專利名稱：一種通過ercc2、cyp1a1和xrcc1基因檢測肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種檢測肺癌易感性的試劑盒，通過同時檢測切 除修復復合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2' ERCC2)、細胞色素P4501A1酶基因(cytochrome P450, family 1， subfamily A, poiypeptide，CYP1A1)和 X射線交錯互補修復基因l (X-ray repair cross--complementing gene 1， XRCC1)的單核苷酸多態(tài)性位點
(SNP)來預測個體對肺癌的易感性。
背景技術：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡稱肺癌，為當前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人類健康和 生命的疾病。腫瘤細胞源于支氣管粘膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴結和血行轉(zhuǎn)移，早期常有剌激性咳嗽、痰 中帶血等呼吸道癥狀，病情進展速度與細胞的生物特性有關。
平個世紀以來，世界各國肺癌的發(fā)病率和病死率都有明顯增高趨勢。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報告 1997年全世界死于惡性腫瘤的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%，其中肺癌占惡性腫瘤死亡的19%,居 惡性腫瘤死因的第一位。我國1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市人口的腫瘤死亡中，肺癌由原來的 第4位上升為第I位，農(nóng)村上升最快的也是肺癌。云南錫礦的肺癌發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1%0 1969年間為197.87/10萬，1970 1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的。英國 著名腫瘤學家R.Peto預言如果我國不及時控制吸煙和空氣污染，到2025年我國每年肺癌將超過100萬， 成為世界第一肺癌大國。
病因和發(fā)病機制迄今尚未明確。 一致認為肺癌的發(fā)病與下列因素有關O吸煙(包括主動吸煙和被動 吸煙)；②職業(yè)致癌因子，已被確認的致人類肺癌的職業(yè)因素包括石棉、無機砷化合物、二氯甲醚、鉻及 其化合物、鎳、氡、芥子氣、氯乙烯、煤煙、焦油和"油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等；③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射；⑤飲食與營養(yǎng)，美國紐約和芝加哥開展的前瞻性人
群觀察的結果說明，食物中大然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十兒年后癌癥的發(fā)生呈負相關，其中
最突出的是肺癌； 其他，美國癌癥學會將結核列為肺癌的發(fā)病因素之一。有結核病者患肺癌的危險性是 正常人群的10倍。其主要組織學類型是腺癌。此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲霉)、機體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對肺癌的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。
近年研究表明，肺癌的發(fā)生與某些癌基肉的活化及抑癌基因的失活密切相關。已經(jīng)證明的幾個癌基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、C-erB2、機制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗癌 基肉p53、 pl6和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細胞肺癌中均有過度表達。 非小細胞肺癌中則常可見ras族基因的過度表達。這些深入的研究將為基因預防和治療肺癌提供理論基礎。
SNP(single nucleotide polyinorphisra)，即單核苷酸多態(tài)性標記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多態(tài)性，被遺傳學界稱為第二代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標記，占 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表荊的差異以及不同個體對疾病，特別是復雜疾病的易感 性和對環(huán)境因素、藥物反應的差異。
ERCC2，位丁第19號染色體19ql3.3位置，共有23個外顯子，基因全長19.0kb， mRNA全長2355bp, 編碼含76個氨基酸的蛋白。由ER(:C2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復，它可識別與修復結 構無關的大范闈的損傷，如火的加合物和胸腺嘧啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復合物BTF2ATFIIH的一 個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，屬于RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的功能 缺失導致基本轉(zhuǎn)錄因子復合物不能正確識別DNA損傷位點，從而使堿基切除修復無法正確進行，導致DNA 上的致癌損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導致的疾病包括癌癥、著色性干皮病、毛發(fā)硫營養(yǎng) 不良、柯凱因氏綜合癥。rsl3181是位于第19號染色體ERCC2基K第23號外顯子段Lys751Gln的T/G多 態(tài)。世界人群中的頻率約為T:G =0.798: 0.202，雜合度0.322，中國人群中的頻率約為T:G =0.91: 0.09。目 前的多項研究表明，Lys751Gln的氨基酸替代位f ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態(tài)性與肺癌、膀 胱癌、乳腺癌、皮膚癌等疾病有關。ERCC2Lys751Gln位點的多態(tài)現(xiàn)象與肺癌特別是肺鱗癌的發(fā)生存在顯
著關聯(lián)。
CYP1A1基肉位于第15號染色體15q22-q24位置，全長6.0kb, mRNA全長2601bp，共有7個外顯子， 編碼513個氨基酸的細胞色素P4501A1。 P4501A1是重要的活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類，被激活的 CYP1A1能將多種環(huán)境中的有機物質(zhì)如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多環(huán)芬芳碳氫化合物轉(zhuǎn) 化為細胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生的危險。國內(nèi)外的眾多研究顯示CYP1A1的多態(tài)與野生 型相比有更高的酶接觸反應活性和可誘導性，從而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、前列腺癌等疾病的 危險度。細胞色素P450酶(CYP450)是細胞內(nèi)重要的I相代謝酶，在致癌物的活化和解毒過程中起著重 要的作用。P4501A1(CYP1A1)是活化多環(huán)芳烴類致癌物的主要酶類。CYP1A1作為一種微神經(jīng)元體細胞酶 與一些致癌物質(zhì)的生物激活有關，例如benzo[a]pyrene。同時，CYP1A1易丁-被TCDD和多環(huán)的芳香族化 合物所誘變，包括3-甲基膽蒽等實驗室用致癌物質(zhì)。目前的動物實驗表明，CYP1A1的表達與芳基碳氫化 合物受體(AhR)禾nArnt (AhR Nuclear Translocator)的激動劑，以及USF1 (Upstream Stimulatory Factor) 的拮抗劑有關。同時，CYP1A1通過C2羥基化作用參與雌激素的代謝活動。rsl048943是位于CYP1A1基 因上的一個A/G多態(tài)，位丁'第7外顯子462號氨基酸由lie轉(zhuǎn)化為Val。目前NCm公布的世界人口頻率 A:G為0.896:0.104，雜合度0.186。世界人群的關聯(lián)分析表明，CYP1A1 1le462Val位點ValVal和ValHe基 因型在肺癌病例組中的頻率明顯高亍對照組，在女性中風險度尤其突出?；诙鄠€中國人群肺癌發(fā)病與 CYP1A1 11e462Val位點的關聯(lián)分析研究，上千例肺癌個體與健康對照個體的分析，顯示CYP1A1 iie462Val 這種位T酶蛋白的血紅素結合區(qū)的變異，是中國人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一，在女性中尤為突出。 酶動力學研究表明，3種基W型表達的酶活性存在差異。Val/Val活化毒物的能力最強，Ile/Val次之，而lle/Ile 最弱。研究顯示，CYP1A1 ValVal基岡型是中國人群中重要的肺癌遺傳易感因素之一。
XRCC1位T第19號染色體19ql3.2-13.3位置，全長32.3kb， mRNA全長2087bp,共有17個外顯子， 編碼634個氮基酸的蛋A。 XRCC1編碼的蛋白對閎電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效 的修復作用。XRCC1編碼的蛋A與DNA連接酶III、聚合酶!3 、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與DNA 的堿基切除修復(Base Excision R印a:;r， BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態(tài)性，與 癌癥發(fā)生有密切的關系。與XRCC1相關的癌癥主要有乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、胃癌、結 腸癌、胰腺癌、肺癌等。rs25487是位丁'第19號染色體XRCC)基因上的一個G/A多態(tài)，引起XRCC1基 因編碼的蛋白第399個氨基酸由Arg變?yōu)镚n。 Arg399Gin位于第10號外顯于，XRCC1蛋白BCRT1區(qū)域。 在世界人群中的該多態(tài)的頻率分布，G,1,0.72， A占0.28左右。中國人群中的分布G為0.68， A為0.32。 分子生物學研究表明，XRCC1基因上第399號氨基酸Arg-Gln的替代加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加 合物的結合能力，從而影響個體的腫瘤易感性。通過大量對于大規(guī)模人群的肺癌病例對照研究，XRCC1 的399氨基酸突變位點在做單岡素分析時與肺癌發(fā)生相關，但是分層分析后發(fā)現(xiàn)在大量吸煙的人群中，肺 癌發(fā)病風險降低。
國內(nèi)外的大 的關聯(lián)分析表明，ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點基因型為G時肺癌的發(fā)生幾率增 加；CTP1A1基因上rsl048943號SNP位點基因型為G時肺癌的發(fā)生幾率增加；XRCC1基因上rs25487號 SNP位點基閔型為A時肺癌的發(fā)生幾率增加。這三個SNPs位點的多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性。
發(fā)明內(nèi)容
基于ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點和XRCC1基因上的 rs254S7號SNP位點的多態(tài)性可用于評估個體對肺癌的易感性的基礎上，本發(fā)明提供一種檢測肺癌易感性 的試劑盒。
該試劑盒包括檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測 CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、檢測XRCC1基因上的rs25487 號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、T叫酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩 沖液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點和XRCC1基因上的rs25487號SNP位點而設計，能特異性擴增出耙位點的DNA片段。 設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: l和2所示 序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對。 特異性引物對可用常規(guī)的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這三對引 物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的 rsl048943號SNP位點和XRCC1基肉上的rs25487號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢 測出這三個SNPs位點肺癌易感基岡型的探針。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地, 試劑盒中包含貝有SEQ ID NO: 7、 8和9所示序歹ij的Taqmari探針。特異性熒光探針可用常規(guī)的合成技術 進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這三條探針，所有可用于熒光定 量PCR檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點和XRCC1基因上 的rs25487號SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 1^1 10 X熒光定量PCR反應緩沖液， 0. 1^1 25mM dNTP混合液， 0, 5nl 25mM MgCh溶液， 0.02^1 (5units/|al) T叫DNA聚合酶， 2(HiM特異性引物對(六條)各0.225nl， 10nM特異性熒光探針(二條)各0.25(xl， 去離子水4. 28^1。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應
使用可檢測肺癌易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針
有義引物1:5'- ACTCAGGAGTCACCAGGAA --3'(SEQIDNO:1)Tm值為58°C
反義引物l:5'- TCTGTTCTCTGCAGGAGGA --3'(SEQIDNO:2)Tra值為58°C
有義引物2:5'- GTGTTAAGTGAGMGGTGAT-3，(SEQIDNO:3)Tm值為56°C
反義引物2:5'-AGGATAGCCAGGAAGAGAM-3,(SEQIDNO:4)Tm值為58°C
有義引物3:5'-TAACTGGCATCTTCACTTCT-3，(SEQIDNO:5)Tm值為56°C
反義引物3:5'- TCCAGATTCCTGGCATTGC --3'(SEQIDNO:6)Tm值為58°C
熒光探針1:5'- MTCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3'(SEQIDNO:7)Tm值為66°C
熒光探針2:5'-TATCGGTGAGACCGTTGCCC-3，(SEQIDNO:8)Tm值為64°C
熒光探針3: 5' - CGGCTGCCCTCCCAGAGG -3'(SEQ ID NO: 9) Tm值為64°C 有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異地針對檢測ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點多態(tài)性； 有義引物2,反義引物2和熒光探針2特異地針對檢測CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點多態(tài)性有 義引物3，反義引物3和炎光探針3特異地針對檢測XRCC1基岡上rs25487號SNP位點多態(tài)性。
熒光定量PCR反應體系為總體積]0^1，包含濃度為20ng/Vl的DNA模板2^1、 lpl 10 X熒光定量PCR 反應緩沖液、0. 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCh溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20|iM的有義引物1、 2和3各0. 225pl、 20-的反義引物1、 2和3各0. 225pl、 lOpM的熒光探針1、 2和 3各0.25^1，去離子水4.28pl。
在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為5(TC、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環(huán)的 95°C、 30秒，60°C、 l分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: SNP基因型分析
將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常對照相對比，熒光探針1最終的熒光信號明顯高于 正常對照，說明被檢測DNA的ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點基因型攜帶有G型，為肺癌易感型；熒 光探針2最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DNA的CYP1A1基因上rsl048943號SNP位點基 因型攜帶有G型，為肺癌易感型；熒光探針3最終的熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測DM的XRCC1 基因上rs25487號SNP位點基因型攜帶有A型，為肺癌易感型。
實施例2.指導人們主動預防肺癌的服務
目前在上海主健生物工程有限公司己經(jīng)開展了這項服務。 步驟l: DNA提取
對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問巻調(diào)査表。依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。 步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上 rsl048943號SNP位點和XRCC1基因上rs25487號SNP位點同時進行熒光定量PCR檢測，確定這三個SNPs 位點的基因型。
步驟3:指導人們主動預防肺癌
通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具基因分型檢測報告和被檢測者個體化健康指導報告。基因 檢測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病的概率大小。個體化健康指導報告以被檢測者 的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調(diào)査結果，評估被檢測者肺癌遺傳易感的相對風險。 同時制定出針對于被檢測者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習慣、生活方式上的改進建議等，并 為被檢測者普及預防肺癌的健康知識。
序列表<110>上海主健生物工程有限公Ff]<120> —種通過ERCC2、 CYP1A1和XRCC1基因檢測肺癌易感性的試劑盒 <160> 9<210> (211〉 <:212> <213>119 DNA人工序列<220>〈223〉引物 <■ 1actcaggagt caccaggaa<210> 2 <211> 19 <212>畫 <213>人工序列<220><223>引物 <400> 2t:ctgttctct gcaggagga〈210〉 3 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉引物 <400> 3gtgttaagtg agaaggtgat191920<210> 4 〈211〉 20 〈212〉 DNA<213〉人r.序列 <220>〈223〉引物 <400> 4鄉(xiāng)atagcca gg幼gagaaa<210〉 5 <211〉 20 <212> DNA <213〉人l:序列<:220><223〉引物 <400> 5taactggcat cttcacttct<210〉 6 <211> 19 (212> DNA 〈213〉人工序列《，〉<223>引物 〈400〉 6tccagattcc tggcattgc<210> 7<211〉 22 <212>醒 <213>人工序列<220><223〉探針 催〉7aatctgctct atcctctgca gc 22<210> 8 〈211〉 20 <212> DNA <213>人l:序列<220>〈223〉探針 <400〉 8t8tcggtgag accgttgccc 20<210> 9 <2U〉 18 <212〉腿 <213〉人工序列<220〉<223>探針 <400〉 9cggctgccct cccagagg 18
權利要求
1.一種檢測肺癌易感性的試劑盒，包括同時檢測ERCC2基因上的rs13181號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點和XRCC1基因上的rs25487號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對ERCC2基因上的rsl3181 號SNP位點、CYPiAl基因上的rsl048943號SNP位點和XRCC1基因上的rs25，87號SNP位點而設計，能特 異性擴增出包含ERCC2基因上的rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點和XRCC1基 因上的rs25487號SNP位點的引物對。
3. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對ERCC2基因上的 :rsl3181號SNP位點、CYP1A1基因上的rsl048943號SNP位點和l XRCC1基因上的rs25487號SNP位點而設 計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這三個SNPs位點肺癌易感基因型的探針。
4. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQ ID NO: l和2所 示序列的引物對、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物對以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物對。
5. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 7、 8 和9所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1^1 IOX熒光定量PCR反 應緩沖液，0. I" 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液，0.02^1 (5units/(il) Taq DNA聚合酶， 2(VM特異性引物對(六條)各0.225pl， 10pM特異性熒光探針(三條)各0.25nl，去離子水4.28^1。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測ERCC2基因上的rs13181號SNP位點、CYP1A1基因上的rs1048943號SNP位點和XRCC1基因上的rs25487號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測分析個體的ERCC2基因、CYP1A1基因和XRCC1基因上的SNPs位點基因攜帶型來預測個體對肺癌的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101153319SQ200610116660
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權日2006年9月28日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司