實施例5中所述的ScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性內切酶SacI及NotI酶切，制備了包含蛋白質編碼區域全長的DNA片段。使該片段與用限制性內切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構建了ScYGR012W高表達載體ScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYK1的啟動子高表達。酵母中的選擇性標記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達載體，用特開平07-303475中所述的方法轉化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培養基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉化體。
實施例8啤酒試驗釀造中硫化氫生成量的解析使用親代株(W34/70株)及由實施例7得到的ScYGR012W高表達株通過以下條件進行了發酵試驗。
麥汁浸出物濃度12％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度約8ppm發酵溫度 15℃恒定酵母投入量5g濕酵母菌體/L麥汁對發酵醪液經時抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(圖9)、浸出物消耗量的經時變化(圖10)。對發酵終止時硫化氫的定量參考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。測定含有預知濃度的硫化氫的試樣，從檢測出的硫化氫峰面積來制成硫化氫的校正曲線，用與標準試樣的分析條件相同的條件測定發酵醪液，從檢測出的硫化氫的面積與校正曲線的關系對硫化氫量進行定量(表2)。
表2.發酵終止時發酵醪液中的硫化氫量

如表2所示，發酵終止時硫化氫生成量相對于親代株的22.1ppb，其ScYGR012W高表達株為2.6ppb。由該結果可知，通過ScYGR012W高表達，硫化氫的生成量約減少了88％。
產業上的可利用性因根據使用本發明的酵母的酒類制造方法(本發明的酒類的制造方法)，可通過半胱氨酸合成酶迅速消耗硫化氫，所以啤酒釀造及產品中硫化氫的濃度可被抑制到很低的水平，從而制造出香味優異的酒類。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>半胱氨酸合成酶基因及其用途(Cysteine synthase gene and its use)<130>PCT06-0075<150>JP2005-240350<151>2005-08-22<150>JP2006-47554<151>2006-02-23<160>8<210>1<211>1188<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>1atgtccagtt cacgagataa gaacgctttg tatttgcctt ggaacgaatg catttccatc 60gcttccgtcc taatcggcgc atatgcatcg tataaatatt ataaactatg caaggcgcag 120gatataccac gtccaaaaga tggtgtggag cagctaatag gaaacactcc cctggttcag 180attagatccc tttccaaggc caccggagtt aacatttatg caaaattaga gttatgtaac 240ccagcaggaa gtgctaaaga tagagtagca ttaaacataa taaagaccgc agaggaacga 300ggtgagctaa tcagaggcga acctggttgg gtgttcgaag gaacaagcgg ttcaacaggc 360atttctatag ccatggtctg taatgcacta ggatataggg cacacatttc tttacccgac 420gacacatcgt tagaaaagtt ggcattacta gaaagtctcg gtgctacagt caataaggtt 480aagcctgcca gtattgtcga tccaaatcaa tatgttaatg cagctaagaa agcatgcgat 540gatttgagta aggaaggtaa tggagtaaag gcagtttttg ctgaccaatt tgaaaatgaa 600gccaattgga gagtacacta tcaaaccacg ggtccagaaa ttgcccatca aatggaagga 660aaaattgatg cgtttattgc tggctgtggt accggtggaa cgataactgg agtggccaaa 720tatctaaagg aaagcgcaaa aattccgtgc catgtcgttc ttgcagatcc acaaggttca 780ggcttttata ataggataaa ctacggcgtg atgtatgact atgtagaaaa agaaggtaca 840agaaggaggc atcaggtgga tactattgta gaaggtatcg ggctaaacag gattactcaa 900aatttccaca tgggcgaaga gtttatcgat gaatcgatac gtgtcaatga cactcaagct 960atcagaatgg caaaatacct atcagtaaac gatgggttat tcgtaggaag tagtacagct 1020ataaacgcag tagctgctgt tcaaatcgcg aaaagactcc ctcctggtgc caacattgta 1080attattgcat gcgacagcgg atcaagacat ttaagtaaat tctggaaaga agctaaacaa 1140atagagtatg acatatcgtt aaaggagata acaggtggca ttcgatga1188<210>2<211>395<212>PRT
<213>酵母(Yeast)<400>2Met Ser Ser Ser Arg Asp Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Pro Trp Asn Glu1 5 10 15Cys Ile Ser Ile Ala Ser Val Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Ser Tyr Lys20 25 30Tyr Tyr Lys Leu Cys Lys Ala Gln Asp Ile Pro Arg Pro Lys Asp Gly35 40 45Val Glu Gln Leu Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Gln Ile Arg Ser Leu50 55 60Ser Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Cys Asn65 70 75 80Pro Ala Gly Ser Ala Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Ile Ile Lys Thr85 90 95Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ile Arg Gly Glu Pro Gly Trp Val Phe100 105 110Glu Gly Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ile Ser Ile Ala Met Val Cys Asn115 120 125Ala Leu Gly Tyr Arg Ala His Ile Ser Leu Pro Asp Asp Thr Ser Leu130 135 140Glu Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ala Thr Val Asn Lys Val145 150 155 160Lys Pro Ala Ser Ile Val Asp Pro Asn Gln Tyr Val Asn Ala Ala Lys165 170 175Lys Ala Cys Asp Asp Leu Ser Lys Glu Gly Asn Gly Val Lys Ala Val180 185 190Phe Ala Asp Gln Phe Glu Asn Glu Ala Asn Trp Arg Val His Tyr Gln195 200 205Thr Thr Gly Pro Glu Ile Ala His Gln Met Glu Gly Lys Ile Asp Ala210 215 220Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys225 230 235 240Tyr Leu Lys Glu Ser Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp245 250 255Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Ile Asn Tyr Gly Val Met Tyr260 265 270Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr275 280 285Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr Gln Asn Phe His Met290 295 300Gly Glu Glu Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Thr Gln Ala305 310 315 320Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly325 330 335Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Val Gln Ile Ala Lys Arg
340 345 350Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser355 360 365Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Gln Ile Glu Tyr Asp370 375 380Ile Ser Leu Lys Glu Ile Thr Gly Gly Ile Arg385 390 395<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>3gagctcatag cggccatgtc cagttcacga gataagaacg 40<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>4ggatcctatg cggccgcgga aaaactaaca aggaattcag aa 42<210>5<211>1182<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>5atgtcctgtt ctcaaaataa gacttctgtc agtctggcct ggcgtgaatg catatccatc 60gcttccgtcc taattggcgc gtatgcatca tacagatact ataagttgtt caaaacacgc 120gatattccac gtccaaaaga aggcattgaa gaactcatag gaaacactcc tctggttaag 180atcagatctc ttaccaaggc tactggagtt aacatttacg ctaagttgga gttatgcaac 240ccagcaggaa gtgctaagga tagagtggct ttaaacatca taaagacggc tgaggaatta 300ggcgagctcg tcagaggtga acctggctgg gtatttgaag gaacaagtgg gtcgactggt 360atctctatag cagtggtctg taatgcgttg ggttataggg cacacatttc tttgcccgat 420gacacatcgc tagaaaaatt ggcattacta gaaagcctcg gtgctactgt taataaggtt 480aagcccgcta gtattgtcga tccaaaccaa tacgtaaatg ccgccaaaaa ggcatgtaat 540
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210 215 220Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys225 230 235 240Phe Leu Lys Glu Arg Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp245 250 255Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Val Asn Tyr Gly Val Met Tyr260 265 270Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr275 280 285Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr His Asn Phe His Met290 295 300Gly Glu Lys Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Asn Gln Ala305 310 315 320Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly325 330 335Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Ile Gln Val Ala Lys Thr340 345 350Leu Pro His Gly Ser Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser355 360 365Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Glu Ile Asp His Asp370 375 380Val Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Ile385 390<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatag cggccatgtc ctgttctcaa aataagactt 40<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>8ggatcctatg cggccgccca cggaaagtag caaaaaatgt ag。4權利要求
1.從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸，其為(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于60％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
2.權利要求1中所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號2的氨基酸序列或序列號2的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號1的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
3.權利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.權利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
5.權利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其是DNA。
6.蛋白質，其由權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸編碼。
7.載體，其含有權利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
8.載體，其含有從以下(j)～(l)組成的組中選擇的多核苷酸(i)含有編碼由序列號6的氨基酸序列或序列號6的氨基酸序列中1～10個氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號6的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸；及(l)含有與序列號5的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號5的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質的多核苷酸的多核苷酸。
9.酵母，其中導入了權利要求7或8中所述的載體。
10.權利要求9中所述的酵母，其通過導入權利要求7或8中所述的載體降低硫化氫生成能力。
11.權利要求10中所述的酵母，其通過使權利要求6中所述的蛋白質的表達量增加降低硫化氫生成能力。
12.酒類的制造方法，其使用權利要求9～11中任一項所述的酵母。
13.權利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
14.權利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
15.酒類，其用權利要求12～14中任一項所述的方法制造。
16.評價方法，其使用根據具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的堿基序列設計的引物或探針，評價被檢酵母的硫化氫生成能力。
17.評價方法，其通過培養被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，評價被檢酵母的硫化氫生成能力。
18.酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母，對權利要求6中所述的蛋白質定量或測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達量，選擇與目的硫化氫生成能力相應的前述蛋白質的量或前述基因表達量的被檢酵母。
19.權利要求18中所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因在各酵母中的表達量，選擇該基因比標準酵母高表達的被檢酵母。
20.權利要求18中所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母及被檢酵母，對各酵母中權利要求6中所述的蛋白質定量，選擇該蛋白質的量比標準酵母多的被檢酵母。
21.酒類的制造方法，其特征在于，使用權利要求9～11中所述的酵母及通過權利要求18～20中所述方法選擇的酵母中的任一個酵母，進行用于酒類制造的發酵，調節硫化氫的生成量。
全文摘要
本發明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進一步具體地說，本發明涉及通過提高編碼釀造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特別是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因的表達量，提高產品香味的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
文檔編號C12C7/00GK1920043SQ20061012138
公開日2007年2月28日 申請日期2006年8月21日 優先權日2005年8月22日
發明者中尾嘉宏, 兒玉由紀子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社