一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于擬南芥的調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在調(diào)控植物脂肪酸代謝中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物中油脂或植物油的主要組分是脂肪酸及其脂肪酸衍生物，它廣泛存在于植物的種子和果實(shí)中。植物油用途廣泛，運(yùn)用生物技術(shù)改良植物體內(nèi)脂肪酸的組分和含量具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，基因工程技術(shù)所選用的操作基因必需是植物體內(nèi)脂肪酸生物合成過程中的關(guān)鍵基因，但是目前人們對(duì)于植物脂肪酸生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還不甚了解，因此，利用基因工程技術(shù)提高油料作物含油量的工作目前進(jìn)展緩慢。
以雙子葉模式植物擬南芥為例，植物的胚胎發(fā)生主要分為兩個(gè)階段早期形態(tài)發(fā)生過程和晚期成熟過程。整個(gè)胚胎發(fā)育過程中伴隨著淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪酸等貯藏物質(zhì)的積累。在胚胎發(fā)育早期，主要是淀粉的大量積累，在組織和器官形成以后，淀粉被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和脂肪酸。在發(fā)育的種子中，碳水化合物通過糖酵解途徑被分解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體后再轉(zhuǎn)化成丙酮酸和乙酰CoA，乙酰CoA作為底物參與脂肪酸的合成(Sari A.Ruuska等，2002，The PlantCell，Vol.14，1191-1206)。
在種子發(fā)育過程中，質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸合成酶復(fù)合物中的酶類負(fù)責(zé)脂肪酸的合成，所合成的脂肪酸被導(dǎo)入胞質(zhì)?；鵆oA庫中以維持三酯酰甘油(TAG)積累。植物種子中的TAG的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。TAG的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的過程共需要三種?；D(zhuǎn)移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Ohlrogge，J.B等，1979，Proc Natl Acad Sci USA 761194-1198.)。這三種?；D(zhuǎn)移酶催化甘油骨架的逐步?；^程。
近幾十年來，科學(xué)家們對(duì)利用基因工程技術(shù)提高植物體內(nèi)，特別是種子中的脂肪酸含量進(jìn)行了各種有益的探索。Shintani等在煙草中過量表達(dá)了ACCase的其中一個(gè)亞基-生物素羧化酶，結(jié)果在煙草葉片中BC的表達(dá)水平提高了3倍，其它三個(gè)亞基的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，且脂肪酸的含量和組成也沒有明顯改變(見Shintani，D.K等，1997，Plant Physiol.114，881-886)。但是另一項(xiàng)研究表明，增加丙酰CoA的含量能夠提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子使擬南芥中的HO-ACCase基因在油菜中過量表達(dá)，結(jié)果使ACCase的活性明顯提高，并且種子中的含油量也提高3-5％(Roesler，K.等，1997，Plant Physiol.113，75-81)。Roeseler等的研究結(jié)果表明，丙酰CoA水平能夠提高脂肪酸的含量，但提高幅度較小。Dechesh等將菠菜的KASIII基因在煙草中過量表達(dá)，結(jié)果使KASIII的酶活性提高了100-300倍，但脂肪酸的含量卻降低了5-10％(Dehesh，K等，2001，Plant Physiol.125，1103-1114)。上述研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)的脂肪酸代謝是一個(gè)復(fù)雜和高度協(xié)調(diào)的過程，通過對(duì)脂肪酸代謝途徑中的個(gè)別或單個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作并不能夠有效地改變脂肪酸的含量。因此，Girke等人預(yù)言在脂肪酸的代謝過程中，很可能存在一種蛋白激酶或其它調(diào)控因子(如轉(zhuǎn)錄因子)在起調(diào)控作用(Girke，T.等，2000，Plant Physiol124，1570-1581)。
目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子只有WRI1。WRI1編碼一個(gè)推測(cè)的AP2/EREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它可能是植物體內(nèi)由蔗糖向TAG轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(Cernac，A等，2004，Plant J 40，575-585)。
在植物的整個(gè)基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，如擬南芥中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因至少有1500個(gè)，占整個(gè)基因組的5％以上(Riechmann，J.L.等，2000，Science 290，2110)。這些轉(zhuǎn)錄因子大多屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的。大量對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)一類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié)控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性。
CCAAT盒是一個(gè)廣泛存在于基因啟動(dòng)子上的順式調(diào)控元件，與CCAAT序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子又稱為nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一個(gè)由三種不同亞基構(gòu)成的異源三聚體復(fù)合物，它特異性地識(shí)別DNA上的CCAAT序列，并與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個(gè)亞族NF-YA(又稱為HAP2或CBF-B)，NF-YB(又稱為HAP3或CBF-A)和NF-YC(又稱為HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結(jié)構(gòu)域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性，NF-YB/NF-YC形成一個(gè)緊密結(jié)合的異源二聚體復(fù)合物，NF-YA再結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物的表面，形成異源三聚體復(fù)合物。該三聚體復(fù)合物對(duì)DNA有很高的親和力(Mantovani R.1999.23915-27；Gusmaroli G等，2001，Gene 264173-185.Gene 28341-48；Romier C等，2003，Journal of Biological Chemistry 2781336-1345)。
編碼NF-Y亞基的基因普遍存在于各種生物體中，其中在酵母與動(dòng)物體中，各種亞基都是由單基因編碼的。而在植物的基因組中，NF-Y亞基是由多種不同基因編碼的。在擬南芥中，Gusmaroli G等人先后于2001年和2002年報(bào)道了三個(gè)NF-Y亞族中的共29個(gè)ESTs的序列(Gusmaroli G，TonelliC，Mantovani R.2001.Regulation of theCCAAT binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264173-185.Gusmaroli G，Tonelli C，Mantovani R.2002.)，本發(fā)明的發(fā)明人于2004年完成了該家族32個(gè)基因cDNA的克隆，其中9個(gè)HAP2，11個(gè)HAP3，12個(gè)HAP5(GongW等，2004，Plant Physiol.135773-782)。
NF-YB亞族的轉(zhuǎn)錄因子在基因內(nèi)部都含有一個(gè)保守的B結(jié)構(gòu)域，依據(jù)B結(jié)構(gòu)域序列的差異，該家族被分為兩類LEAFY COTYLEDON1(LEC1)類型和非LEC1類型(KwongRW等，2003，Plant Cell 155-18)。LEC1類型包括兩個(gè)基因LEC1和L1L。功能分析表明，這兩個(gè)基因都是特異性地在種子發(fā)育過程中表達(dá)，是CCAAT轉(zhuǎn)錄因子家族中有特定生理功能的蛋白。LEC1類型的轉(zhuǎn)錄因子的B結(jié)構(gòu)域含有16個(gè)保守的氨基酸殘基，這16個(gè)氨基酸殘基在非LEC1類型的轉(zhuǎn)錄因子中是不保守的。研究結(jié)果表明，B結(jié)構(gòu)域是決定LEC1類轉(zhuǎn)錄因子在功能上區(qū)別于其它非LEC1類轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵因素(Hyeseung Lee等，2003，PNAS 1002152-2156.)。
LEC1是HAP3家族中功能研究的較為清楚的一個(gè)蛋白。LEC1是擬南芥胚胎發(fā)生過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。高等植物的胚胎發(fā)生主要分為兩個(gè)階段早期形態(tài)發(fā)生過程和晚期成熟過程。前者包括形成胚性細(xì)胞、組織和器官系統(tǒng)；后者包括使種子干燥及代謝靜止。在胚胎發(fā)育的早期階段，LEC1主要使胚性細(xì)胞形成胚柄，并決定子葉的特性(Lotan，T.等，1998，Cell 93，1195-1205；West，M.A.L.等，1994，PlantCell 61731-1745.)。在胚胎發(fā)育的晚期階段，LEC1參與了種子成熟的多個(gè)過程，包括種子的干燥和養(yǎng)分的積累。目前，在玉米、向日葵和胡蘿卜中，均發(fā)現(xiàn)了LEC1基因的同源基因(Zhang S等，2002，Planta 215(2)191-4；Yazawa K等，2004，Plant Physiol Biochem.42(3)215-23.)。
Microarray實(shí)驗(yàn)表明，在擬南芥的種子發(fā)育過程中，由糖類物質(zhì)向脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程是由多基因協(xié)同作用完成的，因此可能有不止一個(gè)基因參與了該過程的調(diào)節(jié)。其中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，Cernac和Benning利用35S啟動(dòng)子使AP2類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因WRI1的cDNA在擬南芥中過量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法能夠提高種子的含油量(Cernac，A.等，2004，Plant J 40，575-585.)。因此，通過對(duì)脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵因子進(jìn)行遺傳操作，用轉(zhuǎn)基因方法提高作物的脂肪酸含量將是一條行之有效的途徑。
PER8載體為化學(xué)誘導(dǎo)性表達(dá)載體，其插入的靶基因的表達(dá)受到化學(xué)誘導(dǎo)劑雌激素及其活性衍生物(estrogen or its biologically active derivatives)(例如17--estradiol)的嚴(yán)格調(diào)控(Zuo et al.，Plant Journal.24265-273，2000)。誘導(dǎo)性DNA剪切以及誘導(dǎo)性表達(dá)載體pX6是pER8系列載體的一個(gè)衍生表達(dá)載體，其特性已經(jīng)被詳盡描述報(bào)道(參見Zuo et al.，Nature Biotechnology 19157-161，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子，名稱為Leafy Cotyledon 1(簡稱LEC1或AtLEC1)，來源于擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由238個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第57-147位氨基酸殘基為保守序列。
所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
編碼本發(fā)明調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因(Leafy Cotyledon 1，簡稱LEC1或AtLEC1)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由717個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-717位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第169-441位堿基編碼保守序列。
其基因組基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；
2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由2038個(gè)堿基組成，自5′端第47-98位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端第99-1203位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端第1204-1868位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端第1-46位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū)(UTR)，自5′端第1869-2038位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增AtLEC1中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種調(diào)控植物脂肪酸組分和含量的方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物脂肪酸組分和含量的方法，是將所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因AtLEC1或與AtLEC1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物脂肪酸組分和含量獲得調(diào)控。
在上述調(diào)控植物脂肪酸組分和含量的方法中，所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因既可為AtLEC1的cDNA序列，也可為AtLEC1的基因組基因序列；與AtLEC1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將AtLEC1的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因AtLEC1或其同源序列可以正義方向或反義方向?qū)胫参锝M織、細(xì)胞或器官。
所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因AtLEC1或其同源序列可通過含有AtLEC1或其同源序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用AtLEC1或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actin1啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào)NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank號(hào)M64633.1，GI349405)啟動(dòng)子；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受ABA、乙烯或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以PER8為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有AtLEC1的植物表達(dá)載體為PER8-AtLEC1；以pX6為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有AtLEC1的植物表達(dá)載體為pX6-AtLEC1。
攜帶有本發(fā)明編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因AtLEC1或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因AtLEC1或與AtLEC1具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株脂肪酸含量和組分的改變包括植物體內(nèi)各組織和器官內(nèi)各種脂肪酸含量包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的改善和提高，及各種脂肪酸組分的提高或降低。
本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子AtLEC1及其編碼基因。編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因是以擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型為材料，用RT-PCR的方法分離得到的。該轉(zhuǎn)錄因子可用于調(diào)控植物體內(nèi)脂肪酸代謝，實(shí)驗(yàn)證明，AtLEC1轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)，不僅脂肪酸含量得到顯著提高，而且參與脂肪酸合成的酶FAE1和參與脂肪酸修飾的酶FAB2，F(xiàn)AD2以及FAD3也都獲得表達(dá)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参镏舅岽x分子機(jī)制的研究，以及提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為AtLEC1基因組基因的框架結(jié)構(gòu)圖2為AtLEC1與已知其它物種間的同源基因的進(jìn)化關(guān)系樹圖3為AtLEC1轉(zhuǎn)基因擬南芥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)后10天的表型圖4為蘇丹紅染色指示的AtLEC1轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)脂肪酸含量的變化圖5為GC-MS方法檢測(cè)AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)20天后體內(nèi)脂肪酸含量變化情況的結(jié)果圖6為Northern Blotting檢測(cè)AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)脂肪酸合成途徑的部分修飾酶和合成酶表達(dá)水平變化情況的結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實(shí)施例1、調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因AtLEC1的克隆用TRIZAL試劑(購自Invitrogen公司)并參照試劑盒說明書提取擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)新鮮果莢的總RNA，然后用Invitrogen公司的SuperScriptTMII Reverse Transcriptase試劑盒并參照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物P1(上游引物)5’-CCCTCGAGAAATGACCAGCTCAGTCGTAGT-3’和P2(下游引物)5’-AAACTAGTTCACTTATACTGACCAT-3’的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增擬南芥中的調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回收長度約717bp的目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將回收片段連接入到載體pGEM-Teasy(Promega公司)中，再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，提質(zhì)粒，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-T Vector-AtLEC1，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段具有序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列，由717個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-717位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第169-441位堿基編碼保守序列。其基因組基因具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由2038個(gè)堿基組成，自5′端第47-98位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5′端第99-1203位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5′端第1204-1868位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5′端第1-46位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū)(UTR)，自5′端第1869-2038位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)。該基因的框架結(jié)構(gòu)見圖1。將克隆的來自擬南芥的調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，該基因與來自胡蘿卜(D.carota)、水稻(O.sativa)和玉米(Z.mays)的調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示，由圖2可以看出，該基因與來自胡蘿卜的調(diào)控植物營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)錄因子基因C-LEC1的親緣關(guān)系最近，編碼蛋白的氨基酸序列相似性達(dá)71％。
實(shí)施例2、AtLEC1轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得一、含AtLEC1的植物表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Xho I和Spe I對(duì)實(shí)施例1構(gòu)建的含有AtLEC1的質(zhì)粒pGEM-TVector-AtLEC1進(jìn)行雙酶切，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收長度約717bp的AtLEC1基因片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將回收片段用T4DNA連接酶(Roche公司)與經(jīng)相同酶雙酶切的載體PER8(Zuo et al.，Plant Journal.24265-273，2000)或pX6(Zuo et al.，Nature Biotechnology 19157-161，2001)連接，再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L潮霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，提質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xho I和Spe I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了11479bp和717bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再用引物P1和P2做進(jìn)一步的PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了717bp的DNA片段，也與預(yù)期結(jié)果一致，表明得到了插入序列及位置正確的含有AtLEC1的植物表達(dá)載體，命名為PER8-AtLEC1(將以pX6為出發(fā)載體構(gòu)建的含有AtLEC1的植物表達(dá)載體命名為pX6-AtLEC1)。
二、AtLEC1轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得將步驟一構(gòu)建的植物表達(dá)載體PER8-AtLEC1(或pX6-AtLEC1)用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在28℃、150rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑取長出的農(nóng)桿菌單菌落再接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的20mL LB液體培養(yǎng)基中在28℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)2天，然后，再按2％的接種量菌將菌液接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的300mL LB液體培養(yǎng)基中在28℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，5000rpm離心20分鐘收集菌體，再將菌體懸浮于250mL含有5％蔗糖，0.1％Silwetl-77的溶液中。最后，將菌液轉(zhuǎn)于250mL燒杯中，將已去掉果莢的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥植株倒置于燒杯中，使其花序完全浸入菌液中，真空抽10分鐘為宜，為提高轉(zhuǎn)化效率，一周后再重復(fù)一次。將轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，收獲種子，所得種子經(jīng)20mg/L潮霉素篩選后得到AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株。
三、AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)將步驟二獲得的過表達(dá)AtLEC1的陽性轉(zhuǎn)基因植株的種子播在含10μM雌激素17--estradiol(購自Sigma公司)的MS培養(yǎng)基上，置于溫室中在22℃、光照強(qiáng)度80-120μE-2S-1，光照周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)，以哥倫比亞野生型擬南芥作為對(duì)照。觀察AtLEC1過表達(dá)植株和野生型植株的生長情況，AtLEC1過表達(dá)植株在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)后生長10天時(shí)的表型如圖3所示，AtLEC1過表達(dá)植株矮小、黃化，頂端分生組織的發(fā)育完全受阻，根的生長發(fā)育異常。
實(shí)施例3、AtLEC1過表達(dá)植株的脂肪酸代謝檢測(cè)一、蘇丹紅染色指示AtLEC1過表達(dá)植株體內(nèi)脂肪酸含量的變化將實(shí)施例2中在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中萌發(fā)后生長20天的AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株與哥倫比亞野生型對(duì)照植株浸泡于1％蘇丹紅(Fat Red 7B)(Sigma公司)，室溫過夜(12-24小時(shí))，用去離子水清洗3次，每次60秒，染色結(jié)果如圖4所示，在AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株的根部和子葉處，脂肪酸的積累量明顯高于野生型。
二、GC-MS方法檢測(cè)AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)后體內(nèi)各種脂肪酸組分的含量變化情況分別取實(shí)施例2獲得的在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中萌發(fā)后生長20天的AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的整株植物各0.1克，在液氮中研磨成干粉，然后轉(zhuǎn)移到帶密封蓋的試管中，加入3mL甲醇(含2.5％(V/V)濃硫酸)，在80℃水浴加熱90分鐘.再加入4.5mL0.9％NaCl溶液和1mL正己烷，混勻，4000rpm離心10分鐘，收集正己烷相。真空抽干，用100ul乙酸乙酯溶解，取1ul上樣，用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS儀分析各種脂肪酸組分的含量變化情況，所用GC柱為30m×0.25mmBPX-70柱，GC升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20℃，保持1分鐘，再以每分鐘10℃的速率升至150℃，然后以每分鐘4℃的速率升溫至230℃，保持10分鐘，以C170的三酯酰甘油作內(nèi)標(biāo)。結(jié)果如圖5所示，與野生型對(duì)照相比，AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)后脂肪酸的各個(gè)組分含量都明顯上升，其中，二十碳一稀酸提高了約50倍。
三、Northern Blotting檢測(cè)AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)后脂肪酸合成途徑的部分修飾酶和合成酶的表達(dá)水平變化用Northern Blotting法檢測(cè)AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)后脂肪酸合成途徑的部分修飾酶和合成酶(FAE1、FAB2、FAD2和FAD3)的表達(dá)水平變化，具體方法為將實(shí)施例2獲得的AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株的種子播在分別含有20μM DMSO(對(duì)照)和20μM雌激素17--estradiol的MS培養(yǎng)基中，在種子萌發(fā)3天后取樣(在不同培養(yǎng)基中生長的AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株的葉片)，用TRIZAL法提取總RNA，-70℃保存。然后，每種樣品的RNA各取10-15μg，加入10×MOPS(購自Sigma公司)2μL，制樣緩沖液2μL，甲醛4μL，去離子甲酰胺10μl，混勻后，沸水煮1-2分鐘，再冰水浴10分鐘，然后進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離RNA，將拍照后的凝膠在超純水中漂洗后，加入10×SSC(NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g，pH 7.0，用蒸餾水定容至1L)，輕搖約1小時(shí)，期間換一次10×SSC緩沖液；然后準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)膜裝置，將尼龍膜(Duralon-UV TM Membrane；Stratagene，LaJolla，CA，USA)用超純水漂洗，并用10×SSC浸泡15分鐘，覆于正面朝下的上述凝膠上面，尼龍膜四周與液體絕緣，將3張濾紙覆蓋尼龍膜上，除凈氣泡后再覆蓋吸水紙，以適當(dāng)?shù)闹匚飰浩剑m時(shí)換紙，轉(zhuǎn)移過夜(12-24小時(shí))，觸膠面朝上，將膜在紫外干燥儀中固定3分鐘，用超純水漂洗，將膜封好后-20℃保存。接著，將膜放入雜交管中，用預(yù)雜交液(含10％SDS，6×SSC，20mg/mL dextran sulfate，10mg/mL鮭魚精子DNA)潤濕，65℃預(yù)雜交10小時(shí)，加入以等體積的0.4N NaOH變性10分鐘，再用1MTris·HCl(pH7.5)中和的放射性標(biāo)記的探針，探針的制備利用Amersham Biosciences公司的Megaprime DNA Labelling System(貨號(hào)RPN1605)，即將15μL超純水，5μLPrimer solution，5μL總量50ng以上的DNA模板(FAE1基因(GeneID829603)、FAB2基因(GeneID818973)、FAD2基因(GeneID820387)或FAD3基因(GeneID817548)，模板制備方法從野生型Col-0擬南芥的cDNA中通過RT-PCR擴(kuò)增得到，反應(yīng)體系及條件為取1-2μg RNA，1μL oligo(dT)15和1μL 10mM dNTP，混合后(總體積12μL)在冰上混勻，65℃反應(yīng)5分鐘，然后依次加入5×buffer(購自Invitrogen)4μL，0.1MDTT 2μL和M-MLV RT(購自Invitrogen)0.5μL，42℃50分鐘，45℃10分鐘，70℃加熱20分鐘，RNAase消化30min。產(chǎn)物經(jīng)稀釋后可做為模板用于PCR反應(yīng))混勻，沸水浴2分鐘。室溫冷卻后，加入dATP、dTTP和dGTP各4μL，反應(yīng)緩沖液(購自AmershamBiosciences)5μL，Klenow(購自Amersham Biosciences)2μl，放射性32P標(biāo)記的dCTP2.5μL，37℃保溫30分鐘以上，然后在68℃下雜交過夜。倒掉雜交液，加入洗液(2×SSC，0.1％SDS)，室溫下洗10-15分鐘，再用含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液在55℃下洗2次，每次10-15分鐘，待放射性讀數(shù)為5-10時(shí)，取出雜交完的膜固定在磷屏儀中，曝光(根據(jù)放射性強(qiáng)度調(diào)節(jié)曝光時(shí)間的長短)。Northern Blotting檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(ESTR為經(jīng)誘導(dǎo)的AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株，DMSO為對(duì)照)，與對(duì)照相比，AtLEC1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，在萌發(fā)3天的苗中，參與脂肪酸合成的酶FAE1和參與脂肪酸修飾的酶FAB2，F(xiàn)AD2以及FAD3都受到明顯誘導(dǎo)，表明本發(fā)明的AtLEC1可用于調(diào)控植物的脂肪酸代謝。
序列表<160>3<210>1<211>238<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Glu Arg Gly Ala Pro Phe Ser His Tyr Gln Leu Pro Lys Ser Ile1 5 10 15Ser Glu Leu Asn Leu Asp Gln His Ser Asn Asn Pro Thr Pro Met Thr20 25 30Ser Ser Val Val Val Ala Gly Ala Gly Asp Lys Asn Asn Gly Ile Val35 40 45Val Gln Gln Gln Pro Pro Cys Val Ala Arg Glu Gln Asp Gln Tyr Met50 55 60Pro Ile Ala Asn Val Ile Arg Ile Met Arg Lys Thr Leu Pro Ser His65 70 75 80Ala Lys Ile Ser Asp Asp Ala Lys Glu Thr Ile Gln Glu Cys Val Ser85 90 95Glu Tyr Ile Ser Phe Val Thr Gly Glu Ala Asn Glu Arg Cys Gln Arg100 105 110Glu Gln Arg Lys Thr Ile Thr Ala Glu Asp Ile Leu Trp Ala Met Ser115 120 125Lys Leu Gly Phe Asp Asn Tyr Val Asp Pro Leu Thr Val Phe Ile Asn130 135 140Arg Tyr Arg Glu Ile Glu Thr Asp Arg Gly Ser Ala Leu Arg Gly Glu145 150 155 160Pro Pro Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Gly Gly Asn Gly Ile Gly Phe His165 170 175
Gly Pro Ser His Gly Leu Pro Pro Pro Gly Pro Tyr Gly Tyr Gly Met180 185 190Leu Asp Gln Ser Met Val Met Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Gln Asn Gly195 200 205Ser Ser Gly Gln Asp Glu Ser Ser Val Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser210 215 220Ile Asn Gly Met Pro Ala Phe Asp His Tyr Gly Gln Tyr Lys225 230 235<210>2<211>717<212>cDNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2atggaacgtg gagctccctt ctctcactat cagctaccaa aatccatctc tgaattgaac 60ttggaccagc acagcaacaa cccaacccca atgaccagct cagtcgtagt agccggcgcc120ggtgacaaga acaatggtat cgtggtccag cagcaaccac catgtgtggc tcgtgagcaa180gaccaataca tgccaatcgc aaacgtcata agaatcatgc gtaaaacctt accgtctcac240gccaaaatct ctgacgacgc caaagaaacg attcaagaat gtgtctccga gtacatcagc300ttcgtgaccg gtgaagccaa cgagcgttgc caacgtgagc aacgtaagac cataactgct360gaagatatcc tttgggctat gagcaagctt gggttcgata actacgtgga ccccctcacc420gtgttcatta accggtaccg tgagatagag accgatcgtg gttctgcact tagaggtgag480ccaccgtcgt tgagacaaac ctatggagga aatggtattg ggtttcacgg cccatctcat540ggcctacctc ctccgggtcc ttatggttat ggtatgttgg accaatccat ggttatggga600ggtggtcggt actaccaaaa cgggtcgtcg ggtcaagatg aatccagtgt tggtggtggc660tcttcgtctt ccattaacgg aatgccggct tttgaccatt atggtcagta taagtga 717<210>3<211>2038<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>3aattatttta taaagaacaa aaaaaaaaaa agacggcaga gaaacaatgg aacgtggagc 60tcccttctct cactatcagc taccaaaatc catctctggt aatctaagtg gctattttta120tacagtatat acttgcctcc atgtatattt atatgctcat gaaaaattgg agacatgctt180tatgaatttt atgagacttt gcaacaacga actaaatgct ttctttctag aaatttttaa240tttagatttg tgaaggtttt gggaatggcc cggagaagac gattttatat acatacatgc300aagagtttga tatgtattgt ttcatcatgg ctgagtcaaa gttttatcca aatatttcca360tggtgtggta ttagttaaac aaatctctcg tatgtgttca ttgaatatac ccgtgcatgt420accaggaatg tttttgagta tcgttttctt tcttttatca aaaaaaattt cgattctaaa480aacgtttttt tctttgttgt aacggttgag tttttttctt cgtttcaaaa cgagattctc540gtttgtctct tcccttgtct aaaaacatct acggttcatg tgattcaaaa acactaaaaa600aatagaaact caaatttttt tagtacttaa catttaaact atatatatat atatatatat660cttatactag tcccaagttt tagtgtgagg tttttttatt caaaatctat cagtaatttt720tttggaaaaa aactaagtga aattttctcc aaattttcct tttactattg attttttaat780tactggatgt cattaactcc aatcttttga ttctttcaac atttaccatt gggaaccttc840acatgaaata aatgtctact ttattgagtc ataccttcgt ctacataaat taattgatgt900tcttctccaa attttgagtt tttggttttt ctaattaata atctaagcga aagctttttg960gtatacatgt aaaacgtaac ggcaagaatc tgaacagtct actcaacggg gtccataagt 1020ctagaatgta gaccccacaa acttactctt atcttattgg tccgtaacta agaacgtgtc 1080ccttgattct cttgttttct tctaatccat tcgtatccta caaatttaat catcatttct 1140acttcaacta atctttttta tttcctaaag atttcaattt ctctctgtat tttctatgaa 1200cagaattgaa cttggaccag cacagcaaca acccaacccc aatgaccagc tcagtcgtag 1260tagccggcgc cggtgacaag aacaatggta tcgtggtcca gcagcaacca ccatgtgtgg 1320ctcgtgagca agaccaatac atgccaatcg caaacgtcat aagaatcatg cgtaaaacct 1380taccgtctca cgccaaaatc tctgacgacg ccaaagaaac gattcaagaa tgtgtctccg 1440agtacatcag cttcgtgacc ggtgaagcca acgagcgttg ccaacgtgag caacgtaaga 1500ccataactgc tgaagatatc ctttgggcta tgagcaagct tgggttcgat aactacgtgg 1560accccctcac cgtgttcatt aaccggtacc gtgagataga gaccgatcgt ggttctgcac 1620ttagaggtga gccaccgtcg ttgagacaaa cctatggagg aaatggtatt gggtttcacg 1680gcccatctca tggcctacct cctccgggtc cttatggtta tggtatgttg gaccaatcca 1740tggttatggg aggtggtcgg tactaccaaa acgggtcgtc gggtcaagat gaatccagtg 1800
ttggtggtgg ctcttcgtct tccattaacg gaatgccggc ttttgaccat tatggtcagt1860ataagtgaag atggaattat tcttcatttt tatatctgtt caaaacatgt gtttggatag1920atattttatt tttatgtctt atcaataaca tttctatata atgttgcttc tttaaggaaa1980agtgttgtat ttcaatactt tatgagaaac tgatttatat atgcaaatga tttaaccc 2038
權(quán)利要求
1.一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基序列為序列表中的SEQ ID NO1。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的cDNA序列為序列表中的SEQ ID NO2。
5.編碼權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)錄因子基因的基因組序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
7.一種調(diào)控植物脂肪酸組分和含量的方法，是將權(quán)利要求3或4或5所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物脂肪酸組分和含量獲得調(diào)控。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼調(diào)控植物脂肪酸代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列通過含有該基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體、pCAMBIA系列載體、pUC系列載體或pBluescript系列載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為PER8-AtLEC1或pX6-AtLEC1。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在調(diào)控植物脂肪酸代謝中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物脂肪酸代謝功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参镏舅岽x分子機(jī)制的研究，以及提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1948338SQ20061011448
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者左建儒, 牟金葉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所