專利名稱：一種植物基因表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域?yàn)樯锛夹g(shù)領(lǐng)域。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及一種植物基因表達(dá)載體pBinAipt-bar的構(gòu)建、應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在中國(guó)、韓國(guó)和日本等地區(qū)，平均每3--4年就發(fā)生一次嚴(yán)重的冷害，而我國(guó)局部地區(qū)幾乎每年都發(fā)生，每年造成損失達(dá)30--50億kg。在海拔較高貴州中西部地區(qū)，雜交稻近年常因受低溫冷害，造成部分地區(qū)大面積減產(chǎn)。據(jù)貴州省農(nóng)業(yè)廳統(tǒng)計(jì)，2002年由于貴州遭遇歷史上罕見的秋風(fēng)危害，產(chǎn)量比2001年減少11.2億kg，減產(chǎn)達(dá)24.4％。所以世界各國(guó)都非常重視水稻冷害的研究，以期培育抗冷的水稻品種。
異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(ipt)是細(xì)胞分裂素合成步驟中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它在脅迫條件下被激活而引起細(xì)胞分裂素(CTK)的大量合成，打破細(xì)胞中CTK與生長(zhǎng)素的平衡，從而使植物產(chǎn)生對(duì)脅迫因子的抗性。Gan和Amasino(1995)將抗衰老啟動(dòng)子SAG12與ipt基因連接，構(gòu)建出一個(gè)可延緩衰老的自我調(diào)控系統(tǒng)PSAG12ipt，通過調(diào)控植物葉片細(xì)胞分裂素含量來(lái)延緩植物衰老。這套系統(tǒng)在煙草、番茄、青菜、小麥、結(jié)縷草、水稻等多種植物中都得到了驗(yàn)證。另外，植物組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子啟動(dòng)ipt基因或?qū)⑵渑c其他基因構(gòu)建融合基因遺傳轉(zhuǎn)化植物也有成功的報(bào)道。
bar基因來(lái)源于吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，是抗草胺磷類除草劑的基因，在轉(zhuǎn)基因研究中既可作為標(biāo)記基因，又可作為功能基因；將bar基因?qū)胨驹诜N子除雜保純中具有很大的應(yīng)用潛力。將Bar基因?qū)氲剿镜膱?bào)道較多，目前華南植物園的轉(zhuǎn)Bar基因水稻已進(jìn)入生產(chǎn)試驗(yàn)階段。
現(xiàn)有技術(shù)上還沒有發(fā)現(xiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)有上述兩種基因的植株報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白，應(yīng)用ipt基因與抗除草劑基因(bar)構(gòu)建融合基因，轉(zhuǎn)入植株中，獲得既抗冷又抗除草劑的植株。
一種植物基因表達(dá)載體，其特征在于在pBin19克隆位點(diǎn)插入細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶ipt基因和抗除草劑bar基因。
上述基因表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
所述應(yīng)用是將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化有關(guān)植物使之產(chǎn)生抗逆性。
所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、共轉(zhuǎn)化法或基因槍法。
所述植物為單子葉植物。
所述單子葉植物為水稻、玉米或草坪草。
所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，所述植物為水稻。
所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟a、愈傷誘導(dǎo)去掉成熟種子穎殼，用75％酒精浸泡90s，再用0.1％HgCl浸泡15min，用無(wú)菌水清洗5次。吸干水分接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，再在繼代培養(yǎng)基上每15天繼代一次。
b、浸染及篩選將制備表達(dá)載體pBinAipt-bar的農(nóng)桿菌EHA105在含50mg/L-卡那霉素和20mg/L-利福平的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.7時(shí)集菌，用重懸培養(yǎng)基重懸菌體。挑選鮮嫩的愈傷于菌液重懸液中浸泡20min，用無(wú)菌濾紙吸干菌液接于共培養(yǎng)基上，三天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上，保持選擇壓繼代2次。
c、分化、生根、移栽將在篩選培養(yǎng)基上存活下來(lái)的愈傷組織接于分化培養(yǎng)基上，在暗培養(yǎng)條件下預(yù)分化10天左右，轉(zhuǎn)移至光下。至幼苗2cm左右時(shí)移入生根培養(yǎng)基中，當(dāng)小苗長(zhǎng)至10cm左右時(shí)煉苗、移栽。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，pH5.8。
繼代培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L 6-芐基氨基嘌呤，pH5.8。
篩選培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，4.0mg/L草胺磷，pH5.8。
重懸培養(yǎng)基NB(無(wú)瓊脂)，100μmol/L乙酰丁香酮。
共培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2。
分化培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤，0.5mg/L激動(dòng)素，2.0mg/L草胺磷，pH5.8。
生根培養(yǎng)基為1/2N6，0.5mg/L萘乙酸，2.0mg/L草胺磷，pH5.8。
所述NB由下列成份組成N6培養(yǎng)基中的大量和微量元素，B5培養(yǎng)基中的有機(jī)元素，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L脯氨酸，500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖和8g/L瓊脂。
所述培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)、繼代、篩選均為暗培養(yǎng)；分化、芽增殖和生根為光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為4000lux、14h/d。
本發(fā)明構(gòu)建了雙價(jià)表達(dá)載體pBinAipt-bar，并將其轉(zhuǎn)化植物，使其獲得既抗冷又抗除草劑的功效。另外轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出分枝增多，節(jié)間縮短，植株矮化及延緩營(yíng)養(yǎng)器官衰老等特征。本發(fā)明利用水稻成熟胚為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并得到轉(zhuǎn)基因植株。在對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的脂肪酸含量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其不飽和脂肪酸明顯增加。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因與傳統(tǒng)育種手段的結(jié)合，達(dá)到了品種改良的目的。
轉(zhuǎn)基因水稻飽和脂肪酸含量與對(duì)照相比略有變化，但差異不明顯。而α-亞麻酸、油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸則明顯增加。各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系α-亞麻酸含量均高于對(duì)照，其中R527ib1株系含量由1.60％增至1.77％；亞油酸含量也表現(xiàn)為增加，EY105ib00株系亞油酸的相對(duì)含量增加了2.2％。而EY105ib00株系油酸含量卻降低，其余株系均增高。說(shuō)明導(dǎo)入ipt基因后未改變水稻的飽和脂肪酸含量，而其不飽和脂肪酸含量卻顯著增加。膜相變溫度在很大程度上是膜脂，特別是膜磷脂的脂肪酸所決定的，脂肪酸含量增加可降低膜相變溫度，保證植物細(xì)胞正常的生理代謝機(jī)能。
與幼胚轉(zhuǎn)化相比，成熟胚轉(zhuǎn)化愈傷誘導(dǎo)較困難，遺傳轉(zhuǎn)化率也較低，但成熟胚可在一年四季取材，而幼胚只在一年當(dāng)中特定的時(shí)間取材，限制了幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化外植體的廣泛應(yīng)用。本發(fā)明采用成熟胚為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并得到轉(zhuǎn)基因植株。按照本發(fā)明提供的方法對(duì)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到9.7％。
圖1本發(fā)明表達(dá)載體pBinAipt-bar結(jié)構(gòu)示意2轉(zhuǎn)pBinAipt-bar水稻植株圖3轉(zhuǎn)基因水稻抗冷性鑒定結(jié)果1a為冷處理前轉(zhuǎn)基因水稻，1b為冷處理前水稻對(duì)照植株，2a為冷處理后轉(zhuǎn)基因水稻，2b冷處理后水稻對(duì)照植株。
圖4轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照抽穗期盆栽圖圖中a為轉(zhuǎn)基因植株，b為對(duì)照植株。
圖5轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照抗除草劑實(shí)驗(yàn)圖中a為轉(zhuǎn)基因植株，b為對(duì)照植株。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1 雙價(jià)表達(dá)載體pBinAipt-bar的構(gòu)建本研究中ipt基因來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌，bar基因來(lái)源于吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，所用啟動(dòng)子之一為組成型啟動(dòng)子pNOS，來(lái)自Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶基因；終止子為NOS3’序列，來(lái)源于Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶基因的終止序列。另一個(gè)啟動(dòng)子act來(lái)自于水稻，終止子也為NOS3′序列。將表達(dá)元件act-ipt-nos及Pnos-bar-nos插入pBin19。見圖1。
實(shí)施例2 水稻成熟胚的遺傳轉(zhuǎn)化將制備表達(dá)載體pBinAipt-bar的農(nóng)桿菌EHA105在含50mg/L-卡那霉素和20mg/L-利福平的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.7時(shí)集菌，用NBD2-As重懸菌體。挑選鮮嫩的愈傷于菌液重懸液(OD600約0.7)中浸泡，其間不斷搖動(dòng)，15min取出用無(wú)菌濾紙吸干菌液接于鋪有無(wú)菌濾紙的固體培養(yǎng)基NBD2-As上培養(yǎng)3天。經(jīng)共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)基上，兩周后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(PPT 4.0mg/L)。約30天后大部分愈傷組織褐化死亡，但部分褐化的愈傷組織會(huì)長(zhǎng)出部分顆粒狀的新鮮愈傷。將這部分愈傷組織轉(zhuǎn)接于新的篩選培養(yǎng)基上，15天后轉(zhuǎn)入NBK分化培養(yǎng)基(PPT 2.0mg/L)上培養(yǎng)。1周后開始出現(xiàn)綠點(diǎn)，3周后形成小芽，小芽在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)月左右長(zhǎng)成完整植株。(見圖2、圖4)實(shí)驗(yàn)例1、轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗冷性鑒定經(jīng)過檢測(cè)的T0代植株進(jìn)行自交獲得T1，將轉(zhuǎn)基因植株及對(duì)照植株培養(yǎng)至10cm左右時(shí)置于4℃人工氣候箱測(cè)其抗冷性，結(jié)果“見圖3”。其中圖a為冷處理前的轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照的生長(zhǎng)情況，圖b為冷處理后材料的生長(zhǎng)情況，圖中左為轉(zhuǎn)基因植株，右為對(duì)照植株。
實(shí)驗(yàn)例2、抗除草劑性能鑒定將轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照植株培養(yǎng)至3葉1芯期，用0.25％草胺磷溶液噴灑植株，5天后對(duì)照植株死亡，而轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)良好，結(jié)果“見圖5”。
實(shí)驗(yàn)例3、轉(zhuǎn)基因水稻植株籽粒脂肪酸組成分析EY105、R527為未轉(zhuǎn)基因的組培苗，EY105ib20、EY105ib00、R527ib1、R527ib2均為轉(zhuǎn)ipt-bar基因T3代植株。
測(cè)定四個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照植株的脂肪酸含量，測(cè)定結(jié)果見“表1”。轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照的飽和脂肪酸含量無(wú)明顯差異，而油酸、亞油酸、α亞麻酸等不飽和脂肪酸則明顯增加，其中EY105ib00株系亞油酸的相含量增加了2.2％。
表1轉(zhuǎn)基因水稻脂肪酸測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種植物基因表達(dá)載體，其特征在于在pBin19克隆位點(diǎn)插入細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶ipt基因和抗除草劑bar基因。
2.權(quán)利要求1基因表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是將權(quán)利要求1所述的植物基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化有關(guān)植物使之產(chǎn)生抗逆性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法、共轉(zhuǎn)化法或基因槍法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述植物為單子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述單子葉植物為水稻、玉米或草坪草。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，所述植物為水稻。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟a、愈傷誘導(dǎo)去掉成熟種子穎殼，用75％酒精浸泡90s，再用0.1％HgCl浸泡15min，用無(wú)菌水清洗5次，吸干水分接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷，再在繼代培養(yǎng)基上每15天繼代一次。b、浸染及篩選將制備表達(dá)載體pBinAipt-bar的農(nóng)桿菌EHA105在含50mg/L-卡那霉素和20mg/L-利福平的YEP培養(yǎng)基中28℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.7時(shí)集菌，用重懸培養(yǎng)基重懸菌體，挑選鮮嫩的愈傷于菌液重懸液中浸泡20min，用無(wú)菌濾紙吸干菌液接于共培養(yǎng)基上，三天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上，保持選擇壓繼代2次。c、分化、生根、移栽將在篩選培養(yǎng)基上存活下來(lái)的愈傷組織接于分化培養(yǎng)基上，在暗培養(yǎng)條件下預(yù)分化10天左右，轉(zhuǎn)移至光下，至幼苗2cm左右時(shí)移入生根培養(yǎng)基中，當(dāng)小苗長(zhǎng)至10cm左右時(shí)煉苗、移栽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，pH5.8；繼代培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L 6-芐基氨基嘌呤，pH5.8；篩選培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，4.0mg/L草胺磷，pH5.8；重懸培養(yǎng)基NB(無(wú)瓊脂)，100μmol/L乙酰丁香酮；共培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2；分化培養(yǎng)基為NB，2.0mg/L 6-芐基氨基嘌呤，0.5mg/L激動(dòng)素，2.0mg/L草胺磷，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2N6，0.5mg/L萘乙酸，2.0mg/L草胺磷，pH5.8；所述NB由下列成份組成N6培養(yǎng)基中的大量和微量元素，B5培養(yǎng)基中的有機(jī)元素，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L脯氨酸，500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖和8g/L瓊脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)、繼代、篩選均為暗培養(yǎng)；分化、芽增殖和生根為光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為4000lux、14h/d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物基因表達(dá)載體pBinAipt－bar及其應(yīng)用，一種植物基因表達(dá)載體pBinAipt－bar，其特征在于在pBin19克隆位點(diǎn)插入有細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶ipt基因和抗除草劑bar基因，將表達(dá)載體pBinAipt－bar轉(zhuǎn)化有關(guān)植物，使之產(chǎn)生抗逆性。本發(fā)明采用水稻成熟胚為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并得到轉(zhuǎn)基因水稻，使之獲得抗冷及抗除草劑的功效，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出分枝增多，節(jié)間縮短，植株矮化及延緩營(yíng)養(yǎng)器官衰老等特征，而且在對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的脂肪酸含量檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其不飽和脂肪酸明顯增加。通過轉(zhuǎn)基因與傳統(tǒng)育種手段的結(jié)合，達(dá)到了品種改良的目的。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1958802SQ20061011456
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月15日
發(fā)明者趙德剛, 李義, 段永波, 向陽(yáng), 余顯權(quán), 胡斌 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)