提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7^*基因及其應用的制作方法

專利名稱：提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7^*基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，特別涉及一種提莫菲維小麥高分子量 谷蛋白077*基因以及基于此基因通過生物技術方法改良小麥品質的應用。
背景技術：
小麥胚乳貯藏蛋白(主要包括醇溶蛋白和谷蛋白)在面團中起"骨架"作 用，并賦予面包、面條以及其他專用食品所需的粘彈性，其中高分子量谷蛋白 亞基(HMW-GS)組成高分子聚合體，賦予面團彈性(Payne， 1987; Shewry etal.， 1992)。目前己清楚HMW-GS的編碼基因位于第一部分同源群染色體長臂靠近 著絲點的Glu-Al、 Glu-Bl和Glu-Dl三個位點上，每個位點有兩個緊密連鎖基 因，分別編碼一個分子量大的x-型亞基和分子量較小的y-型亞基。普通栽培小 麥的Glu-Al往往只編碼x-型一種亞基，y-型亞基基因則沉默。最近的研究表明 來自小麥近緣種A基因組含有編碼y-型亞基的活性基因。同時，來自其他染色 體組型(如C， K， R, S, T, U)等高分子量麥谷蛋白亞基基因也相繼發現，大大豐富 了谷蛋白基因庫，為通過基因工程手段改良小麥品質提供了優質基因資源。
小麥屬具有A、 B、 D、 G等染色體組，目前采用染色體組分類方法，把小 麥屬分為5個種，即一粒小麥(r mo"ococcwm， 2n=14， AA )、圓錐小麥(7: ft^g^w附，2n=28，AABB)、提莫菲維小麥(7: "mo/ / eev/, 2n=28，AAGG)、普通 小麥(7:ae幼Vww， 2n = 42， AABBDD)和茹可夫斯基小麥(7: z/^A:ow^W， 2n=42， AAAAGG)。提莫菲維小麥是含有G基因組的重要資源材料，是六倍體茹可夫 斯基小麥G基因組的供體。研究顯示，G基因組也可能含有類似Glu-Al、Glu-Bl 和Glu-Dl的高分子量麥谷蛋白亞基的編碼基因位點。李保云等(2002)用 SDS-PAGE分析種子蛋白泳帶后從7個品種中發現了 8個Glu-1G等位變異，這 說明在提莫菲維小麥中蘊含著豐富的高分子量麥谷蛋白基因資源。
提莫菲維小麥是一種優良的種質資源，對銹病、散黑穗病、腥黑穗病和白 粉病具有較強的抗性，被育種家廣泛用于小麥抗病育種的抗源。其蛋白含量也 很高，種子蛋白含量達19-22%，遠遠超過普通栽培小麥的10-14%。提莫菲維 小麥不僅是優良的種質資源，至今在非洲地區仍然具有一定的種植面積。目前, 從提莫菲維小麥中僅分離了兩個高分子量麥谷蛋白亞基基因(Wanetal.， 2002) 且均來自于A基因組，而關于Gx或Gy型HMW-GS基因的克隆還未見報道。
由于小麥高分子量谷蛋白亞基對品質具有重要作用，國內外都試圖克隆優 質HMW-GS基因，然后通過基因工程定向改良小麥品質，這已成為近10多年 來的研究熱點。迄今為止，在普通小麥中已有10多個基因被克隆和測序(張 發云等，2002)，并在轉基因優質品種的培育方面取得重要進展。從提莫菲維 小麥中克隆新的基因對小麥品質的改良具有重要的現實意義。

發明內容
本發明的目的在于從提莫菲維小麥中克隆得到一個編碼高分子量谷蛋白亞 基的基因Gy7、通過基因工程技術，可培育優質轉基因小麥，從而改善小麥品 質。
本發明采用的技術方案是 一種提莫菲維高分子量谷蛋白的077*基因，其 特征在于該基因具有序列表中SEQ ID NO. 1第1位到2202位所示的核苷酸序 列。
上述的提莫菲維高分子量谷蛋白0乂7*基因具有的核苷酸序列還可以是序 列表中SEQIDNO. 1第1位到2202位中因一個或多個核苷酸的缺失、插入或替換 而形成的具有功能活性的等位基因。
提莫菲維小麥的Gy7t基因編碼的小麥高分子量谷蛋白亞基，它是具有序列 表中SEQIDNO.2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是SEQIDNO. 2的氨基 酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDN0.2衍生的蛋白質。
目前分離谷蛋白基因主要采用建庫篩選和PCR方法，本發明通過等位基因 特異PCR技術，結合SDS凝膠電泳和HPLC方法，在提莫菲維中分離了一個 新的HMW-GS Gy7^^亞基及其編碼基因Gy7*，這是迄今為止首次從G基因組 中克隆到的高分子量麥谷蛋白基因，為今后進一步發掘G基因組優質麥谷蛋白 等位基因提供參考和依據。
基因結構特征
提莫菲維小麥CWI17006高分子量谷蛋白亞基的SDS凝膠電泳和高效毛細 管電泳鑒定圖譜分別如圖1、圖2所示。CWI17006只有三條HMW-GS帶，經 RP-HPLC鑒定均由單一亞基組成。為了克隆編碼HMW-GSGy7^^的基因，根據 蛋白質N-端保守序列和已發表的基因序列設計AS-PCR引物，其中引物Pl+P2 用于擴增Gy7"^基因的編碼區(圖3)，引物P3+P4用于擴增去掉信號肽的成熟 蛋白的核苷酸序列，用于原核表達鑒定克隆基因的功能活性。
克隆測序后獲得了Gy7t基因2202bp如序列表SEQIDNO. 1所示的編碼 區全序列。由DNA序列推導出的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。 該氨基酸序列顯示，Gy7*亞基與其它y-型HMW谷蛋白亞基結構相似，前面 是21個信號肽殘基，然后與其它HMW谷蛋白亞基一樣，有三個明顯的結構 區域104個殘基的非重復N-端區、565個殘基的中央重復區和42個殘基的 非重復C-端區。Gy7*亞基有7個半胱氨酸殘基N-端5個、C-端1個、重復 區末端靠近C-端1個。重復區由六肽(PGQGQQ)和九肽(GYYPTSLQQ)組 成的典型y-型HMW谷蛋白結構(無x-型亞基的三肽重復)。
0丫7*基因重復區內有一個稀有的核酸內切酶位點，即Mfe/(CATATG)。與 其他10個已知的y-型基因的氨基酸序列比對發現，Gy7^^基因編碼的氨基酸序 列具有明顯變異，即使在相對保守的N-和C-末端區出現了 8個氨基酸殘基 的代換，分別是18 (Pro代換為Ser)， 73 (Pro代換為Leu)， 82 (Gly或Arg 或Val代換為Ser)， 669 (Asp代換為Asn)， 680 (Ala或Thr代換為Met), 691 (Pro代換為Ser)， 705 (Asp代換為Glx), 706 (Ala或Glu代換為Pro)。另 外在重復區出現了 17個氨基酸殘基的代換。0乂7*重復區內發現了兩個罕見的 大片段肽段(分別含45和12個氨基酸殘基)插入，均由六肽或變異的六肽構 成，是導致該y-型基因序列偏長的主要原因。
位于Gy7"^亞基重復區的半胱氨酸殘基具有與By8和By9亞基相似的位 置，而后兩者的可變區半胱氨酸殘基已經被證明參與分子間鉸鏈(Shewry et al., 1997)。另外，基因長度的適度增加有利于改善面粉的加工品質(Anderson etal.， 1996)。 Bdton (1999)和Tilley et al. (2001)認為谷胺酰胺和雙酪胺酸能形成 分子間氫鍵并有利于面粉加工品質的改善。由此可見，基因長度的增加有可能 通過增加分子間氫鍵的數量來提高面粉的加工品質。因此，Gy7*基因很可能 是一個具有潛在應用價值的優質基因。
經過序列比對和系統進化分析，Gy7+基因與Ay型基因的差異較大，而與 By和Dy型基因具有較大的相似性，可以推斷該基因是由G基因組上的Glu-l 位點編碼的，因此將該基因命名為Gy7*。原核表達和Western-blotting檢測顯 示Gy7f基因可以在五.co/Z中高效表達(圖4、圖5)，具有功能活性。
HMW-GS對面包烘烤品質所起的重要作用已被眾多的研究者所證實 (Wrigley， 1996)。改善麥谷蛋白的高分子量亞基構成，將是改良我國小麥品種 烘烤品質的重要途徑。研究顯示，通過優質谷蛋白基因(包括從提莫菲維獲得 的優質谷蛋白基因)的轉化，培育轉基因小麥可顯著改善面粉品質。


圖1 提莫菲維CWI17006高分子量谷蛋白亞基的SDS-PAGE鑒定，
圖中1.中國春，
2. CWI17006(箭頭所示為Gy7*亞基)； 圖2提莫菲維CWI17006高分子量谷蛋白亞基的RP-HPLC鑒定，
圖中
a. 高、低分子量谷蛋白亞基區分別如圖中al和a2所示，Gy7^^亞基的 出峰時間為27.19分鐘(用箭頭標出)；
b. 泳道1:CWI17006的種子蛋白；泳道2:對應圖a中高分子量區第一 個峰；泳道3:中箭頭標出的帶對應圖a中Gy7^^亞基。
圖3兼并性引物P1+P2擴增產物示意圖，圖中，
1. lkb plus DNA ladder Marker
2. Gy7*基因(箭頭所示)
圖4 ￡. co"表達蛋白SDS-PAGE鑒定圖譜，其中，融合蛋白包含一個含 有His標簽的肽段，約5,726 Da，其電泳遷移率稍低于泳道2中的Gy7t亞基， 圖中，
1. 中國春
2. CWI17006高分子量谷蛋白亞基，倒三角所指為。77*亞基
3. 誘導的融合蛋白(箭頭所指) 4:空載體對照
圖5 Western-blotting檢測融合蛋白，圖中，
1. CWI17006高分子量谷蛋白亞基
2. 融合蛋白(箭頭指出)
具體實施例方式
實施例1提莫菲維小麥CWI17006髙分子量谷蛋白亞基的鑒定
(1) 植物材料提莫菲維CWI17006
(2) SDS-PAGE電泳樣品制備
半粒種子扎碎后將面粉放入lml離心管，然后加入0.3ml 55%異丙醇，渦 旋l分鐘，65匸水浴振蕩30分鐘，10000rpm離心IO分鐘，棄上清。上述處理 面粉的操作重復3次，用濾紙吸去殘余上清，將醇溶蛋白去除干凈;加0.1ml55% 異丙醇，0.08M Tris-HCL， pH8.0，含1%二硫蘇糖醇(DTT,新鮮加入)，充分 混合，65。C水、浴充分振蕩30分鐘；加O.lml 55。/。異丙醇，0.08M Tris-HCL， pH8.0， 含1.4%新鮮混合的4-乙烯基吡啶，混合并在65X:水浴中振蕩30分鐘，12000rpm 離心10分鐘；將0.06ml上清轉入新管，力Q 0.06ml樣品緩沖液(2%SDS， 0.02% 溴酚藍，0.08MTris-HCl， pH8.0， 40%甘油)，65。C水浴中振蕩30分鐘，12000rpm 離心10分鐘，作SDS-PAGE上樣用。
(3)用兩種方法分別對HMW谷蛋白亞基進行鑒定
① SDS-PAGE電泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3電泳槽、4%濃縮膠、 12%分離膠，磷酸-甘氨酸緩沖液系統，10mA電泳2小時，0.1%考馬斯亮藍R-250 染色，25%甲醇和乙酸7%脫色，電泳圖譜如圖l所示。
② 高效毛細管電泳(HPCE)采用Bio-Rad公司生產的BioFocus 3000型高 效毛細管電泳儀系統。彈性石英毛細管柱由河北省永年光導纖維廠生產，內徑 為50nm、長度為25.5cm (檢測長度20cm)，外層涂有聚酰亞胺保護層，內壁 均未涂層。電泳緩沖液為100mm磷酸一甘氨酸緩沖液(pH2.50，含20%乙 氰和0.05%羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。毛細管柱沖洗方法新毛細管預處 理為H20 5min; 1MNaOH 5min; H20 5 min; 1MH3P04 5 min; Buffer 30min。樣品間沖洗程序1MH3P04 4 min; H202 min; Buffer3 min。電
泳參數運行電壓12.5 kV，毛細管溫度35°C，樣品槽溫度15°C，進樣
8kV，5sec，電極由+向-,電泳圖譜如圖2-a所示。分別回收每個峰值對應 的蛋白，SDS-PAGE鑒定蛋白組成如圖2-b。
實施例2提莫菲維小麥CWI17006高分子量谷蛋白Gy7+基因的分離與鑒定
(1)兼并性引物設計
參考前人發表的引物序列(Liu et al.， 2003; Feng etal.， 2004)以及相關基 因保守序列設計兼并性引物，用以擴增y-型HMW亞基基因的編碼區。編碼區 AS-PCR引物序列如下
HMW-1: 5 ，-ATGGCTAAGCGGC/TTA/GGTCCTCTTTG-3'.
HMW-2: 5，國CTATCACTGGCTA/GGCCGACAATGG國3'.
(3)種子基因組DNA提取
取20mg砸碎的種子提取gDNA，于L5ml eppendorf離心管內，加入100 P 1提取緩沖液(200mM Tris-Hcl， pH7.5， 288mM NaCl， 25mM EDTA, 0.5% SDS) 浸解。再加入700lU提取緩沖液，渦旋20sec后，12000rpm離心5min。取上 清，加入700ul氯仿:異戊醇(24 : 1)， 12000rpm離心10min。保留上清，加 入700lU異丙醇，沉淀2min， 12000rpm離心15min，棄上清，干燥后向沉淀 中加入40nlTE緩沖液(10mM Tris-HCl， pH8.0， lmM EDTA ， pH8.0)，溶解 24小時后，電泳檢測DNA濃度，-20°0保存。
(4) HMW-GS編碼基因的PCR擴增
引物由上海Sangong公司合成；PCR用酶購自TaKaLa寶生物工程公司； PCR回收Kit購自上海Sangong公司；T-Vector連接Kit為Promega產品。
PCR反應體系
①編碼區PCR體系和程序 A. 25^1體系
LaTaq酶 1.25U
2XGC Buffer II (MgCl2+Plus) 12，
dNTP 0,2mM
每條引物 0.25pM
模板DNA 50ng
滅菌蒸餾水補充至 25^1
B.反應程序94'C變性2分鐘；94'C變性45秒，6(TC退火1分鐘，72°C 延伸2分鐘，共35個循環；最后72"C延伸10分鐘。用1%瓊脂糖膠檢測PCR產物。
PCR產物的回收
① 將所需的電泳凝膠切下放于1.5ml離心管中，加入70(Hd Binding Buffer, 并于50'C-6(TC水浴使瓊脂糖凝膠充分溶解；
② 將UNIQ-10柱放入2ml收集管中，將凝膠溶解物轉移到UNIQ-10柱中， 室溫放置2分鐘后以8000rpm離心1分鐘；
③ 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集 管中，加入500ul Binding Buffer, 8000rpm離心1分鐘；
取下UNIQ-10柱，去掉管中液體，加入500ul Wash Buffer, 8000rpm離
心l分鐘；重復一次；
⑤取下UNIQ-10柱，去掉管中液體，將UNIQ-10柱放入同一收集管中， 讓離心管蓋開著，室溫12000 rpm離心1分鐘； 將UNIQ-10柱放入一新1.5ml離心管中，在柱子膜中央加30pl水到 UNIQ-10柱中，室溫或37"C放置2分鐘；
⑦室溫12000 rpm離心1分鐘后即得到回收產物，可立即使用或-20。C保存。
(5) HMW-GS編碼基因的PCR克隆和鑒定
① 連接反應體系
2*rapid ligation buffer 5 fxl
pGEM-T Vector 0.5 T4 DNA Ligase 1 |il
PCR回收產物 3.5 pi
共10ul體積，4。C連接過夜。
② 連接產物轉化大腸桿菌DH-5ci感受態細胞
A. 大腸桿菌感受態細胞DH-5 a的制備劃板復壯宿主菌后，挑一單菌落 于20ml的LB (Tryptone 10g/L; Yeast extract 5g/L; NaCl 5g/L; pH7.0)液體培 養基中，37-C搖至OD6W=0.6，取出置于冰上20分鐘。將菌液移至一滅菌的50ml 離心管中，4°C， 4000rpm離心10分鐘，回收細胞。將細胞沉淀以10ml冰預冷 的0.1mol/L的CaCl2重懸，并置于冰上30分鐘。4°C， 4000rpm離心10分鐘， 棄上清，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸菌體，加入滅菌甘油至終濃度 30%，分裝后存于-70匸。
B. 重組質粒向宿主菌的轉化取100ul DH-5 a感受態細胞0.5 ml的離心管 中，加入1(^1的連接產物并輕旋以混勻內含物，置于冰上30分鐘。42"C熱激 90秒，置于冰上l-2分鐘。加入400^1 37。C預熱的LB培養基，37°C 150rpm， 搖培45分鐘。取150ul菌液鋪于涂有IPTG和X-Gal的LB平板上(Amp 80ul/ml)， 37'C倒置培養12-16小時。
③ 質粒的提取
A. 挑取單菌落于10ml LB (Amp 80pl/ml)液體培養基，37""C培養過夜。 將菌液移至1.5ml的離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清，收集菌體；
B. 加入10(Hil冰預冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mMTris-HClpH8.0、10mM EDTApH8.0)，充分懸浮菌液，室溫放置5分鐘；
C. 加入新鮮配制的200ul的溶液n (0.2MnaOH、 1%SDS),輕搖菌液，冰 上放置5分鐘；
D. 加入15(Hd冰預冷的溶液ni (60ml5M乙酸鉀、11.5ml冰乙酸、28.5ml
雙蒸水)清搖菌液，冰上放置5分鐘，12000rpm離心10分鐘，移上清至一新 離心管；
E. 加入等體積的酚/氯仿(1:1)抽提一次，12000 rpm離心5分鐘，移上 清至一新離心管；
F. 加入2倍體積的無水乙醇，振蕩，室溫放置5分鐘，12000 rpm離心10 分鐘；
G. 用75%乙醇洗滌沉淀兩次，每次12000 rpm離心5分鐘；
H. 吹干，溶于滅菌雙蒸水或TE緩沖液(含0.02mg/mlRNase)，做電泳檢測。
④重組質粒PCR法鑒定與序列測定
A. 按前述PCR反應體系和程序進行重組質粒鑒定；
B. 經鑒定的質粒進行DNA序列測定，由TaKaRaBiotech公司完成，得到 7Gy7*基因共2202bp，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的編碼全序列，該核 苷酸序列包括一個雙終止密碼子的可讀框(編碼732個氨基酸殘基)。
實施例3提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7+基因的表達與鑒定
(1) PCR產物的純化回收
提莫菲維小麥CWI17006的基因組DNA為模板，擴增Gy7^-基因的PCR產 物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳(穩壓50v) l小時，在紫外燈下將DNA條 帶切下，用DNA凝膠純化試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit, Takara)
將特異擴增條帶純化回收。
(2) PCR產物和表達載體PET-30a(Novagen)的雙酶切
根據測序結果設計引物去掉信號肽，并在Forward和Reverse弓l物的5' 端分別加上^o/和酶切位點，使擴增片段能插入正確的閱讀框。PCR 擴增程序參考實施例2。
Forward: 5，-CTAGAATTCGAAGGTGAGGCCTCC誦3， Reverse: 5,曙AATCTCGAG CTATCACTGGCTAGCCG-3，
將回收的PCR產物和PET-30a質粒都用五co/ /(TaKaRa)及^7 o /(TaKaRa) 進行雙酶切，3小時后酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠分離，再用用Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)回收酶切產物。
(3) 連接與鑒定
將待插入片段的雙酶切產物和PET-30a質粒的雙酶切產物按質量比3 : 1 的比例混合，加入T4DNA連接酶(Promega) , 4"連接，反應過夜。
取連接產物加入大腸桿菌DH-5a感受態中進行轉化，并進行藍白篩選和卡 那霉素(Kan)抗性篩選，挑白色單菌落于含Kan(10ug/ml)的LB培養基中在37°C 下培養過夜，堿裂解法小量制備質粒，取質粒進行酶切鑒定(EcoRI和XhoI)， 以確定插入片段己連接到表達載體上。
(4) 轉化及蛋白質表達
取已制備的含插入片段的PET-30a質粒轉化大腸桿菌BL-21 (DE3)感受 態中，挑取白色單菌落于含Kan(10ng/ml)的LB培養基中培養過夜獲得飽和培 養物，取飽和培養物100^1加入10ml含Kan(10ug/ml)LB培養基中37°C ， 150rpm 搖培約4小時，直至006。。=0.6，向其中加入IPTG (異丙基硫代半乳糖苷)使 其在菌液中終濃度為lmmol/L，對培養物進行誘導，在相同條件下繼續培養3 小時。
(5) 表達蛋白提取與Western-blotting鑒定
① 表達蛋白提取誘導培養結束后，取1.8ml菌液于2.0ml印pendorf離心 管中，10000 rpm離心5min，去上清，加入120^1異丙醇，充分渦漩后，加入 DTT，使其終濃度為1°/。， 65。C水浴60min， 12000rpm離心5min，取上清，加 入等體積lxLoadingbuffer， 65。C水浴30min，取10^1進行SDS-PAGE電泳。
② Western-blotting雜交
由于保留了 PET-30a表達載體插于位點上游的His標簽，故原核表達產物 為含有六個組氨酸的融合蛋白。利用特異性高的抗His標簽的單克隆鼠抗進行 Western-blotting雜交，可以確定0丫7*基因編碼的蛋白己經表達。
實施例4提莫菲維小麥高分子量谷蛋白677*基因的應用
通過基因表達和免疫印跡雜交鑒定，證實0丫7*基因可在Eco//高效表達， 并具有功能活性。利用基因工程技術對高分子量谷蛋白077*基因加以轉移利 用，如通過基因槍、花粉管通道、農桿菌轉化等方法轉化該基因，進而培育品 質優良的轉基因小麥。
序列表
<160>2
<210>1
<211>2202
<212>DNA
<213>小麥屬提莫菲維小麥(7h力'cww "/nop/jeev/)
<400>1
3tggct33gcggttggtcctctttgcgsc3gtagtcatcgccctcgtggc50
tctcsctgccgctgaaggtgsggcctccaggcaactacagtgtgagcgcg100
agctccaggagsgcccgcttgaggcatgccggcaggtcgt150
ttggccggtcggctgccatggsgcscggggctccagatgcgatgctgcca200
gcagctccgagatgttagcgccaagtgccgccccgtcgccgtcagccaag250
tcgc33gscsatstgagcasaccgcggtgctgcccaagggcggait ccttc300
taccctagcg3g3CC3C3CCct ccaacaagt33t3ttttg350
gggaacatcttC3C333C3gtsc33gggtsttacccaagcgtS3cttctc400
ctcsgcsggggtC3t3tt3tccaggccaagCttCtCC3C33cagccag33450
casgggcs3gasccaggc3tatggcaaggaccgggacssgggcaacaagg500
gt3Ct3CCC3acttctctgc3gc3gtcsggcaagggtact550
3CCC3tcttctctgcsgcagccaggacaagggcaacagscaggacaaggg600
caacsagggt3Ct3CCC3tc113t ctgcagcsgccaggac650
gataggacsaggtactacccaacttctccgcagcacccsg700
gacaaaggcac33g3gc33caaataggaca750
ccsgg3C33tggc3ac3sgggt3Ctcc33CttCtCC3C33C3gccagg800
caaccaggac33tggC33C3aacaggacaagggcsscaac850
gcaacaatcsgg3cssgggc900
g3aaggcascac3gg3caggggC33C333t950
caaca3t caggacasgtgcat3tCC33Ctt1000
Ctcaggsc33tc1050
ggac33gggcCt3CCC33Cttctc3gc3gc3gc33ggscs1100
gggcsct accC3gcttctcagcagcagccaggacssgggc1150
agcatgggctctacccs3Cttctcagcagcagccaggacaagggcaac331200
gggcsct accC33C3tCCC3gcagcaggcaggacaagggcaacaagggca1250
ctscccagcttctctgc3ggagccaggacagggcactccc1300
cagcttctttgC33C33CC3ggaaaagggcaacaagggcact3cctsgct1350
tCtCt3C33Cagctaggacaagggcaacaa3tsgg3csgc1400
gC6L3C33CC3gg3casgggc1450
gggcaacaagggtactatcc33Ctt3tCC31500
caacsgccagC33tcgC33C1550
gg3tsctaccC33Cttctctgcaacagccaggacaagggc1600
33ca3gggc3ctacccagcttctctacagcagccaggsca3ggsc3tcc31650
ggacsssggc3C3sgggcs31700
3cc3ggsc33gggcaagaagggtactatccgacttctccgcagcagccsg1750
gacaagggcaC33gggcaac33gggtset3CCC33CttCt1800
ccgcsgcsgccsgg3C33gggcsscaacgaggacaagggc1850
ctgcccsacttctccgcaacagcgcaacaaccaggscaag1900
gCC33C333CC33C33CC3ggacaagggca3C33gggt3C1950
t3CCC33Cttct ctgcsgcagt caggacaagggcsacagt2000
gcaacaatccggscsaggacaccagccaggacaagggcagcaatcsggsc2050
sggctacaacatgttagcgcggsgc3gca32100
atggccagcccas3ggtggcaaaggcacagcagtccgcgacacagctgcc2150
aataatgtgtcggstggaggggggcgaaccsttgtcggctagccsgtgat2200
2202
<210>2 <211>732
<212>PRT
<213>小麥屬提莫菲維小麥(7Hricww riwopAeev/)
<400>2
Met Ala Lys
Val Ala Leu Thr
Arg Leu Val Leu Phe Ala
Glu Gly
Ala
Glu
Ala 20
Cys Glu Arg Glu Leu Gin Glu Ser Pro 35
Val Val Asp Gin Gin Leu Ala Gly Arg 50
Leu Gin Met Arg Cys Cys Gin Gin Leu 65
Cys Arg Pro Val Ala Val Ser Gin Val 80
Thr Ala Val Leu Pro Lys Gly Gly Ser 95 Gin 110 Gin 125 Tyr 140 Pro 155 Pro 170 Pro
Thr Pro Leu Gin
Ser Gin Thr Val
Leu Gin Gin Val
Gin Gly Ser Gin Gly Gin Gin Gly Tyr Gin Gly Tyr
Tyr Glu Tyr Tyr
Gly
Pro
Gly
Tyr Tyr Gly Gin lie Trp
Pro
Ala
Gin
Thr Ser Leu Gin
Ser Ser Leu Gin
Thr Val Val lie Ala Leu 10 15 Ala Ser Arg Gin Leu Gin 25 30 Leu Glu Ala Cys Arg Gin 40 45 Leu Pro Trp Ser Thr Gly 55 60 Arg Asp Val Ser Ala Lys 70 75 Ma Arg Gin Tyr Glu Gin 85 90 Phe Tyr Pro Ser Glu Thr 100 105 lie Phe Trp Gly Thr Ser
115 120 Ser Val Thr Ser Pro Gin
130 135 Ser Pro Gin Gin Pro Glu
145 150 Gly Pro Gly Gin Gly Gin
160 165 Gin Ser Gly Gin Gly Gin
175 180 Gin Pro Gly Gin Gly Gin 185190195
GinThrGlyGinGly 200GinGinGlyTyrTyr 205ProSerTyrLeuGin 210
GinProGlyGinGly 215GinGinlieGlyGin 220GlyGinGinGlyTyr 225
TyrProThrSerPro 230GinHisProGlyGin 235ArgGinGinProArg 240
GinGluGinGinlie 245GlyGinGluGinGin 250ProGlyGinTrpGin 255
GinGlyTyrTyrPro 260ThrSerProGinGin 265ProGlyGinGlyGin 270
GinProGlyGinTrp 275GinGinThrGlyGin 280GlyGinGinProLys 285
GinGluGinGinSer 290GlyGinGlyGinGin 295ThrGlyGinProGly 300
GluAxgGinGinPro 305GlyGinGlyGinGin 310ThrGlyGinGlyGin 315
GinlieGluGinGlu 320GinGinSerGlyGin 325ValGinGinGluTyr 330
TyrProThrSerPro 335GinLysProGlyGin 340GlyGinGinProGly 345
GinSerGinGinPro 350GlyGinGlyGinGin 355GlyTyrTyrProThr 360
SerGinGinGinGin 365GlyGinGlyGinGin 370GlyHisTyrProAla 375
SerGinGinGinPro 380GlyGinGlyGinHis 385GlyLeuTyrProThr 390
SerGin■ GinGinl Pro 395GlyGinGlyGinGin 400GlyHisTyi■ ProThr 405
SerGinGinGinAla 410GlyGinGlyGinGin 415GlyHisTyrProAla 420
SerLeuGinGluPro 425GlyGinGlyGinGin 430GlyHisSerProAla 435
SerLeuGinGinPro 440GlyLysGlyGinGin 445GlyHisTyrLeuAla 450
SerLeuGinGinLeu 455GlyGinGlyGinGin 460lieGlyGinProGly 465
GinArgGinGinPro 470GlyGinGlyGinGin 475lieGlyGinGlyGin 480
GinProGluGinGlu 485GinGinProGlyGin 490GlyGinGinGlyTyr 495
TyrProThrTyrPro 500GinGinProGlyGlu 505GlyGinGinSerGly 510
GinSerGinGinPro 515GlyGinGlyGinGin 520GlyTyrTyrProThr 525
SerLeuGinGinProGlyGinGlyGinGinGlyHisTyrProAla
530535540
SerLeuGinGinProGly GinGlyHisProGlyGin ArgGinGin
545550555
ProGlyGinGlyGin 560GinProGluGinGlu 565GinGinProGlyGin 570
GlyGinGluGlyTyr 575TyrProThrSerPro 580GinGinProGlyGin 585
GlyGinGinLeuGly 590GinGlyGinGinGly 595TyrTyrProThrSer 600
ProGinGinProGly 605GinGlyGinGinArg 610GlyGinGlyGinGin 615
ArgHisCysProThr 620SerProGinGinThr 625GlyGinAlaGinGin 630
ProGlyGinGlyGin 635GinThrGlyGinVal 640GinGinProGlyGin 645
GlyGinGinGlyTyr 650TyrProThrSerLeu 655GinGinSerGlyGin 660
GlyGinGinSerGly 665GinGlyGinGinSer 670GlyGinGlyHisGin 675
ProGlyGinGlyGin 680GinSerGlyGinGlu 685GinGinGlyTyrAsn 690
AsnProTyrHisVal 695SerAlaGluGinGin 700MetAlaSerProLys 705
ValAlaLysAlaGin 710GinSerAlaThrGin 715LeuProlieMetCys 720
ArgMetGluGlyGly 725GluProLeuSerAla 730SerGin
權利要求
1.一種提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7*基因，其特征在該基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2202位所示的核苷酸序列。
2. —種含有權利要求1所述的提莫菲維小麥高分子量谷蛋白0^*基因的 質粒。
3. —種含有權利要求1所述的提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7f基因的 植物表達載體。
4. 一種含有權利要求1所述的提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7f基因的 轉基因細胞系。
5. 如權利要求l所述的提莫菲維小麥高分子量谷蛋白077*基因在培育轉 基因小麥從而改善小麥面粉烘烤品質方面的應用。
全文摘要
本發明屬于生物基因工程技術領域，特別涉及一種提莫菲維小麥高分子量谷蛋白Gy7^*基因以及基于此基因通過生物技術方法改良小麥品質的應用。本發明從提莫菲維小麥中克隆得到一個編碼高分子量谷蛋白亞基的基因Gy7^*，其特征在于該基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2202位所示的核苷酸序列。通過基因工程技術，可培育優質轉基因小麥，改善麥谷蛋白的高分子量亞基構成，能顯著改善面粉烘烤品質。
文檔編號C12N15/29GK101191131SQ200610114779
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月23日 優先權日2006年11月23日
發明者晏月明, 李小輝, 董艷敏 申請人:首都師范大學