專利名稱：酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以酪酸菌、嗜酸乳桿菌兩種菌種為原料，采用一次性發酵獲得多株益生菌的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝。
背景技術：
酪酸菌又稱丁酸菌或酪酸梭狀芽孢桿菌，1933年由日本千葉醫科大學宮入近治首先發現并報告，因此又名宮入菌。該菌廣泛存在于土壤、動物和人類的腸道中，細菌學分類屬梭菌屬，為革蘭氏陽性厭氧桿菌。由于酪酸菌為人體正常菌株之一。在腸道內能抑制有害菌和腐敗群生長繁殖，近半世紀以來，酪酸菌制劑在日本、韓國、臺灣等亞洲地區廣泛應用于消化、小兒、外科、腫瘤、婦產科等各種原因引起的腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、抗生素相關性腸炎、慢性肝炎和輔助治療幽門螺旋桿菌引起的消化性潰瘍及偽膜性腸炎等。我國從九十年代初引入酪酸菌制劑后，在北京、上海、重慶、哈爾濱等大城市醫院臨床應用，也取得了很好的效果。嗜酸乳桿菌(乳酸菌)是屬革蘭氏陽性球菌，專性厭氧，上世紀末被發現，對人體具有調整胃腸、幫助消化、提高免疫、降低血脂、減少腸內腐敗菌產生胺、吲哚等有害物質，產生多種生理功能，市場上許多酸奶中便含有嗜酸乳桿菌。
文獻報道，酪酸菌與嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌益生菌在腸道有增殖共生作用，而這種增殖共生的結果是對侵入人體的有害菌形成海陸空集團軍作戰的效應，使益生菌對人體有益的生理作用大大提高。臨床上常見的酪酸菌制劑都先以單菌株發酵生產，經過離心干燥，收集菌粉等步驟，在做成復方制劑時，才將單一菌粉混合，制成多菌株制劑(膠囊、片劑等)，如國內生產的“常樂康”等。既然酪酸菌與嗜酸乳桿菌等其他益生菌有增殖效果的協同作用，那我們為什么不能在工業化生產中選擇合適的微生物培養基來聯合發酵生產呢？傳統上的微生物發酵方法，一般都是采純種培養法，以期獲得較高的發酵單位而分離到較多細菌的代謝產物。如世界各地抗生素的生產，幾乎無一例外。實驗表明酪酸菌與嗜酸乳桿菌具有共生作用，可以通過聯合發酵獲得更高的發酵單位和產量，此外，酪酸菌與嗜酸乳桿菌在發酵過程中(一般24～36小時)無論在時間或空間上已經過了充分的“磨合、協調”，若直接拿菌粉作成一種制劑(如膠囊劑或片劑)兩者可以不經過“磨合期”(事實上任何多種微生物在一起都存在營養、空間、時間的競爭，最終達到平衡)，而直接發揮協同作用，對疾病起到更快更好的治療效果。
原工藝條件為酪酸菌和乳酸菌(嗜酸乳桿菌)種分別進行搖瓶培養，增菌培養、種子罐培養后加入不同的培養基分別進行大罐發酵24-36小時，溫度控制在36℃和37℃，初始PH7.0，結束PH分別為4.5和3.5，分別離心，收集菌泥，酪酸菌60℃以下通風干燥，乳酸菌40℃以下通風干燥，檢驗合格后，成品分別包裝入庫。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足而提供一種將傳統上酪酸菌和嗜酸乳桿菌單一純菌種培養，實現為聯合發酵培養，以達到簡化生產工藝，降低生產成本，提高發酵活菌總數，增強臨床使用效果，進一步擴大使用用途的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，本發明的多株聯合發酵工藝，是一次性發酵獲得多株益生菌，降低了生產成本，避免了生產中多次混合的麻煩，減少了雜菌污染環節。
本發明的目的是這樣實現的本發明的具體工藝如下第一步，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液，第二步，制作聯合培養基，聯合培養基為在每100克蒸餾水中含葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、硫酸銨0.1％、磷酸氫二鉀0.4％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸鎂0.05％、硫酸錳0.02％、碳酸氫鈉0.1％，鈣酸鈣0.1％，Tween.80 0.02％，121℃流通蒸汽滅菌30分鐘，涼至室溫，第三步，將步驟1的混合菌液加入到步驟2的聯合培養基中，用10％稀鹽酸或5％氨水調控初始PH值在7.0～7.4之間，攪拌5分鐘，在37℃密閉厭氧發酵36小時，第四步，按發酵液總體積的5％加入藥用碳酸鈣，攪拌，離心，收集菌泥，在40℃以下通風干燥，成為成品。
在步驟1和2中，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液具體為將菌液濃度均為1.0×108CFU/ml的酪酸菌和嗜酸乳桿菌按1∶1的體積比，分別搖床培養、增菌培養、種子罐培養，合并后成為混合菌液，混合菌液與聯合培養基按1∶50的體積比配置。
在步驟3中，在37℃密閉厭氧發酵36小時后，取樣檢測活菌總數，保證在1.0×109～5.0×109CFU/ml，觀察菌體生長情況，以菌體粗壯、生長良好為標準，用25型酸度計檢測PH值，保證在4.0～3.5之間。
在步驟4中，菌泥在40℃以下通風干燥，水分控制在5％，粉碎過100目鋼篩，檢測合格后，成品一次性包裝入庫。
本發明具有如下積極效果1、節省了時間，降低了成本。原工藝大罐生產為兩次分別發酵，現合并為一次發酵，時間縮短了24小時，能耗降低50％；2、提高了發酵指數5倍，原工藝大罐發酵嗜酸乳桿菌一般為1.0×108CFU/ml，酪酸菌一般為1.0×109CFU/ml，提高了5倍。這與文獻報道的其“互生”作用一致。
3、縮短了兩株益生菌到達人體后的“磨合期”，更好地發揮協同醫療作用。酪酸菌和嗜酸乳桿菌通過聯合發酵，互生共生，當作為同一制劑口服，到達人體胃腸道后，避免了象其他菌種之間的競爭，排斥作用，二者可以發揮更好地協同醫療作用。
本發明通過酪酸菌與嗜酸乳桿菌的兩株聯合發酵工藝，提高了發酵單位，增加了產量，增強了臨床效果，降低了生產成本，使該產品在市場上更具競爭力，使物美價廉的復合酪酸菌擴大使用范圍提供了可能。
本發明工藝與傳統工藝經中試(150L)發酵檢測如下
注S菌表示嗜酸乳桿菌.L菌表示酪酸菌本發明動物藥效學實驗報告成份酪酸菌+乳桿菌(每g樣活菌≥50億CFU)實驗目的本發明對仔豬腹瀉效果實驗地點河南杞縣圈鎮萬頭豬場實驗時間2006、6、1~2006、7、15實驗方法選擇20~50日齡腹瀉(下痢)仔豬28頭，隨機分為AB組，每組各14頭。A組為本發明治療組，B組為氟哌酸對照組。
A組仔豬按每天每Kg體重0.5g口服給藥(罐服)，經過3天觀察有13頭仔豬已不拉稀，糞便成型，另一頭仍為溏稀便，又經兩天給藥后，全部痊愈。
B組仔豬每天每Kg喂氟哌酸5mg，連灌3天，發現有10頭停止拉稀，另4頭又連服兩天，仍有3頭未見好轉，且有一頭死亡。
小結本發明治療組三天治療有效率為92.85％，5天治療有效率和治愈率均為100％，而化學抗菌藥物氟哌酸治療對照組3天有效率為71.43％，5天治療有效率和治愈率分別為92.85％和78.57％，且有一頭死亡，死亡率為7.14％。從AB兩組實驗數據可以看出，P≤0.5％，差異性及其顯著。
此外，從治愈后三個月的增重情況來看，A仔豬比B組仔豬平均增重提高8~11％左右。這可能是抗生素在治療過程中對小動物免疫系統抑制有關，而本發明微生態制劑則無此現象。
圖1為本發明的工藝流程圖。
具體實施例方式
實施例如圖1所示，本發明的具體工藝如下第一步，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液具體為將菌液濃度均為1.0×108CFU/ml的酪酸菌和嗜酸乳桿菌按1∶1的體積比，分別搖床培養、增菌培養、種子罐培養，合并后成為混合菌液。
第二步，選擇對雙方都適宜的聯合培養基，制作聯合培養基具體為在每100克蒸餾水中含葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、硫酸銨0.1％、磷酸氫二鉀0.4％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸鎂0.05％、硫酸錳0.02％、碳酸氫鈉0.1％，鈣酸鈣0.1％，Tween.80 0.02％，121℃流通蒸汽滅菌30分鐘，涼至室溫。
第三步，將步驟1的混合菌液按1∶50的體積比加入到步驟2的聯合培養基中，聯合培養基放置在大發酵罐中，用10％稀鹽酸或5％氨水調控初始PH值在7.0～7.4之間，攪拌5分鐘，在37℃密閉厭氧發酵36小時，在37℃密閉厭氧發酵36小時后，取樣檢測活菌總數，保證在1.0×109～5.0×109CFU/ml，觀察菌體生長情況，以菌體粗壯、生長良好為標準，用25型酸度計檢測PH值，保證在4.0～3.5之間。
第四步，開啟攪拌泵，按發酵液總體積的5％加入藥用碳酸鈣(吸收劑)，攪拌，經高速離心機離心，收集菌泥，在40℃以下通風干燥，水分控制在5％，粉碎過100目鋼篩，檢測合格后，成品一次性包裝入庫。
權利要求
1.一種酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，其特征在于第一步，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液，第二步，制作聯合培養基具體為在每100克蒸餾水中含葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、硫酸銨0.1％、磷酸氫二鉀0.4％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸鎂0.05％、硫酸錳0.02％、碳酸氫鈉0.1％，鈣酸鈣0.1％，Tween.80 0.02％，121℃流通蒸汽滅菌30分鐘，涼至室溫，第三步，將步驟1的混合菌液加入到步驟2的聯合培養基中，用10％稀鹽酸或5％氨水調控初始PH值在7.0～7.4之間，攪拌5分鐘，在37℃密閉厭氧發酵36小時，第四步，按發酵液總體積的5％加入藥用碳酸鈣，攪拌，離心，收集菌泥，在40℃以下通風干燥，成為成品。
2.根據權利要求1所述的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，其特征在于在步驟1和2中，制作含酪酸菌和嗜酸乳桿菌的混合菌液具體為將菌液濃度均為1.0×108CFU/ml的酪酸菌和嗜酸乳桿菌按1∶1的體積比，分別搖床培養、增菌培養、種子罐培養，合并后成為混合菌液，混合菌液與聯合培養基按1∶50的體積比配置。
3.根據權利要求1所述的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，其特征在于在步驟3中，在37℃密閉厭氧發酵36小時后，取樣檢測活菌總數，保證在1.0×109～5.0×109CFU/ml，觀察菌體生長情況，以菌體粗壯、生長良好為標準，用25型酸度計檢測PH值，保證在4.0～3.5之間。
4.根據權利要求1所述的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，其特征在于在步驟4中，菌泥在40℃以下通風干燥，水分控制在5％，粉碎過100目鋼篩，檢測合格后，成品一次性包裝入庫。
全文摘要
本發明涉及一種采用一次性發酵獲得多株益生菌的酪酸菌加嗜酸乳桿菌聯合發酵工藝，酪酸菌和嗜酸乳桿菌開始分別搖床培養、增菌培養、種子罐培養合并，選擇對雙方都適宜的培養基，控制初始pH值，37℃經過36小時聯合厭氧發酵，加入碳酸鈣，離心，收集菌泥，40℃通風干燥，檢測合格后，成品一次性包裝入庫，節省了時間，降低了成本，提高了發酵指數，縮短了兩株益生菌到達人體后的“磨合期”，酪酸菌和嗜酸乳桿菌通過聯合發酵，互生共生，到達人體胃腸道后，避免了象其他菌種之間的競爭，排斥作用，二者可以發揮更好地協同醫療作用。
文檔編號C12N1/20GK1928073SQ20061010722
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月29日 優先權日2006年9月29日
發明者杜靈廣 申請人:杜靈廣