一種培育抗逆轉基因水稻的方法

專利名稱：一種培育抗逆轉基因水稻的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗逆轉基因水稻的方法。
背景技術：
植物生長發育過程中的任何不適環境因素均可稱為環境脅迫，一般分為生物脅迫(如病蟲害)與非生物脅迫。后者包括水分(干旱與澇災)，溫度，鹽堿，光照，營養等多方面的脅迫。
環境脅迫給農業生產帶來的危害是世界性的，非生物脅迫，特別是干旱造成的危害尤重(Boyer JS.1982.Plant productivity and environment.Science218443-448)，可使農作物減產50％至80％。正因為如此，很多科學家都將植物非生物脅迫生物學作為研究重點，以期加速發現植物耐非生物脅迫的基因和分子機理，為基因工程改良農作物耐逆性搶占制高點。
我國是農業大國，非生物脅迫給我國農業帶來的危害非常嚴重，其中干旱與土壤鹽堿化是限制我國農業可持續性發展的主要因素。我國可耕農地的50％受干旱影響，即使在降水較多的華中和華南地區，由于雨量分布不均，這些地區的水稻幾乎每年在揚花的關鍵時期都受干旱的影響，直接影響產量，情節嚴重時甚至顆粒無收。我國北方大部分地區的降雨量偏低，加重土壤的鹽堿化，嚴重影響農業生產。
研究非生物脅迫生物學和分離克隆耐逆基因非常重要，全世界的植物生物學家也為此做了大量的工作，并取得很多新進展，特別在利用高等模式植物擬南芥來研究植物的耐鹽分子機理方面，使該領域的研究有了突破性的進展。專利申請號為200410000682.2的中國發明專利申請公開了一個擬南芥轉錄因子AtHD/START1，它與擬南芥的耐鹽性相關。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育抗逆轉基因水稻的方法。
本發明所提供的培育抗逆轉基因水稻的方法，是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入水稻中，篩選得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白質。
所述AtHD/START1優選為由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質。
其中，序列表中的序列2由722個氨基酸殘基組成，自氨基末端第31位至第88位氨基酸殘基為同源盒(homeo-box)結構域，自氨基末端第236位至第457位氨基酸殘基為START結構域，在同源盒結構域和START結構域之間是亮氨酸拉鏈(自氨基末端第89位至第235位氨基酸殘基)，可能和二聚化有關，同源盒結構域主要是和DNA結合。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述同源盒結構域和START結構域之外進行取代和/或缺失和/或添加。
所述AtHD/START1基因的編碼序列優選為序列表中的序列1。
所述植物表達載體可為現有的任何植物表達載體。所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子優選為花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子或水稻肌動蛋白基因(Actin1)啟動子。如，所述AtHD/START1基因可通過植物表達載體pCB2004C導入水稻中，所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2006導入水稻中。
所述抗逆性可為抗鹽性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
所述AtHD/START1基因可用現有的方法構建到現有的植物表達載體中，可在其轉錄超始核苷酸前加上包括組成型啟動子、增強啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、發育階段特異性啟動子在內的任何一種啟動子。為了便于對轉所述AtHD/START1基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(Bar基因、GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有所述AtHD/START1基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化水稻細胞或組織，并將轉化的水稻經組織培育成植株，獲得抗逆性提高的水稻植株。
實驗證明，水稻轉AtHD/START1基因株系(轉化體)的耐旱性明顯高于對照(未轉基因水稻)株系。通過氣孔的蒸騰作用失去水分是干旱耐受的一個重要決定因素，轉AtHD/START1基因株系葉片下表皮的氣孔密度和對照相比，降低了25％，氣孔密度的大幅度降低，使得植物通過蒸騰作用從葉片失去水分的效率降低，這可以大大提高植物對水分的保持能力。根系的生長情況是干旱耐受的另一個重要決定因素，轉AtHD/START1基因株系根的構型同樣發生了明顯變化主根變長、側根數增加、根的生物學重量增加，說明突變體的根系更加發達，這樣可以使植株在受到干旱脅迫時能持續不斷的從土壤吸水。而且轉AtHD/START1基因株系的分蘗數明顯高于對照。


圖1為水稻胚性愈傷組織的誘導和植株再生照片圖2為轉化體和對照PCR結果圖3a為轉化體和對照southern blot圖譜圖3b為轉化體和對照的RT-PCR結果圖4為轉化體和對照干旱脅迫及復水照片圖5a為轉化體和對照干旱脅迫9天復水3天的存活率統計結果圖5b為轉化體和對照干旱脅迫9天復水8天的存活率統計結果圖6a為干旱脅迫幼苗期轉化體和對照中SOD酶活性統計結果圖6b為干旱脅迫拔節期轉化體和對照中SOD酶活性統計結果圖7a為干旱脅迫幼苗期轉化體和對照中脯氨酸含量統計結果圖7b為干旱脅迫拔節期轉化體和對照中脯氨酸含量統計結果圖8a為干旱脅迫幼苗期轉化體和對照中總糖含量統計結果圖8b為干旱脅迫拔節期轉化體和對照中總糖含量統計結果圖9為轉化體和對照氣孔密度比較照片圖10a為轉化體和對照氣孔密度統計結果圖10b為轉化體和對照氣孔大小統計結果圖11為轉化體和對照根系比較照片圖12a為轉化體和對照根長的統計結果圖12b為轉化體和對照根數的統計結果圖12c為轉化體和對照根重的統計結果圖12d為轉化體和對照根冠比的統計結果圖13為轉化體和對照分蘗數比較照片圖14為轉化體和對照分蘗數的統計結果圖15為轉化體和對照光合速率比較的統計結果圖16為轉化體和對照蒸騰速率比較的統計結果圖17為轉化體和對照水分利用率比較的統計結果圖18為轉化體和對照氣孔導度比較的統計結果圖19a為pCB2006/AtHD/START1的BamHI酶切鑒定圖譜圖19b為pCB2006/AtHD/START1的EcoRI酶切鑒定圖譜圖19c為pCB2004C/AtHD/START1的BamHI酶切鑒定圖譜圖19d為pCBpCB2004C/AtHD/START1的HindIII和EcoRI雙酶切鑒定圖譜圖20為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105/pCB2004C/AtHD/START1和根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鑒定圖譜具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、轉AtHD/START1基因水稻的培育一、轉基因表達載體的構建1、AtHD/START1的cDNA基因的獲得利用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒(Invitrogen公司，Cat.No.18080-093)從Columbia生態型擬南芥(可以從擬南芥生物資源中心Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)購得)中RT-PCR擴增得到核苷酸序列是序列表中序列1的AtHD/START1的cDNA基因，具體過程如下總量RNA的抽提采用Trizol試(INVITROGEN)，使用1微克總量RNA作為反轉錄反應的模板，d(T)25作為反轉錄的引物，每個反轉錄反應使用200單位的SUPERSCRIPT II反轉錄酶(INVITROGEN)并按照反轉錄酶產品使用指南進行。RT-PCR所用引物序列按照AtHD/START1基因的序列設計，其5’末端引物是5’atgagtttcgtcgtcggcgt3’，3’末端引物是5’tcaagctgtagttgaagctgt3’，，PCR反應使用1微升反轉錄反應液為模板，其它完全按照Takara公司的ExTaq酶的使用指南進行，淬火溫度為56攝氏度，延伸時間為100秒，30個循環。PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳分離，回收并克隆到pMD18-T Vector載體上，進行測序分析，測序結果表明，該PCR擴增產物具有序列表中序列1的核苷酸序列，是AtHD/START1的cDNA基因。
2、轉基因表達載體pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的構建(1)pCB2004C的構建pCB2004C按照如下方法構建將pCAMBIA3301(CAMBIA)用BstXI和SmaI消化，在pCAMBIA3301的BstXI和SmaI識別位點間插入由依次串聯的BstXI，SstI，DraIII(a)，AscI，AvrII，SwaI，DraIII(b)，和SmaI識別序列組成的多克隆位點片段，得到重組載體pCB2002。其中SmaI識別位點是下述兩個合成的多聚核苷酸5’AGCTCACGGGGTGGCGCGCCTAGGATTTAAATCACAAAGTGCCC3’和5’GGGCACTTTGTGATTTAAATCCTAGGCGCGCCACCCCGTGAGCTCATG3’在66℃退火60秒得到的。
將Gateway Conversion A試劑盒(Invitrogen，Gateway vector Conversionsystem Cat.No.11828-019)中的Conversion A通過平末端連接插入到pCB2002的SmaI和PmlI識別位點之間就得到基礎載體pCB2003。
以pCAMBIA3301(CAMBIA)為模板，用引物5’GGGCACGGGGTGGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAA3’和5’GGGCACTTTGTGATTGTAAATAGTAATTGT3’PCR擴增煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子，將得到的煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子PCR產物用DraIII消化后，直接和用DraIII線性化后的pCB2003連接，得到質粒pCB2004。
將pCB2004使用BamHI消化后去掉氯霉素抗性基因，然后環化，得到pCB2004A。然后使用PCR引物5’-cctttggtcttctgagactgt-3’和5’-ttgagtcgtaagagactctg-3’以pSK015(Addgene Inc.質粒代號11570)為模板將4×35S增強子擴增出來，將該4×35S增強子片段使用NcoI和SacI消化后克隆至pCB2004A的NcoI和SacI之間，得到pCB2004C。
(2)pCB2006的構建以水稻的基因組DNA為模板，使用PCR引物5’-GGGCACGGGGTGTAGCTAGCATACTCGAGGTCA-3’和5’-GGGCACGTTTTGAGTAGATATCCTCGGCGTCAG-3’，PCR擴增水稻Actin1啟動子，PCR產物經DraIII消化后，與用DraIII線性化的pCB2003在T4DNA連接酶的作用下環化得到pCB2006。
(3)pCB2006/AtHD/START1和pCB2004C/AtHD/START1的構建將步驟1中得到的AtHD/START1基因的cDNA基因利用GatewayRBP ClonaseTMIIEnzyme Mix試劑盒(Invitrogen，Cat.No.11789-020)通過GatewayTMCloningTechnology重組克隆到pCB2004C或pCB2006的attR1和attR2之間，得到含有AtHD/START1基因的重組表達載體pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1。利用BamHI或EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1進行結構鑒定，結果如圖19a和19b所示，BamHI單酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小為1988bp(包括172bp Actin 1啟動子部分和1812bp AtHD/START1cDNA 5’端)片段，9757bp的pCB2006/AtHD/START1兩個BamHI位點間的載體骨架部分；EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1得到大小為2003bp的載體pCB2006/AtHD/START1兩個EcoRI位點的部分(包括878bp Actin 1啟動子部分和1125bp AtHD/START1cDNA 5’端片段)，和pCB2006/AtHD/START1兩個EcoRI位點之間的9742bp載體骨架部分。說明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2006的attR1和attR2之間。利用BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1、HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1進行結構鑒定，結果如圖19c和19d所示，BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小為3764bp的片段(包括4x35S增強子、35S啟動子和AtHD/START1cDNA的一部分)和8689bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1兩個BamHI位點之間載體骨架部分)；HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1得到大小為666bp的片段(AtHD/START1cDNA上EcoRI和HindIII位點之間的部分)，和11817bp的片段(pCB2004C/AtHD/START1EcoRI和HindIII位點之間載體骨架部分)；說明AtHD/START1基因的cDNA基因插入到了pCB2004C的attR1和attR2之間。
圖19a中，泳道1、2、3為BamHI單酶切pCB2006/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10K)；圖19b中，泳道1、2、3為EcoRI單酶切pCB2006/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10K)；圖19c中，泳道1、2、3為BamHI單酶切pCB2004C/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNAladder(250bp-10K)；圖19d中，泳道1、2、3為HindIII和EcoRI雙酶切pCB2004C/AtHD/START1的結果，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10K)。
二、農桿菌介導的遺傳轉化1、含有pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株的制備將-70℃保存的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105涂布在LB(含慶大霉素50ug/ml)28℃培養活化。然后取4-5個單菌落接種于3mlLB液體培養基(含慶大霉素50ug/ml)過夜培養。將過夜培養的菌液按1∶100的體積比接種于500ml的LB液體培養基(含慶大霉素50ug/ml)，250rpm，28℃，培養至OD600＝1.0左右。5000rmp離心收集菌體，然后用預冷的等體積的無菌去離子水重懸，重復七次，最終將菌體重懸于0.5ml的10％甘油中。取10ng的pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1質粒分別與50ul根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受態細胞(根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105感受態細胞按照英文影印版《擬南芥實驗手冊》.DetlefWeigel and Jane Glazebrook.化學工業出版社.2004年3月第1版，第1次印刷的方法制備)混合均勻后，加入到預冷的電極杯中(0.2mm，Biorad公司)。使用Agr電擊程序(所購買的儀器自帶的電擊程序，在儀器的說明書上，說明書為MicroPulserTMElectroporation Apparatus Operation Instruction andApplications Guide，Catalog Number 165-2100)。電擊后加入SOC培養基復蘇4小時后，涂布含慶大霉素50ug/ml和卡那霉素50ug/ml的LB培養基，28℃，培養兩天。取單菌落擴增AtHD/START1基因中的片段(引物序列為5’-GCA ACA TGA GAGAGC AGA TAA TA-3’和5’-TCA AGA AGC AAA TCT TTC ACA CAT T-3’)進行菌落PCR驗證。PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段條帶的pCB2004C/AtHD/START1轉化的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105是含有pCB2004C/AtHD/START1的菌株，命名為根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1，PCR得到1091bp的AtHD/START1基因片段條帶的pCB2006/AtHD/START1轉化的根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105是含有pCB2006/AtHD/START1的菌株，命名為根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2006/AtHD/START1。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1和根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105/pCB2006/AtHD/START1的菌落PCR鑒定結果如圖20所示，泳道1-9是根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2004C/AtHD/START1的PCR結果，泳道10-16是根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pCB2006AtHD/START1的PCR結果，均得到1091bp AtHD/START1基因片段條帶，M為Fermentas DNA ladder(250bp-10K)。
2、水稻成熟種子愈傷組織的誘導和繼代1)成熟水稻中花11種子(安徽天禾水稻種業有限責任公司)，手工去種殼，備用；2)取種子于無菌三角瓶，70％乙醇浸洗30sec，倒去乙醇，無菌水清洗一遍；3)0.1％的升汞溶液浸泡消毒15-20min，無菌水清洗5-6遍，滅菌后的種子置于無菌濾紙上，盡量吸干水分；4)滅菌好的種子播種于誘導培養基(MS+2，4-D 2.5mg/L)，26±1℃暗培養4-6周；5)將長出的淡黃色顆粒狀的愈傷組織轉入繼代培養基(J3+2，4-D 2.5mg/L)，繼續于26±1℃暗培養2-3周，此時的愈傷組織即可用于轉化。
3、水稻愈傷組織的轉化和植株再生1)選取致密、干燥顆粒狀胚性愈傷組織于預培養培養基(MS+2，4-D0.75mg/L)，26±1℃暗培養4天；2)挑取根癌農桿菌EHA105/pCB2004C/AtHD/START1或根癌農桿菌(Agrobacterium tumefac1ens)菌株EHA105/pCB2006/AtHD/START1單菌落接種于10ml含250μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養基中，28℃培養過夜至對數生長后期(約17hr)，于4℃，5000rpm，離心10min，收集菌體，用含250μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養基稀釋菌體至OD600為0.8-1.0，待用；3)預培養過的胚性愈傷組織轉入稀釋后的農桿菌菌液，共培養30min；4)共培結束，倒去菌液，將愈傷組織置于無菌濾紙，吸去多余菌液；5)轉移愈傷組織至共培培養基(MS+2，4-D 0.75mg/L+100μmol/L乙酰丁香酮)，19-20℃暗培養3天；6)3天后，將愈傷組織轉入帶蓋50ml無菌管，用含400mg/L羧芐青霉素的無菌水浸洗20-30min，無菌水清洗愈傷組織6-7遍；7)無菌濾紙盡量吸干愈傷組織外水分；8)吸干水的愈傷組織轉入附加400mg/L羧芐青霉素和25mg/L除草劑草銨膦(glufosinate ammoniums)的選擇培養基(J3+2，4-D 0.6mg/L)上生長，每2周繼代一次，繼代2-3次；9)在選擇培養基上生長出的抗性愈傷組織轉移至附加200mg/L羧芐青霉素和25mg/L除草劑的預分化培養基(N6+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L)，26±1℃暗培養5-7天；10)轉移預分化培養基上的愈傷組織至附加200mg/L羧芐青霉素和25mg/L除草劑glufosinate ammonium的分化培養基(N6+6-BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA0.05mg/L)，26±1℃光照培養；11)愈傷組織分化出的芽長至3-5cm時，切下芽，移入附加25mg/L除草劑glufosinate ammonium的生根培養基(MS0)，26±1℃光照培養生根；12)幼苗長至約8-10cm高，培養瓶開蓋煉苗1-2天，洗去根部植物凝膠，種植于田間，常規管理，成熟收種。
結果表明去殼滅菌的種子播種于誘導培養基之后約3-4周，種胚處開始膨大并長出顆粒狀愈傷組織，至7-8周時，已有大量的愈傷組織生成(圖1中a)，將誘導生成的愈傷組織轉移到繼代培養基繼續生長，3周后可以看到大量淡黃色顆粒狀愈傷組織形成(圖1中b)，選擇表面干燥、胚性強的淡黃色顆粒狀的愈傷組織繼續預培養4天(圖1中c)，即可進行轉化。圖1中d是在選擇培養基上長出的抗性愈傷組織，從圖1中d可看到，轉化未成功的愈傷組織，在選擇培養基上經過一定時間選擇后，褐化、死亡，而有些愈傷組織在選擇培養基上則可以進行生長，并在原來愈傷組織的周圍長出小顆粒狀的抗性愈傷組織。抗性愈傷組織2周繼代一次，繼代3次后，將抗性愈傷先置于預分化培養基培養1周(圖1中e)，再轉入分化培養基分化，圖1中f即是在預分化培養基上分化出的苗，為確保得到的轉化體是每個不同的個體，每塊愈傷組織分化出的苗只保留一株；分化出的苗轉入生根培養基，由于生根培養基中加入了20mg/L高濃度的除草劑，因此，分化的苗在轉入生根培養基后，約有20％不能在生根培養基上生根，最后枯黃死去，而80％的分化苗都可以在生根培養基上生根(圖1中g)，其生根速度非常快，在移入生根培養基24小時即可看到白色的根從分化苗的基部長出，一周即可長成；轉化體(T0代)生根后，將培養瓶的封口膜打開煉苗，煉苗結束即可移入大田(圖1中h)。移栽時一定要洗干凈根部植物凝膠，否則很容易造成移栽幼苗因長菌而死亡，移栽至大田的水稻幼苗進行常規田間管理，轉化體和對照均正常成熟(圖1中i)、收種(圖1中j)，得到T0代轉化體的種子(T1代)。
圖1中，a、誘導50天的愈傷組織；b、繼代20天的愈傷組織；c、愈傷組織預培養；d、轉化后在選擇培養基上長出抗性愈傷組織；e、抗性愈傷組織預分化；f、抗性愈傷組織分化出苗；g、在含除草劑的培養基上生根；h、轉化體移栽入大田；i、轉化體在大田成熟；j、收獲的轉化體種子。
水稻中一些適合于被農桿菌轉化的組織或細胞，包括分生組織(如莖尖和根尖等)，以及幼穗和幼胚或成熟胚來源的愈傷組織等，因為胚性愈傷組織分裂活動比較旺盛，細胞狀態比較敏感，易于接收外源基因的導入和整合，實驗中幼穗和幼胚的出愈率和愈傷組織的分化率都比成熟胚誘導的愈傷組織要高，但獲得幼穗和幼胚的時間較短，取材受到很大限制，因此本實驗選用的是水稻種子的成熟胚誘導愈傷，雖然成熟水稻種子由于其組織已經完全分化，細胞脫分化和再分化能力比幼穗和幼胚差，但種子保存較容易，取材不受限制，可以根據需要隨時取用，因此可作為誘導愈傷組織和遺傳轉化的理想材料。
優化組織培養和共培養條件是水稻遺傳轉化成敗的一個關鍵因素。本實驗采用了Y.J.Lin等的誘導培養基(MS+2，4-D 2.5mg/L)，是基本培養基附加2.5mg/L的2，4-D；繼代培養基和誘導培養基相同，但是糖類從蔗糖換成了麥芽糖；隨后的預培養培養基、懸浮培養基、共培養培養基以及選擇培養基都使用了麥芽糖，且始終使用了不同濃度的2，4-D，在選擇培養過程中，固化培養基使用了瓊脂糖，預分化和再生培養基中附加了高濃度的細胞分裂素，共培養培養基也附加了100μmol/L乙酰丁香酮，此外還增加了葡萄糖，添加乙酰丁香酮，增加誘導物的濃度以促進農桿菌vir區基因的活化與表達，對轉化愈傷組織也是至關重要的。愈傷組織誘導所需要的激素濃度在不同品種的植物中差別很大，本實驗選用2.0mg/L的2，4-D；培養基的pH值也是一個重要因素，低pH值有利于誘導vir基因的表達，因此農桿菌在侵染和與愈傷組織共培養時應處于較低的pH值條件下，本實驗為5.2。
三、轉化體的鑒定1、轉化體的PCR鑒定在除草劑中生根的水稻幼苗，移栽至田間完全成活后，取葉片，CTAB法提取轉化體(轉pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的水稻中花11，在圖中以轉化體表示)以及對照(未轉基因的水稻中花11，在圖中以WT表示)基因組DNA，用于PCR鑒定。轉化體的標記基因是Bar基因，引物設計根據Bar基因兩端序列，上下游引物序列分別為P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA。PCR反應體系(50μl體系)DNA聚合酶Ex Taq(5U/μl)0.25μl，10×ExTaq buffer 5μl，dNTPs(四種dNTP，每種各10mM)4μl，P1(10μM)2μl，P2(10μM)2μl，基因組DNA 2μl，ddH2O 34.75μl。
PCR反應程序先95℃ 5min；然后94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 30sec，共40個循環；再72℃ 10min；最后4℃保存。PCR擴增產物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
從結果如圖2所示，轉化體株系可以擴增出552bp的Bar基因目的條帶，而對照未能擴出相應條帶。圖2中，MMarker；WT對照；其余泳道為不同轉化單株。其中，8-1中轉入的是pCB2004C/AtHD/START1，2-56、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1中轉入的是pCB2006/AtHD/START1。
2、轉基因植株Southern blot分析1)在除草劑中生根的水稻幼苗，移栽至田間完全成活后，取葉片，CTAB法提取轉化體(轉pCB2004C/AtHD/START1或pCB2006/AtHD/START1的水稻中花11，在圖中以轉化體表示)以及對照(未轉基因的水稻中花11，在圖中以WT表示)的基因組DNA，根據轉入的外源基因AtHD/START1基因、Bar基因序列以及質粒本身酶切位點，選擇SacI對水稻基因組DNA進行酶切消化，酶切完全后，用1×TAE緩沖液，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，電壓1V/cm，電泳12-14hr；電泳結束，紫外燈下拍照記錄；2)將DNA轉移尼龍膜上，轉移后的尼龍膜，裝入雜交管，加入新配制的雜交液(雜交液的組成為SDS 7％，BSA(Casein)1％，EDTA 1mM，Na2HPO4·12H2O0.25M)10-15ml，于65℃預雜交至少6hr；3)加入變性過的放射性標記探針(該探針為Bar基因)，65℃雜交16-20hr；雜交結束，含探針的雜交液倒入指定廢液缸；4)加入100ml 2×SSC+0.1％SDS，旋緊蓋子，翻轉管子幾次，洗膜，整個操作在室溫下進行，洗后的溶液倒入盛放放射性物質的廢液缸；5)加入200ml 2×SSC+0.1％SDS，于雜交爐室溫洗膜5min，其余同4)；6)加入200ml 0.2×SSC+0.1％SDS，雜交爐室溫洗膜5min，其余同5)；7)加入200ml 0.1×SSC+0.1％SDS，雜交爐室溫洗膜5min，其余同5)；8)加入200ml 65℃預熱的0.1×SSC+0.1％SDS，65℃雜交爐中洗膜10-30min，其余同5)；9)將膜置于一塑料盒，用SURVEY METER檢測放射性強度，依放射性強度的大小，邊檢測邊用65℃預熱的0.1×SSC+0.1％SDS洗，直至合適強度。
10)洗膜結束，濾紙吸干膜上多余洗液，保鮮膜包裹尼龍膜；暗室中曝光，將膜固定在有高速增感屏的壓片夾中，-80℃超低溫冰箱放射自顯影，拍照。
其中，探針按照如下方法制備①微量離心管中配制下列反應液，95℃加熱3min，迅速置于冰中冷卻，放置5min。
模板 10ng-1μg隨機引物(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自帶) 2μldH2O直到14μl。
其中，模板是以pCB2004C為模板，用P1TCAAATCTCGGTGACGGGCA；和P2GTCTGCACCATCGTCAACCACTA得到的PCR產物。
②加入10×Buffer(TaKaRa公司的Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2，30reactions，codeD6045，自帶)，dNTP Mixture(四種dNTP，每種各0.2uM/μl)2.5μl，用于標記的dCTP*2(50μCi)5μl。
③加入1μl Exo-free Klenow Fragment(2U/μl)，37℃反應60-120min；④65℃加熱5min使酶失活；⑤95℃加熱3min后迅速置于冰中冷卻；⑥取反應液直接作為探針使用。
結果如圖3a所示，轉化體可以雜交出條帶，對照沒有，進一步證明水稻轉化成功。圖3a中，WT對照；其余泳道為不同轉化單株。
3、AtHD/START1基因在轉化體中的表達分析取經步驟1的PCR鑒定和步驟2的Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系的T0代幼苗和對照幼苗(在圖中以WT表示)進行RT-PCR。
在轉化體和對照營養生長階段，取葉片用Trizol法抽提RNA，反轉錄cDNA，進行RT-PCR，以水稻tubulin作內標，檢測轉入基因在轉化體內的表達情況。
(1)Trizol試劑盒提取水稻葉片RNA1)分別取50mg生長旺盛轉化體和對照葉片，加入1ml Trizol，室溫研磨，放置5min；2)4℃，12000g，離心10min，取上清，室溫放置5min；3)上清加入200μl氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置3min；4)4℃，12000g，離心15min，取上清并加入500μl異丙醇；5)室溫放置10min，4℃，12000g，離心10min；6)棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，7500g，離心5min；7)棄上清，沉淀晾5min，10μl DEPC-H2O溶解；8)紫外分光光度計測定A260、A280，檢查RNA質量并計算濃度，備用。
(2)RT-PCR1)向管中加入RNA 3μg、Oligo d(T)2550pmol、dNTP(10mM)1μl、再加入dH2O 直到14μl，混勻，65℃，5min，取出置冰上至少1min；同管中加入5×FS buffer(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒自帶，該試劑盒的商品目錄號為Cat.No.18080-093)4μl、0.1M DTT 1μl、SSRTase III(Invitrogen公司的SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase試劑盒自帶，該試劑盒的商品目錄號為Cat.No.18080-093)1μl、至總體積20μl，50℃水浴，60min，得到cDNA的第一鏈。
2)以反轉錄得到的cDNA為模板，擴增水稻tubulin，上下游引物序列為P3GGAGATCCTCCACATCCAG；P4CAGAAAGGGTAGCATTGTAAG；以rTaq PCR試劑盒(Takara公司)進行PCR擴增，PCR擴增體系(總體積20μl)為rTaq(U/μl)0.1μl，10×ExTaq buffer 2μl，dNTPs(四種dNTP，每種各10mM)1.6μl，P3(10μM)2μl，P4(10μM)2μl，模板1μl，dH2O 11.3μl。PCR擴增條件先95℃ 3min；然后94℃ 30sec、68℃ 1min，35個循環；再72℃ 10min；最后4℃保存。
3)調整內標，擴增AtHD/START1基因，引物序列為P5AT GAG TTT CGT CGTCGG CGT；P6TCA CTT TAG TGC ACT ATT ATC TGC T；以rTaq PCR試劑盒(Takara公司)進行PCR擴增，PCR擴增體系除將引物替換為P5和P6外，其他同tubulin的PCR擴增體系；PCR擴增條件先95℃ 3min；然后94℃ 30sec、56℃ 30sec、72℃ 30sec，40個循環；再72℃ 10min；最后4℃保存。結果如圖3b所示，表明轉入的基因在轉化體內均有表達，但在不同的轉化體中表達量稍有不同2-56和14-16轉化單株的表達量比其他幾個株系略高，而別的轉化單株的表達量基本沒有區別。圖3b中，WT對照；其余泳道為不同轉化單株。
實施例2、轉AtHD/START1基因水稻的抗旱性檢測及其生理生化特性測定將經實施例1的PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系的種子得到的幼苗和對照(在圖中用WT表示)幼苗進行如下抗旱性檢測及其生理生化特性測定，每個轉化體株系和對照均40株。
1、轉化體抗旱性鑒定將收獲的T0代水稻種子播種在MS0(不含任何激素的MS)含20mg/L除草劑glufosinate ammonium培養板上，每個轉基因株系和對照播種40粒，在除草劑板上全部萌發的株系作為純合體，將在除草劑板上萌發的幼苗移栽至同樣大小的花盆中(花盆中花土已稱重，花土重量相同，以盡量保證生長環境條件一致)，每盆栽9株，在幼苗完全成活并旺盛生長后，選取生長狀態良好并一致的轉化體和對照，充分吸透水，然后進行干旱脅迫處理(持續不澆水)，并在干旱脅迫不同時間后進行耐旱相關生理生化指標的測定及復水后的形態觀察。
選取生長狀態一致、生長良好的轉化體和對照同時進行干旱脅迫實驗，干旱脅迫5天時，對照大部分葉片已卷曲、干枯，下部葉片開始枯黃、死亡，只有少量葉片還保持展開狀態，而轉化體只是最外層葉片開始卷曲，大部分葉片仍保持挺立姿態繼續生長(圖4中a)；干旱脅迫9天后，對照葉片幾乎全部卷曲枯黃，幾乎無綠色葉片，轉化體雖然也因失水葉片發生了卷曲，但植株葉片仍為綠色，只是失水導致的葉綠素被破壞而致葉尖發黃，對轉化體和對照進行復水，復水3天后，對照僅有少量的植株恢復存活，存活的狀態不好，只有心葉是綠色，但轉化體葉片大部分都開始重新挺立，僅僅外部葉片還是卷曲狀態，未能完全恢復(圖4中b)，復水8天，有更多轉化體葉片挺立，整株植株基本恢復干旱脅迫前的生長狀態，也有個別單株死亡，對照只是有個別單株恢復生長，大部分都已死亡(圖4中c)。將干旱脅迫9天后，復水3天和復水8天的植株進行存活率統計，統計結果表明，復水3天時，只有10％對照復活，而轉化體有85％存活，復水8天，對照存活率上升至18％，轉化體達到93％，可見轉化體的耐旱性遠遠大于對照，干旱脅迫9天后，復水3天和復水8天的轉化體的存活率與對照均呈現極顯著差異(p＜0.01)(圖5a和圖5b、表1、表2)。
表1干旱脅迫9天復水3天不同轉化株系存活率

表2干旱脅迫9天復水8天不同轉化株系存活率

圖4只是一個轉化體株系12-35的照片。圖4中，a、干旱脅迫5天；b、干旱脅迫9天，復水3天；c、干旱脅迫9天，復水8天。3個圖片中，左邊的三盆均為對照，右邊的三盆均為轉化體。
表1和2中，WT為40株對照的統計結果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1為7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果。圖5a和圖5b中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。
2、轉化體抗旱性相關生理指標的測定(方法見《植物生理學實驗指南》.中國科學院上海植物生理研究所、上海市植物生理學會編。科學出版社。2004年)(1)SOD酶活性測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中SOD酶活性。具體方法如下1)粗酶液制備分別取每株轉化體和對照水稻幼苗葉片0.5g，加入5倍于樣品量的50mmol/L pH7.8磷酸緩沖液[含0.1mM EDTA；0.3％(0.3g/100ml)TritonX-100；4％(4g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮(pvpp，polyvinylpolyrrolidone)]，研磨后倒入離心管中，以10,500g離心20min，上清液為粗酶液。
2)酶活性測定在盛有3ml反應混合液(在54ml 14.5mM dl-甲硫氨酸中分別加入均以50mM pH7.8磷酸緩沖液配制的3μMEDTA，2.25mM NBT和60μM核黃素各2ml，溶液均在用前配制，避光放置)的試管中，加入SOD粗酶液，混合后放在試管架上，在光照培養架內照光10min，取出試管，迅速測定OD560值，以不加酶液的照光管為對照。
3)計算酶活性＝酶單位/樣品量＝反應被抑制％/(50％)×3ml反應混合液中加入的樣品量。
轉化體和對照干旱脅迫開始后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中SOD酶活性，結果表明干旱脅迫3天時，轉化體SOD酶活性比對照SOD酶活性已有升高，但未表現出明顯差異，幼苗期和拔節期基本一致，干旱脅迫5天，幼苗期轉化體的SOD酶活性比對照高了近一倍，而拔節期的差異卻比較小，兩者之間只有很小差別；干旱脅迫7天時，幼苗期對照的SOD酶活性只有轉化體的三分之一，拔節期的差異還是比較小，而且干旱脅迫7天后，無論是幼苗期還是拔節期的SOD酶活性都呈現下降的趨勢(圖6a和圖6b)，可能是因為在干旱脅迫7天后，無論是對照還是轉化體的葉片都發生了卷曲，特別是對照，葉片由于嚴重失水象枯草一樣，因此也就導致了酶的活性下降。圖6a和圖6b中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。
(2)游離脯氨酸的測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中脯氨酸含量。具體方法如下1)脯氨酸提取分別取每株轉化體和對照水稻幼苗葉片0.1g，用3％(3g/100ml)磺基水楊酸溶液研磨提取，磺基水楊酸的最終體積為5ml，勻漿液轉入離心管中，沸水浴浸提10min。冷卻后，以3000rpm離心10min，取上清液待測。
2)含量測定(a)標準曲線制作在1-10μg/ml脯氨酸濃度范圍內制作標準曲線。取標準溶液各2ml，加入2ml 3％磺基水楊酸、2ml冰乙酸和4ml 2.5％(2.5g/100ml)茚三酮溶液，置沸水浴中顯色60min。冷卻后，加入4ml甲苯萃取紅色物質。靜置，取甲苯相測定520nm處的吸收值，依據脯氨酸量和相應吸收值繪制標準曲線。
(b)樣品測定取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等顯色試劑，同標準曲線程序進行顯色、萃取和比色。
結果表明干旱脅迫3天時，無論是幼苗期還是拔節期，轉化體脯氨酸含量比對照都略有升高，但未表現出明顯差異，干旱脅迫5天和干旱脅迫7天，幼苗期和拔節期轉化體脯氨酸含量仍比對照中脯氨酸含量高，但差異都未達顯著水平；幼苗期和拔節期，不同干旱脅迫時間脯氨酸含量在轉化體和對照間呈現較一致的趨勢，未見有大的差異，但脅迫發生后，在轉化體體內積累了更多的脯氨酸，以幫助其抵抗脅迫。(圖7a和圖7b)。圖7a和圖7b中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。
(3)可溶性總糖的測定轉化體和對照開始干旱脅迫后，依照干旱脅迫不同時間取轉化體和對照葉片，測定樣品中總糖含量。具體方法如下1)試劑(a)葡萄糖標準液準確稱取分析純無水葡萄糖0.2000g，蒸餾水溶解并定容至200ml，使用時稀釋10倍，其濃度為100μg/ml；(b)蒽酮試劑稱取蒽酮1g溶于72％H2SO4溶液1000ml(98％濃H2SO4760ml+蒸餾水240ml)，貯于棕色瓶，冰箱保存，可用2-3周；2)標準曲線繪制取干燥潔凈的試管6支(0-5號)，依次加入葡萄糖標準溶液0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml(各管葡萄糖量依次為0、20、40、60、80、100μg)和蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再分別加入蒽酮試劑5ml，搖勻后沸水中10min，取出冷卻后于620nm下比色，記錄OD620值，繪出標準曲線。
3)樣品提取分別取每株轉化體和對照水稻幼苗新鮮葉片1.0g，加入少量石英沙及去離子水研磨至勻漿，連同殘渣用去離子水定容至100ml，室溫下靜置60min(經常搖動)，過濾棄殘渣。
4)樣品測定取干潔試管，分別加入樣液1ml和蒽酮試劑5ml，搖勻后，沸水浴10min，冷卻后620nm比色(標準曲線空白做零點)，記錄OD620值。
5)結果計算按照公式C＝AN/W計算。
其中C-樣品可溶性糖含量(μg/g葉片)；A-標準曲線查得的可溶性糖(μg)；W-樣品重量(g)；N-樣品提取液占樣品反應液的倍數。
結果表明干旱脅迫3天，無論是幼苗期還是拔節期，轉化體的總糖含量比對照株中的總糖含量都略有升高，但未表現出明顯差異，干旱脅迫5天和干旱脅迫7天時，幼苗期和拔節期轉化體的總糖含量都還是比對照中的總糖含量高，但差異都未達顯著水平；幼苗期和拔節期，不同干旱脅迫時間的總糖含量在轉化體和對照之間呈現比較一致的趨勢，未見有大的差異，和脯氨酸的變化趨勢一致(圖8a和圖8b)。圖8a和圖8b中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。
實施例3、轉AtHD/START1基因水稻的相關生物學性狀觀察將經實施例1的PCR鑒定和Southern blot分析結果均為陽性的T0代轉化體2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系的種子得到的幼苗和對照(在圖中用WT表示)幼苗進行如下生物學性狀觀察，每個轉化體株系和對照均40株。
將收獲的T0代水稻種子播種在MS0(不含任何激素的MS)含20mg/L除草劑glufosinate ammonium培養板上，每個轉基因株系和對照播種40粒，在除草劑板上全部萌發的株系作為純合體，將在除草劑板上萌發的幼苗移栽至同樣大小的花盆中(花盆中花土已稱重，花土重量相同，以盡量保證生長環境條件一致)，每盆栽9株，在幼苗完全成活并旺盛生長后，選取生長狀態良好并一致的轉化體和對照進行相關生物學指標的觀察。
1、葉片氣孔密度和大小觀察1)選取生長狀態一致的轉化體和對照，取同樣葉位的同樣部位；2)在載玻片上均勻涂抹恒固502強力膠水，將選定的水稻葉片區域下表皮緊貼于涂有膠水的載玻片上，用力按壓；3)膠水凝固后，將葉片剝離載玻片，水稻葉片下表皮氣孔即被拓于載玻片；4)顯微鏡下觀察氣孔，記錄每一視野中氣孔數，每個葉片至少記錄50個視野，根據測微尺計算每個視野面積，計算葉片氣孔密度(個/mm2)。
5)記錄氣孔數的同時，測微尺測量氣孔長度和寬度，氣孔長度以氣孔縱軸最長處計算，氣孔寬度以垂直于縱軸最寬處計算。
圖9中a和b分別為對照和轉化體葉片下表皮氣孔的200倍光鏡照片，圖9中c和d分別為對照和轉化體葉片下表皮氣孔的400倍光鏡照片，從200倍和400倍的氣孔光鏡照片，很難看出對照和轉化體在氣孔密度上是否存在差異，在統計至少50個視野氣孔數量后，計算氣孔密度并做統計分析，發現不僅轉化體和對照之間在氣孔的數量上存在極顯著差異(p＜0.01)(圖10a，表3)，而且在氣孔大小上也存在極顯著差異(p＜0.01)(圖10b)。由于水稻葉片氣孔很難觀察，因此只能用拓片的方法將氣孔拓下來進行觀察、記錄，這樣就無法觀察與統計表皮細胞變化情況，也難以計算出氣孔指數，從水稻轉化體和對照氣孔變化情況可看出，轉化體和對照的差異要小于在水稻中觀察到的氣孔變化。
表3不同轉化株系氣孔密度


圖9只是一個轉化體株系2-56的照片。圖9中，a、對照下表皮氣孔(200倍)；b、轉化體下表皮氣孔(200倍)；c、對照下表皮氣孔(400倍)，d、轉化體下表皮氣孔(400倍)。圖10a和圖10b中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。表3中，WT為40株對照的統計結果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1為7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果。
2、根系的觀察選取生長狀態一致的轉化體和對照，旺盛生長期時小心挖出各植株，小心洗去根部附著的泥土，觀察根系情況，同時記錄每盆中所有植株的根長(以最長的一根計算)、根數，稱量記錄每株根重、冠重。
在旺盛生長期時將轉化體和對照每盆中苗全部挖出，觀察根系情況，苗從盆中挖出后，將所有苗歸攏在一起，可以明顯看出轉化體根的群體比對照要粗、壯、長，單株拍照可以明顯看出這點(圖11)，每盆中單株都測量其根長并數其根數后做統計分析，可看出轉化體和對照之間根長差異達到顯著水平(p＜0.05)(圖12a)，而根數差異則達到極顯著差異水平(p＜0.01)(圖12b)；將根從莖的基部剪下，分別稱量根重和地上部分重量，然后計算其根冠比，轉化體和對照之間的根重差異達到了顯著差異水平(p＜0.05)(圖12c)，而根冠比在轉化體和對照之間同樣也表現出了顯著差異(p＜0.05)(圖12d)。
表4不同轉化株系根系情況

圖11只是一個轉化體株系64-1的照片。圖11中，a、群體比較；b、單株比較；a和b中均是左為轉化體，右為對照。圖12a、圖12b、圖12c和圖12d中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。表4中，WT為40株對照的統計結果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1為7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果。
3、分蘗的觀察選取生長狀態一致的轉化體和對照，旺盛生長期時記錄每株苗的分蘗數。
表5不同轉化株系分蘗數

結果表明轉化體的苗幾乎都有多個分蘗(圖13中a、b和c)，出轉化體的分蘗數明顯高于對照(圖13、14)，記錄每盆中每株苗的分蘗情況，進行數據統計分析，轉化體和對照之間的分蘗差異達到了顯著水平(圖14和表5)。圖13只是一個轉化體株系64-1的照片。圖13中，a是對照分蘗情況，b是轉化體分蘗情況，c是單株對比(左為轉化體，右為對照)。圖14中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。表5中，WT為40株對照的統計結果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1為7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果。
4、轉化體光合指標的測定選取生長狀態一致的轉化體和對照，測定相同葉位的光合速率(μmol CO2/m2s)、蒸騰速率(μmolH2O/m2s)、水分利用率(mg/g)和氣孔導度(mmol/m2s)，測定時，每盆中的每株苗都必須測定，統計測定結果。所用儀器為PB0402光合蒸騰儀。
在水稻營養生長階段，用光合測定儀對各植株進行光合指標的測定。每盆中的每株苗都測，結果表明轉化體的光合速率高于對照，且差異達到了顯著水平(p＜0.05)(圖15)，轉化體的水分利用率也比對照要高(圖17)，但并未達到顯著差異的水平；而對照的蒸騰速率和氣孔導度則都比轉化體要高(圖16、圖18)，但也沒有達到顯著差異水平。
表6不同轉化株系光合指標

圖15-18中，轉化體為2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1等7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果，對照是40株的統計結果。表6中，WT為40株對照的統計結果，2-56、8-1、12-35、13-3、14-16、15-70和64-1為7個轉化體株系、每個株系40株的統計結果。
序列表<160>2<210>1<211>2169<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgagtttcg tcgtcggcgt cggcggaagt ggtagtggaa gcggcggaga cggtggtggt 60agtcatcatc acgacggctc tgaaactgat aggaagaaga aacgttacca tcgtcacacc 120gctcaacaga ttcaacgcct tgaatcgagt ttcaaggagt gtcctcatcc agatgagaaa 180cagaggaacc agcttagcag agaattgggt ttggctccaa gacaaatcaa gttctggttt 240cagaacagaa gaactcagct taaggctcaa catgagagag cagataatag tgcactaaag 300gcagagaatg ataaaattcg ttgcgaaaac attgctatta gagaagctct caagcatgct 360atatgtccta actgtggagg tcctcctgtt agtgaagatc cttactttga tgaacaaaag 420cttcggattg aaaatgcaca ccttagagaa gagcttgaaa gaatgtctac cattgcatca 480aagtacatgg gaagaccgat atcgcaactc tctacgctac atccaatgca catctcaccg 540ttggatttgt caatgactag tttaactggt tgtggacctt ttggtcatgg tccttcactc 600gattttgatc ttcttccagg aagttctatg gctgttggtc ctaataataa tctgcaatct 660cagcctaact tggctatatc agacatggat aagcctatta tgaccggcat tgctttgact 720gcaatggaag aattgctcag gcttcttcag acaaatgaac ctctatggac aagaacagat 780ggctgcagag acattctcaa tcttggtagc tatgagaatg ttttcccaag atcaagtaac 840cgagggaaga accagaactt tcgagtcgaa gcatcaaggt cttctggtat tgtcttcatg 900aatgctatgg cacttgtcga catgttcatg gattgtgtca agtggacaga actctttccc 960tctatcattg cagcttctaa aacacttgca gtgatttctt caggaatggg aggtacccat 1020gagggtgcat tgcatttgtt gtatgaagaa atggaagtgc tttcgccttt agtagcaaca 1080cgcgaattct gcgagctacg ctattgtcaa cagactgaac aaggaagctg gatagttgta 1140aacgtctcat atgatcttcc tcagtttgtt tctcactctc agtcctatag atttccatct 1200ggatgcttga ttcaggatat gcccaatgga tattccaagg ttacttgggt tgaacatatt 1260gaaactgaag aaaaagaact ggttcatgag ctatacagag agattattca cagagggatt 1320gcttttgggg ctgatcgttg ggttaccact ctccagagaa tgtgtgaaag atttgcttct 1380
ctatcggtac cagcgtcttc atctcgtgat ctcggtggag tgattctatc accggaaggg 1440aagagaagca tgatgagact tgctcagagg atgatcagca actactgttt aagtgtcagc 1500agatccaaca acacacgctc aaccgttgtt tcggaactga acgaagttgg aatccgtgtg 1560actgcacata agagccctga accaaacggc acagtcctat gtgcagccac cactttctgg 1620cttcccaatt ctcctcaaaa tgtcttcaat ttcctcaaag acgaaagaac ccgtcctcag 1680tgggatgttc tttcaaacgg aaacgcagtg caagaagttg ctcacatctc aaacggatca 1740catcctggaa actgcatatc ggttctacgt ggatccaatg caacacatag caacaacatg 1800cttattctgc aagaaagctc aacagactca tcaggagcat ttgtggtcta cagtccagtg 1860gatttagcag cattgaacat cgcaatgagc ggtgaagatc cttcttatat tcctctcttg 1920tcctcaggtt tcacaatctc accagatgga aatggctcaa actctgaaca aggaggagcc 1980tcgacgagct caggacgggc atcagctagc ggttcgttga taacggttgg gtttcagata 2040atggtaagca atttaccgac ggcaaaactg aatatggagt cggtggaaac ggttaataac 2100ctgataggaa caactgtaca tcaaattaaa accgccttga gcggtcctac agcttcaact 2160acagcttga 2169<210>2<211>722<212>PRT<213>擬南芥屬擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Ser Phe Val Val Gly Val Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly1 5 10 15Asp Gly Gly Gly Ser His His His Asp Gly Ser Glu Thr Asp Arg Lys20 25 30Lys Lys Arg Tyr His Arg His Thr Ala Gln Gln Ile Gln Arg Leu Glu35 40 45Ser Ser Phe Lys Glu Cys Pro His Pro Asp Glu Lys Gln Arg Asn Gln50 55 60Leu Ser Arg Glu Leu Gly Leu Ala Pro Arg Gln Ile Lys Phe Trp Phe65 70 75 80
Gln Asn Arg Arg Thr Gln Leu Lys Ala Gln His Glu Arg Ala Asp Asn85 90 95Ser Ala Leu Lys Ala Glu Asn Asp Lys Ile Arg Cys Glu Asn Ile Ala100 105 110Ile Arg Glu Ala Leu Lys His Ala Ile Cys Pro Asn Cys Gly Gly Pro115 120 125Pro Val Ser Glu Asp Pro Tyr Phe Asp Glu Gln Lys Leu Arg Ile Glu130 135 140Asn Ala His Leu Arg Glu Glu Leu Glu Arg Met Ser Thr Ile Ala Ser145 150 155 160Lys Tyr Met Gly Arg Pro Ile Ser Gln Leu Ser Thr Leu His Pro Met165 170 175His Ile Ser Pro Leu Asp Leu Ser Met Thr Ser Leu Thr Gly Cys Gly180 185 190Pro Phe Gly His Gly Pro Ser Leu Asp Phe Asp Leu Leu Pro Gly Ser195 200 205Ser Met Ala Val Gly Pro Asn Asn Asn Leu Gln Ser Gln Pro Asn Leu210 215 220Ala Ile Ser Asp Met Asp Lys Pro Ile Met Thr Gly Ile Ala Leu Thr225 230 235 240Ala Met Glu Glu Leu Leu Arg Leu Leu Gln Thr Asn Glu Pro Leu Trp245 250 255Thr Arg Thr Asp Gly Cys Arg Asp Ile Leu Asn Leu Gly Ser Tyr Glu260 265 270Asn Val Phe Pro Arg Ser Ser Asn Arg Gly Lys Asn Gln Asn Phe Arg275 280 285Val Glu Ala Ser Arg Ser Ser Gly Ile Val Phe Met Asn Ala Met Ala290 295 300Leu Val Asp Met Phe Met Asp Cys Val Lys Trp Thr Glu Leu Phe Pro305 310 315 320Ser Ile Ile Ala Ala Ser Lys Thr Leu Ala Val Ile Ser Ser Gly Met325 330 335
Gly Gly Thr His Glu Gly Ala Leu His Leu Leu Tyr Glu Glu Met Glu340 345 350Val Leu Ser Pro Leu Val Ala Thr Arg Glu Phe Cys Glu Leu Arg Tyr355 360 365Cys Gln Gln Thr Glu Gln Gly Ser Trp Ile Val Val Asn Val Ser Tyr370 375 380Asp Leu Pro Gln Phe Val Ser His Ser Gln Ser Tyr Arg Phe Pro Ser385 390 395 400Gly Cys Leu Ile Gln Asp Met Pro Asn Gly Tyr Ser Lys Val Thr Trp405 410 415Val Glu His Ile Glu Thr Glu Glu Lys Glu Leu Val His Glu Leu Tyr420 425 430Arg Glu Ile Ile His Arg Gly Ile Ala Phe Gly Ala Asp Arg Trp Val435 440 445Thr Thr Leu Gln Arg Met Cys Glu Arg Phe Ala Ser Leu Ser Val Pro450 455 460Ala Ser Ser Ser Arg Asp Leu Gly Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Gly465 470 475 480Lys Arg Ser Met Met Arg Leu Ala Gln Arg Met Ile Ser Asn Tyr Cys485 490 495Leu Ser Val Ser Arg Ser Asn Asn Thr Arg Ser Thr Val Val Ser Glu500 505 510Leu Asn Glu Val Gly Ile Arg Val Thr Ala His Lys Ser Pro Glu Pro515 520 525Asn Gly Thr Val Leu Cys Ala Ala Thr Thr Phe Trp Leu Pro Asn Ser530 535 540Pro Gln Asn Val Phe Asn Phe Leu Lys Asp Glu Arg Thr Arg Pro Gln545 550 555 560Trp Asp Val Leu Ser Asn Gly Asn Ala Val Gln Glu Val Ala His Ile565 570 575Ser Asn Gly Ser His Pro Gly Asn Cys Ile Ser Val Leu Arg Gly Ser580 585 590
Asn Ala Thr His Ser Asn Asn Met Leu Ile Leu Gln Glu Ser Ser Thr595 600 605Asp Ser Ser Gly Ala Phe Val Val Tyr Ser Pro Val Asp Leu Ala Ala610 615 620Leu Asn Ile Ala Met Ser Gly Glu Asp Pro Ser Tyr Ile Pro Leu Leu625 630 635 640Ser Ser Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Gly Asn Gly Ser Asn Ser Glu645 650 655Gln Gly Gly Ala Ser Thr Ser Ser Gly Arg Ala Ser Ala Ser Gly Ser660 665 670Leu Ile Thr Val Gly Phe Gln Ile Met Val Ser Asn Leu Pro Thr Ala675 680 685Lys Leu Asn Met Glu Ser Val Glu Thr Val Asn Asn Leu Ile Gly Thr690 695 700Thr Val His Gln Ile Lys Thr Ala Leu Ser Gly Pro Thr Ala Ser Thr705 710 715 720Thr Ala
權利要求
1.一種培育抗逆轉基因水稻的方法，是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入水稻中，篩選得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因的編碼序列是序列表中的序列1。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2004C導入水稻中。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表達載體pCB2004C的的attR1和attR2之間。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述植物表達載體中啟動外源基因轉錄的啟動子是水稻actin1啟動子。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因通過植物表達載體pCB2006導入水稻中。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述AtHD/START1基因插入植物表達載體pCB2006的的attR1和attR2之間。
9.根據權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述抗逆性為抗鹽性和/或抗旱性和/或抗氧化性。
10.根據權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述水稻為水稻中花11。
全文摘要
本發明公開了一種培育抗逆轉基因水稻的方法。該方法是將AtHD/START1基因通過植物表達載體導入水稻中，篩選得到抗逆性提高的水稻；所述AtHD/START1是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與(a)相同活性的由(a)衍生的蛋白質。轉AtHD/START1基因水稻株系(轉化體)的耐旱性明顯高于對照(未轉基因水稻)株系。
文檔編號C12N15/82GK1944646SQ20061011432
公開日2007年4月11日 申請日期2006年11月6日 優先權日2006年11月6日
發明者向成斌, 陳曦 申請人:中國科學技術大學