專利名稱：鹽藻的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類植物的培養(yǎng)方法，特別是涉及一種培養(yǎng)鹽藻的方法。
背景技術(shù)：
鹽藻是中國培養(yǎng)較早、培養(yǎng)方法比較成熟的藻種，具有生長速度快、有益代謝產(chǎn)物積累量大等特點。鹽藻在脅迫環(huán)境中(高溫、高鹽和/或強光)可積累大量的β-胡蘿卜素，最多高達藻細胞干重的14％，是自然界中β-胡蘿卜素含量最高的生物之一。研究表明，β-胡蘿卜素不僅是維生素A的前體和食品加工業(yè)的天然色素，還能防治癌癥、腫瘤和心血管疾病以及老年性癡呆和白內(nèi)障等與年齡有關(guān)的退化性疾病；以海水為培養(yǎng)基對鹽藻進行培養(yǎng)時，還可積累大量的蛋白質(zhì)，含量高達細胞干重的50-60％，其中包括人類必需氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，是一種優(yōu)良的蛋白飼料和人類食品加工原料；此外，鹽藻在脅迫環(huán)境中還可積累大量的甘油，含量高達干重的80％。天然甘油是優(yōu)質(zhì)的化妝品原料，同時也是化工、輕工和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料(楊雪梅，吳超員。鹽藻的研究與開發(fā)。生命科學，1994，6(5)7-10)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，鹽藻和β-胡蘿卜素還具有潛在的免疫調(diào)節(jié)(Zheng WF，Wang L，Shi F et al.Effectson cell immunity in mice by water extract of Dunaliella salina.中成藥，2004，261031-1036；Amar EC，Kiron V et al.Enhancement of innate immunity in rainbowtrout(Oncorhynchus mykiss Walbaum)associated with dietary intake ofcarotenoids from nutural products.Fish & Shellfish Immunology，2004，16527-537)、抗腫瘤(劉成玉，王春波，藍孝貞，段建華，仲維珍，譚潤鸞.鹽藻β-胡蘿卜素對惡性腫瘤病人紅細胞免疫粘附腫瘤細胞能力的影響.中國海洋藥物，2000，130-32)、抗動脈粥樣性硬化(王春波，藍孝貞，張魯平，張仁亮，周緒祥，王玉貞，趙麗麗，劉建國，張京浦.鹽藻β-胡蘿卜素對實驗性動脈粥樣性硬化預防作用的研究.中國海洋藥物，1998，17-12)以及預防脂肪肝(王春波，藍孝貞，張魯平，張仁亮，張敏，王玉貞，王海青，周緒祥，張京浦，鹽藻β-胡蘿卜素對鵪鶉脂肪肝的影響，海洋與湖沼，1999，30658-662)等多種藥理活性?；讦?胡蘿卜素所具有的潛在的藥用價值，使其具有了更高的商業(yè)價值。目前，鹽藻的大量培養(yǎng)已經(jīng)引起了研究人員的極大關(guān)注，尤其是關(guān)于β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方面。
目前，通常采用Medified Johnson’s培養(yǎng)基或富含無機營養(yǎng)元素的海水為培養(yǎng)基在光反應器或培養(yǎng)池中對鹽藻進行培養(yǎng)，同時向光反應器或培養(yǎng)池中鼓入空氣(García-González M.，Moren J， JP，Anguis V，Prieto A，Manzano C，F(xiàn)lorencio FJ，Guerrer MG.Conditions for open-air outdoor culture of Dunaliellasalina in southern Spain.J.App.Phycol.2003，15177-184)。為了提高鹽藻的生物量及β-胡蘿卜素的積累量，研究人員還探索了不同的培養(yǎng)方式，如向培養(yǎng)基中添加NaHCO3(Hejazi MA，Wijffels RH.Effect of light intensity on β-caroteneproduction and extraction by Dunaliella salina in two-phase bioreactors.Bimol．Eng.2003，20171-175)或向培養(yǎng)基中鼓入CO2(Wilson PDG，Hilton MG，Waspe CR，Steer DC，Wilson DR.Production of13C-labelled β-carotene from Dunaliellasalina.Biotechnol.Lett.1997，19401-405)以補充碳源的不足，或采用自動化方式向培養(yǎng)池中添加營養(yǎng)礦物質(zhì)(Suzenki T，Moci H.Automatic supplementationof minerals in fed-batch culture to high cell mass concentration.Biotechnol.Bioeng.1985，272-7)等方法促進鹽藻生長。另外，在鹽藻的培養(yǎng)過程中，影響鹽藻生長速率和生物量積累的因素可能還包括溶解氧量、碳源、礦物質(zhì)營養(yǎng)源、光強和溫度。像許多其它浮游植物一樣，鹽藻在生長過程中也會向周圍環(huán)境中釋放一些低分子的可溶性有機碳(Giordano M，Davis JS，Bowes G.Organic carbon release byDunaliella salina(Chlorophyta)under different growth conditions of CO2，nitrogen and salinity.J.Phycol.，1994，30249-257)和多糖等有機大分子物質(zhì)(Mykestad SM Release of extracellular products by phytoplankton with specialemphasis on polysaccharides. Sci. Total Enoviron.1995，165155-164)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，藻類分泌的胞外多糖量高，從而使培養(yǎng)液的粘度較大，不利于藻類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導致生長受到一定程度的抑制(蘇傳東.鹽度和營養(yǎng)限制對藍桿藻(Cyanothec.sp)113菌株生長和胞外多糖產(chǎn)量的影響，海洋湖沼通報，2005，469-73)。上述培養(yǎng)方法均不能解決鹽藻培養(yǎng)過程中多糖對藻細胞生長的抑制問題，因而鹽藻生物量和代謝產(chǎn)物(特別是β-胡蘿卜素)積累量的提高效果均不顯著。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可顯著提高鹽藻生長速率、生物量及β-胡蘿卜素積累量的培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設計方案一種培養(yǎng)鹽藻的方法，是將鹽藻在接種了芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
在上述培養(yǎng)方法中，所述鹽藻培養(yǎng)基的選擇是多種多樣的，如海水、ModifiedJohnson’s培養(yǎng)基、f/12或ASP2等，優(yōu)選為Modified Johnson’s培養(yǎng)基；所述鹽藻的常規(guī)培養(yǎng)條件可為培養(yǎng)溫度24-26℃，優(yōu)選為25℃，光照強度100-150μmoles·m-2·s-1，優(yōu)選為130μmoles·m-2·s-1，光照時間10-14h/天，優(yōu)選為12h/天。
為獲得較好的培養(yǎng)效果，所述培養(yǎng)方法優(yōu)選為振蕩培養(yǎng)，振速為100-150rpm，優(yōu)選為130rpm。
所述芽孢桿菌的選擇也是廣泛的，如短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、臘質(zhì)芽孢桿菌(Baillus cereus)、多粘性芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)或凝固芽孢桿菌(Bacillus coaglans)等芽孢桿菌中的一種或幾種。
所述芽孢桿菌的接種量為10-1000cfu/mL，優(yōu)選為100cfu/mL。
為進一步提高鹽藻體內(nèi)β-胡蘿卜素的積累量，可在對數(shù)生長期，對鹽藻進行高溫、高鹽和/或強光脅迫；所述高溫脅迫的溫度設為30-37℃，高鹽脅迫的NaCl濃度設為3-5M，強光脅迫的光照強度設為500-900μmoles·m-2·s-1。
用上述培養(yǎng)方法獲得的鹽藻以及從中提取的β-胡蘿卜素也是本發(fā)明要保護的。所述提取的β-胡蘿卜素可以制備成抑制腫瘤、抗輻射等藥物，還可作為食品色素，制成口服液、沖劑、口含片或水分散型干粉等多種劑型的天然胡蘿卜素。
本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)鹽藻的方法。該培養(yǎng)方法是向常規(guī)培養(yǎng)鹽藻的培養(yǎng)基中接種芽孢桿菌，芽孢桿菌可起到促進藻細胞生長和分裂的作用。實驗證明，接種芽孢桿菌后，鹽藻的生長速率、生物量及β-胡蘿卜素積累量均得到顯著提高，生長速率可達4.135×105/天，生物量可達846.88mg·L-1，β-胡蘿卜素積累量可達125.4mg·L-1。本發(fā)明具有成本低，收益大，無污染，操作簡單，易于進行規(guī)模化養(yǎng)殖的優(yōu)點，將對鹽藻和β-胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)的跨躍式發(fā)展起到重要的推動作用，應用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
圖1為接種不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生長影響的檢測結(jié)果圖2為接種不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生物量影響的檢測結(jié)果圖3為接種不同密度的芽孢桿菌對鹽藻β-胡蘿卜素含量影響的檢測結(jié)果圖4為接種不同密度的芽孢桿菌在脅迫條件下β-胡蘿卜素積累情況的檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、鹽藻的培養(yǎng)及接種不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生長速率的影響將鹽藻按1×105cfu/mL的密度接種于Modified Johnson’s培養(yǎng)基(pH 7.5)中，同時按接種量分別為0(對照)、10、100、1000cfu/mL向培養(yǎng)基中接種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，在24℃，光照強度150μmoles·m-2·s-1，光照時間10h/天的條件下對鹽藻進行培養(yǎng)，以檢測不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生長速率的影響。培養(yǎng)到對數(shù)生長末期時，隔天在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，用公式K＝(N-N0)/T(N為經(jīng)過T時間培養(yǎng)后單位體積的藻細胞數(shù)，N0為T時間培養(yǎng)初始單位體積藻細胞數(shù)，T為培養(yǎng)時間(天))計算鹽藻的日平均生長速率(K)。接種不同密度芽孢桿菌后培養(yǎng)基中鹽藻的細胞密度統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示，經(jīng)計算，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)接入量為100cfu/mL時鹽藻的生長速率為最大，K100cells ml-1＝4.135×105，而短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)接入量為0時，鹽藻的生長速率為最小，K0cells ml-1＝2.985×105，即接入短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)后，鹽藻的最大日平均生長速率是最小日平均生長速率的1.385倍，表明用本發(fā)明的方法對鹽藻進行培養(yǎng)，可使鹽藻的生長速率得到大幅提高。
實施例2、鹽藻的培養(yǎng)及接種不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生物量的影響將鹽藻按1×105cfu/mL的密度接種于Modified Johnson’s培養(yǎng)基(pH 7.5)中，同時按接種量分別為0(對照)、10、100、1000cfu/mL向培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在26℃，光照強度100μmoles·m-2·s-1，光照時間14h/天，100rpm的條件下對鹽藻進行振蕩培養(yǎng)，以檢測不同密度的芽孢桿菌對鹽藻生物量的影響。培養(yǎng)到對數(shù)生長末期時，取接種不同密度芽孢桿菌的藻液各400mL，4800rpm離心10min，棄上清，藻體去鹽后，冷凍，真空干燥，稱重，得出鹽藻的生物量。生物量統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示，芽孢桿菌接入量為100cfu/mL時，鹽藻的生物量為最多，達846.88mg·L-1，而芽孢桿菌接入量為0cfu/mL時，鹽藻的生物量最少，僅達574.5mg·L-1，鹽藻生物量積累量的多少順序依次為S100cfu ml-1＞S1000cfu m1-1＞S10cfu ml-1＞S0cfu ml-1(S代表生物量)。上述統(tǒng)計結(jié)果表明在鹽藻的培養(yǎng)過程中，接入一定量的芽孢桿菌可顯著提高鹽藻的生物量，但是，若接入過量的芽孢桿菌則鹽藻的生物量會稍有下降，但是與對照比仍有大幅提高，證明用本發(fā)明的方法對鹽藻進行培養(yǎng)，可使鹽藻的生物量積累得到大幅提高。
實施例3、鹽藻的培養(yǎng)及接入不同密度的芽孢桿菌對鹽藻β-胡蘿卜素積累量的影響將鹽藻按1×105cfu/mL的密度接種于Modified Johnson’s培養(yǎng)基(pH 7.5)中，同時按接種量分別為0(對照)、10、100、1000cfu/mL向培養(yǎng)基中接種凝固芽孢桿菌(Bacillus Coagulans)，在25℃，光照強度130μmoles·m-2·s-1，光照時間12h/天，130rpm的條件下對鹽藻進行振蕩培養(yǎng)，以檢測接入不同密度的芽孢桿菌對鹽藻β-胡蘿卜素積累量的影響。培養(yǎng)過程中每隔3天測定鹽藻的β-胡蘿卜素積累量，方法為首先，根據(jù)文獻(劉建國，吳超元。鹽藻和β-胡蘿卜素研究述評[J]。海洋與湖沼，1995，26(3)323-330)中的方法提取β-胡蘿卜素，然后用722S分光光度計(購自上海分析儀器廠)測450nm的光吸收值，并按下式(式中D稀釋倍數(shù)；2500為1％β-胡蘿卜素純品的百分吸收系數(shù))計算β-胡蘿卜素含量β-胡蘿卜素(mg/L)＝OD450×D×10000/2500結(jié)果如圖3所示，芽孢桿菌接入量為100cfu/mL時，鹽藻的β-胡蘿卜素積累量為最高，達125.4mg·L-1，而芽孢桿菌接入量為0cfu/mL時，鹽藻的β-胡蘿卜素積累量最低，僅為51.58mg·L-1，鹽藻β-胡蘿卜素積累量的多少順序依次為W100cfu ml-1＞W(wǎng)1000cfu ml-1＞W(wǎng)10cfu ml-1＞W(wǎng)0cfu ml-1(W代表β-胡蘿卜素積累量)；培養(yǎng)到對數(shù)生長末期時，向培養(yǎng)基中添加濃度為4.5M的NaCl進行鹽脅迫，同時將光照強度設為600μmoles·m-2·s-1進行強光脅迫，約10-15天后直至藻體呈現(xiàn)橙色，然后用相同方法測定β-胡蘿卜素的累積量，結(jié)果如圖4所示(**表示極顯著，P＜0.001)，經(jīng)計算，芽孢桿菌接入量為100cfu/mL時，鹽藻的β-胡蘿卜素積累量最高，達125.4mg·L-1，其次是芽孢桿菌接入量為1000cfu/mL時，鹽藻的積累量可達97mg·L-1；芽孢桿菌接入量為10cfu/mL時，鹽藻的β-胡蘿卜素積累量達到了85.08mg·L-1；芽孢桿菌接入量為0cfu/mL時，鹽藻的β-胡蘿卜素積累量最低，僅為51.58mg·L-1。上述統(tǒng)計結(jié)果表明在鹽藻的培養(yǎng)過程中，接入一定量的芽孢桿菌可顯著提高鹽藻的β-胡蘿卜素積累量，但是，若接入過量的芽孢桿菌則鹽藻的β-胡蘿卜素積累量會稍有下降，但是與對照比仍有大幅提高，證明用本發(fā)明的方法對鹽藻進行培養(yǎng)，可使鹽藻的β-胡蘿卜素積累量得到大幅提高。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)鹽藻的方法，是將鹽藻在接種了芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述鹽藻培養(yǎng)基為海水、ModifiedJohnson’s培養(yǎng)基、f/12或ASP2培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述鹽藻的常規(guī)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度24-26℃，光照強度100-150μmoles·m-2·s-1，光照時間10-14h/天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為130μmoles·m-2·s-1，光照時間為12h/天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)方法為振蕩培養(yǎng)，振速為100-150rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1任一項所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌選自短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、臘質(zhì)芽孢桿菌(Baillus cereus)、多粘性芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)或凝固芽孢桿菌(Bacilluscoaglans)中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌的接種量為10-1000cfu/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括在對數(shù)生長期，對鹽藻進行高溫、高鹽和/或強光脅迫；所述高溫脅迫的溫度設為30-37℃，高鹽脅迫的NaCl濃度設為3-5M，強光脅迫的光照強度設為500-900μmoles·m-2·s-1。
9.用權(quán)利要求1-8任一項所述方法獲得的鹽藻。
10.一種利用鹽藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，是將鹽藻在接種了芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)后，自獲得的鹽藻中分離β-胡蘿卜素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)鹽藻的方法。該方法是將鹽藻在接種了芽孢桿菌的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。實驗證明，接種芽孢桿菌后，鹽藻的生長速率、生物量及β－胡蘿卜素積累量均得到顯著提高，生長速率可達4.135×10
文檔編號C12P23/00GK1923994SQ200610113359
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者鄭維發(fā), 杜彩華, 陳才法, 儲成才 申請人:江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室