專利名稱：工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種廢水處理技術領域的方法，具體是一種工業廢水處理中的功能菌群(Thauera屬)特異性分子檢測方法。
背景技術：
復雜多樣的微生物群落是生物廢水處理裝置中核心成分，它的組成和結構往往決定了這個系統處理效果的好壞，而其中的某些特定類型的微生物群落又扮演了特別重要的角色，如Thauera屬這一類群的細菌。先前的研究結果表明，Thauera屬這類菌群在反硝化以及降解有機物，特別是芳香族化合物的降解過程中起了非常重要的作用(Liu et al.，FEMS Microbiol Ecol，2006，55274-286)。而且這類菌在反硝化類型的廢水處理裝置中含有極高的比例(約56％)，因此這一類型的細菌被認為是在廢水處理過程中起非常重要作用的功能菌群。但是目前廣泛使用的分離培養的方法不僅耗時耗力，而且難以獲得這類菌群的主要信息。因此發展快捷方便的分子方法來特異性的研究這類菌群是十分有必要的。
經對現有技術的文獻檢索發現，對廢水處理中的重要功能菌群-Thauera屬的研究主要都基于分離培養得到的純菌。Microarry和Real Time PCR等技術也開始在Thauera的研究中應用，但是這些方法只說明它是否存在或者是量的多少，沒有說明它的組成。然而，不是每一種存在的Thuaera都是起作用的或起同等作用的，因此了解一個廢水處理裝置中這類菌群的組成，利用它來專一性研究廢水處理系統中的Thauera的組成，不僅能夠快速的檢測廢水處理裝置的運行狀態，還能夠預測系統的發展、防止系統惡化。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法。使其能夠快速、高通量檢測廢水處理裝置中重要菌群的分子。
本發明采用在微生物生態學領域廣泛使用的PCR-DGGE技術結合主成分分析(PCA)，從重要功能菌群組成的角度來監測一個廢水處理裝置的運行狀態，并預報它的發展趨勢。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明的具體步驟如下①.從廢水處理裝置中采集生物膜樣品，并提取基因組DNA；提取樣品的基因組DNA，具體為從廢水處理裝置中采集生物膜樣品經過預處理，然后提取基因組DNA。
②.使用Thauera特異性引物進行PCR擴增，并使用16s rDNA v3區通用引物進行嵌套PCR擴增；所述的Thauera特異性PCR擴增使用的是特異性引物Thau832與通用引物P0，然后以此PCR擴增產物，再用16s rDNA v3區通用引物P2和P3進行擴增以得到能用于DGGE分析的DNA片段。
所述的PCR擴增，是指進行嵌套PCR進行擴增，具體為先用Thauera特異性PCR，其體系包括特異性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16srDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)進行第一輪PCR擴增。第一輪PCR產物稀釋后作為16S rDNA v3擴增的模板，進行V3區PCR擴增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，獲得Thauera屬專一性的16S rDNA的V3區DNA擴增產物。
③.使用DGGE對擴增產物進行分離；所述的使用DGGE對擴增產物分離，是指變性劑梯度為40-58％的聚丙烯酰胺膠(濃度為8％)被用于對這些屬于Thauera的克隆v3片段及A2樣品的Thauera特異性PCR的產物進行分析。
④.構建16s rDNA全長克隆文庫，來確證本方法的可靠性；所述的16s rDNA全長克隆文庫，通過16s rDNA全長克隆文庫的辦法，證實這種檢測廢水處理系統中的重要菌群Thauera的種群特異性PCR-DGGE方法。
⑤.結合主成分PCA分析來監測工業廢水處理裝置的運行情況。
所述的PCA分析，利用Image J對DGGE膠進行數字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用Matlab 7.01對這些數據做PCA分析。
本發明通過16s rDNA全長克隆文庫的辦法，證實了這種檢測廢水處理系統中的重要菌群Thauera的種群特異性PCR-DGGE方法是可靠而高效的。該模型可用于追蹤監測廢水處理系統中的重要功能菌群Thauera的組成，并由此來迅速判斷裝置的運行情況，并且利用PCA建立的分析模型來預測裝置的發展趨勢，以預防系統走向崩潰。
圖1 Thauera特異性V3區PCR擴增產物和屬于Thauera克隆的DGGE分析示意中A2A2池的Thauera特異性PCR產物；mThauera的13個克隆的混合物；1-13Thauera的13個不同的克隆圖2焦化廢水處理裝置的COD去除率示意中1-6為采樣時間點圖3 6個采樣時間點的Thauera特異性V3區PCR擴增產物的DGGE分析示意4 DGGE膠的主成分分析示意中1-6A2和O2池每周的六個采樣時間點具體實施方式
下面通過實例進一步描述本發明。Thauera屬的種群特異性PCR-DGGE方法的建立及其應用(1)樣品采集及DNA提取生物膜樣品采自上海某焦化廠廢水處理裝置的缺氧池和好氧池。樣品采集后先進行預處理樣品中加5倍體積的TENP緩沖液(50mM Tris，20mM EDTA，100mMNaCl 0.01g/ml PVP，pH10)，加玻璃珠充分旋渦5min。10000g，4℃離心5min，收集沉淀。加5倍體積的PBS緩沖液(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，pH7.4)，旋渦，收集沉淀(重復二次)。加PBS緩沖液懸浮，分裝到10ml的離心管中，每管加4ml懸浮液和1ml甘油，旋渦均勻。然后再進行DNA提取，提取方法如下將前處理好的樣品分裝在離心管中，離心，收集50mg樣品，加200μl提取緩沖液(100mM Tris，100mM EDTA，200mM NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH 8.0)，加2粒玻璃珠，漩渦5min，使樣品充分懸浮。加入200μl SDS緩沖液(2％SDS)，上下顛倒5min，放置冰上。樣品進行13000g離心10min，用200μl的移液器將上清液轉移到一個新的epp管內。加入400μl平衡酚，顛倒離心管混勻樣品。然后進行13000g離心15min，用200μl的移液器小心將上清液轉移到一個新的離心管內。同樣方法用200μl平衡酚和200μl氯仿、400μl氯仿各抽提一次，加入0.6倍體積異丙醇，上下顛倒混勻。樣品于-20℃沉淀過夜，14000g離心樣品20min，倒掉上清液。用70％乙醇洗滌兩次，冷凍干燥30分鐘。用100μl ddH2O懸浮樣品。加入1.5μl RNaseA(20mg/ml)37℃消化20min。得到的DNA使用V-Gene PCR Clean-up Kit進行純化，并使用DNA濃度儀DyNA QuantTM200 fluorometer(Amersham Pharmacia Biotech，USA)測定濃度，并在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢查其大小。
(2)Thauera特異性PCR擴增及嵌套的16s rDNA v3區擴增Thauera特異性PCR的(25μl)體系包括特異性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16s rDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)各10pmol，dNTP各5mM，模板DNA 20ng，Taq DNA聚合酶1U(Promrga，USA)以及配套的1×緩沖液及50mmol MgCl2。其PCR程序如下95℃4min；94℃ 1min變性，60℃復性1min，72℃延伸1min，共30個循環；然后再72℃延伸6min。對此PCR產物稀釋后作為v3擴增的模板，進行嵌套PCR擴增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3’)，PCR擴增體系及程序采用Muyzer等人的方法。50μL PCR反應體系中包含2.5mM的dNTPs 4μL，10′PCR反應緩沖液5μL，25pmol/μ L的引物各1μL，10ng的模板，1u的Taq DNA(TaKaRa公司)聚合酶，高純水補足50μL。PCR采用thermocycler PCR系統(PCR Sprint，Thermo electron，Corp.，UK)反應的程序為94℃變性4min，然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共20個循環，最后72℃延伸6min。
(3)使用DGGE方法對v3序列進行分析變性梯度為40-58％的DGGE膠(濃度為8％)被用于對這些屬于Thauera的克隆v3片段及A2樣品的Thauera特異性PCR的產物進行比較分析。發現克隆文庫中的13個不同v3序列在膠上分成了11條帶，A2樣品中出現了4條主要條帶，而且在克隆文庫中都有相同遷移率的條帶(圖1)。這說明雖然用這種特異性PCR-DGGE的辦法監測到的條帶相對克隆文庫少，即它的靈敏度相對較低，但是它的特異性較高。因此它是一種可以信賴的，能夠用于快速檢測復雜細菌群落中的重要功能菌群-Thauera。
(4)Thauera特異性PCR-DGGE方法在工業廢水處理裝置中的應用使用這個Thauera特異性PCR-DGGE的方法，我們對一個工業廢水處理裝置中的Thauera屬的組成進行了6周的追蹤監測。在第4周采樣后，裝置的回流泵被關閉，其COD去除效率開始下降(圖2)。發現其組成比較簡單，主要為4條條帶，而且來自不同時間及缺氧池和好氧池樣品間的差異很小(圖3)。利用ImageJ對DGGE膠進行數字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用matlab 7.01對這些數據做PCA分析。結果如圖4所示。發現在運行狀況不好，COD去處率明顯下降的采樣時間6時，它在PCA上的空間分布明顯不同于正常時。這說明這種Thauera特異性PCR-DGGE能夠快速而且正確的檢測到廢水處理裝置中Thauera的組成的變化。
綜上所述，使用這種Thauera特異性PCR-DGGE方法對廢水處理裝置檢測的結果表明，這種方法能夠快速的分析其中的重要功能菌群-Thauera屬。以上結果證明，用本發明對廢水處理裝置中的Thauera屬的組成進行監測，不僅是可行的，而且是準確可靠的，它的變化能夠很好的體現一個廢水處理裝置的運行狀態。
權利要求
1.一種工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征在于，具體步驟如下①.從廢水處理裝置中采集生物膜樣品，并提取基因組DNA；②.使用Thauera特異性引物進行PCR擴增，并使用16s rDNA v3區通用引物進行嵌套PCR擴增；③.使用DGGE對擴增產物進行分離；④.構建16s rDNA全長克隆文庫，來確證本方法的可靠性；⑤.結合主成分PCA分析來監測工業廢水處理裝置的運行情況。
2.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的提取基因組DNA，具體為從廢水處理裝置中采集生物膜樣品經過預處理，然后提取基因組DNA。
3.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的Thauera特異性PCR擴增使用的是特異性引物Thau832與通用引物P0，然后以此PCR擴增產物，再用16s rDNA v3區通用引物P2和P3進行擴增以得到能用于DGGE分析的DNA片段。
4.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的PCR擴增，是指進行嵌套PCR進行擴增，具體為先用Thauera特異性PCR，其體系包括特異性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16s rDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)進行第一輪PCR擴增。第一輪PCR產物稀釋后作為16S rDNA v3擴增的模板，進行V3區PCR擴增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，獲得Thauera屬專一性的16S rDNA的V3區DNA擴增產物。
5.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的使用DGGE對擴增產物分離，是指變性劑梯度為40-58％的聚丙烯酰胺膠(濃度為8％)被用于對這些屬于Thauera的克隆v3片段及A2樣品的Thauera特異性PCR的產物進行分析。
6.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的16s rDNA全長克隆文庫，通過16s rDNA全長克隆文庫的辦法，證實這種檢測廢水處理系統中的重要菌群Thauera的種群特異性PCR-DGGE方法。
7.根據權利要求1所述的工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法，其特征是，所述的PCA分析，利用Image J對DGGE膠進行數字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用Matlab 7.01對這些數據做PCA分析。
全文摘要
一種工業廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測方法。具體步驟(1)從廢水處理裝置中采集生物膜樣品，并提取基因組DNA；(2)使用Thauera特異性引物進行PCR擴增，并使用16s rDNA v3區通用引物進行嵌套PCR擴增；(3)使用DGGE對擴增產物進行分離；(4)構建16s rDNA全長克隆文庫，來確證本方法的可靠性；(5)使用本方法結合主成分分析(PCA)來監測工業廢水處理裝置的運行情況。本發明可用于追蹤監測廢水處理系統中的重要功能菌群Thauera的組成，并由此迅速判斷裝置的運行情況。本發明還可以預測裝置的發展趨勢。
文檔編號C12Q1/04GK1995389SQ200610116628
公開日2007年7月11日 申請日期2006年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者趙立平, 毛躍建, 張曉君, 嚴興 申請人:上海交通大學