一種人乳頭瘤病毒疫苗及其制備方法

專利名稱：一種人乳頭瘤病毒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒疫苗及其制備方法，在本發(fā)明中涉及到人乳 頭瘤病毒的免疫原的建立，對人乳頭瘤病毒特定基因的改造，以及人乳頭瘤病 毒假病毒的制備等方面。
技術(shù)背景人乳頭瘤病毒(//咖<377 pspi7J0ffi3Kii7^， HPV)，能夠引起人類皮膚或粘膜 形成多種良性疣甚至誘發(fā)產(chǎn)生惡性腫瘤，尤其是某些類型的HPV病毒，例如,16、 HPV18可以引起人宮頸癌(human cervical carcinoma),這種惡性腫瘤 的死亡率排在婦女惡性腫瘤的第二位。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，HPV感染與其他的很 多器官的腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系。因此，針對HPV的疫苗研究無論在理論上和臨 床上都具有很重要的意義！ 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒疫苗的制備方法。具體講本發(fā)明提供一種新 的人乳頭瘤病毒的免疫原；同時提供對人乳頭瘤病毒特定基因的改造，以使經(jīng) 改造后的病毒蛋白不再具有致瘤性；并采用經(jīng)改造的病毒蛋白包裹重組質(zhì)粒構(gòu) 成假病毒。本發(fā)明是用HPVE7基因與IgG融合并作為免疫原。其做法是將HPVE7病 毒基因與動物或人IgG及IgG重鏈、Fc段等的融合。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中是以HPV16 主要的具有轉(zhuǎn)化活性的早期表達(dá)蛋白E7上的一個多肽片段(aa38-61)作為一 部分，用小鼠IgG2a的重鏈不變區(qū)(heavy chain constant region, HCCR)作為 另一部分構(gòu)建成融合蛋白，在AcWi中表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白以包涵體的形式 存在，經(jīng)過親和純化后進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。采用雌性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合蛋白免疫不僅能夠引起小鼠明顯的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且 對特定腫瘤細(xì)胞(TC-1)的入侵也能起到保護(hù)的作用，在一些實(shí)驗(yàn)中甚至可以使 腫瘤消退。在前 -工作的基礎(chǔ)上發(fā)明人以均具有致癌活性的E6、 E 蛋白為對象，采用 將E6嵌合E7基因，使人乳頭瘤病毒的E6基因和E7基因進(jìn)行重組，構(gòu)建入真
核表達(dá)載體pcDNA3. l + ，得到了能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)的核酸疫苗。通過軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)重組的DNA具有轉(zhuǎn)化活性，也就是說這一改造使E6、 E7 蛋白喪失致瘤性。用這種核酸疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動物發(fā)現(xiàn)，它能夠有效地引起細(xì)胞 免疫反應(yīng)。在保護(hù)及清除腫瘤細(xì)胞入侵的實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的核酸疫苗也顯示了 良好的效果。在前面兩項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)明人又進(jìn)一步設(shè)計(jì)了 "假病毒"疫苗。這種 "假病毒"疫苗由病毒樣顆粒外殼(virus-like particles, VLPs)和包裹在里 面的核酸疫苗組成，在結(jié)構(gòu)上和天然病毒類似，能夠模擬病毒的整個侵染過程。 但由于"假病毒"內(nèi)包裹的是真核表達(dá)載體而不是病毒的基因組，所以不會引 起病理反應(yīng)。從已經(jīng)得到的結(jié)果來看，"假病毒"可以引發(fā)體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明中由于將病毒蛋白編碼基因與IgG進(jìn)行融合，以提高病毒抗原的免 疫原性。又因?yàn)橥ㄟ^基因的重組，使所得的重組蛋白既不具有致癌活性，同時 又能有效的引起細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在現(xiàn)有技術(shù)中已有的HPV假病毒的構(gòu)建多是采用將表達(dá)的病毒蛋白組成 空殼病毒顆粒(VLP)，即僅由部分病毒蛋白構(gòu)成的類似病毒樣的顆粒。由于 這類的假病毒不含有任何基因成分，因此其免疫效果較差。而在本發(fā)明中通過 采用病毒蛋白包裹重組質(zhì)粒構(gòu)成假病毒(即VLP中含有病毒基因的重組質(zhì)粒)， 這一做法不僅尚未在HPV研究領(lǐng)域見到，也未見其他病毒研究有向類似報(bào)告。 而且本發(fā)明所形成的假病毒具有更好的免疫特性，在有關(guān)疾病的診治中將會起 到積極的作用。從另一個角度而言，本發(fā)明提出的以病毒蛋白包裹重組質(zhì)粒(重 組質(zhì)粒含有病毒抗原基因)構(gòu)成假病毒的方法，不僅適用于人乳頭瘤病毒的診 斷與治療，而且也為其它的類似的疾病，如乙型肝炎、艾滋病的診斷與治療提 供了新的手段。


圖1為三個PCR擴(kuò)增DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中泳道1為E6-C末端基因PCR片段； 泳道2為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；泳道3為E6-N末端基因PCR片段；泳道4為E738—57肽基因PCR片段。 圖2為真核表達(dá)重組質(zhì)粒HPV16E6E7-Pcdna3.1構(gòu)建模式圖。圖3為E6E7-pcDNA3. 1重組質(zhì) 粒的鑒定瓊脂糖電泳圖，其中泳道1為E6E7-pcDNA3. 1;泳道2為&冊〃 T and J力o I酶切 E6E7-pcDNA3. 1重組質(zhì)粒；泳道3為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)。圖4為E6E7-pcDNA3. 1重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
圖5為E6E7-pcDNA3.1重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting檢測圖，圖5中用Western-blotting檢測E6E7-pcDNA3.1重組質(zhì)粒在COS7細(xì)胞及小鼠肌肉中的表達(dá)產(chǎn)物，其中1為小鼠肌肉注射50ugDNA疫苗；2為小鼠肌肉注射100ugDNA疫苗；3為小鼠肌肉注射200ugDNA疫苗；4為50ugDNA疫苗轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞； 一抗為抗HPV16E6 C水端單克隆抗體，抗為羊抗鼠IgG-AP。圖6為重組質(zhì)粒E6E7-pBabe-puro結(jié)構(gòu)圖。圖7為軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖7中Balb/c 3T3細(xì)胞表達(dá)E6D7及野生型E6的集落形成實(shí)驗(yàn)，依據(jù)在軟瓊脂中的定居生長對重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的Balb/c 3T3細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測；接種4周后，計(jì)數(shù)軟瓊脂平板的集落，所有集落均在9cm2內(nèi)，以表達(dá)E6的Balb/c 3T3細(xì)胞形成的集落為100%作為標(biāo)準(zhǔn)。圖8為不詞劑量DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠后產(chǎn)生E6E7特異性抗體反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖8是不同劑量DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠初免和加強(qiáng)免疫后產(chǎn)生E6E7特異性抗體反應(yīng)；通過ELISA檢測不同稀釋度小鼠血清對E6E7重組蛋白的反應(yīng)性。圖9為不同劑量DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠E6E7特異性CTL反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖9表現(xiàn)了不同劑量DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠E6E7特異性CTL反應(yīng)，其中50嗎DNA疫苗免疫兩次(0周和3周)的小鼠脾細(xì)胞(秦)，100嗎DNA疫苗免疫兩次(0周和3周)的小鼠脾細(xì)胞(口)， 200昭DNA疫苗免疫兩次(0周和3周)的小鼠脾細(xì)胞(B)， pcDNA3.1+質(zhì)粒陰性對照(0)，以TC-1細(xì)胞(A)或B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，通過LDH檢測CTL裂解細(xì)胞活性。圖10是E6E7-pcDNA3.1重組質(zhì)粒免疫后對TC-1腫瘤的預(yù)防結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖10為E6E7-pcDNA3.1重組質(zhì)粒免疫后對TC-1腫瘤的預(yù)防作用；小鼠免疫2劑間隔2周，每劑分別為pcDNA3.1十(陰性對照)，50)igDNA疫苗，100嗎DNA疫苗，200嗎DNA疫苗。在免疫后1周用50 000 TC-1細(xì)胞攻擊。每周測量形成的腫瘤體積，直至對照小鼠死亡。圖11為不同劑量E6E7-pcDNA3. 1+重組質(zhì)粒免疫接踵后小鼠生存期統(tǒng)計(jì)圖，圖11中高劑量E6E7-pcDNA3. 1+重組質(zhì)粒免疫接踵導(dǎo)致小鼠生存期延長，由圖可見與其他組對比，200u g E6E7- pcDNA3. 1+免疫小鼠的存活期明顯增加。圖12不同劑量E6E7-pcDNA3. 1+重組質(zhì)粒接踵后對TC-1腫瘤攻擊小鼠存活期影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，醒l 12的E6E7-pcDNA3. l十重組質(zhì)粒高劑量組接踵后延長TC-1腫瘤攻擊小鼠存活期可見，60%由20()yg E6E7-pc:DNA3. 1+免疫的小鼠和20%由100ug E6E7-pcDNA3. 1+免疫的小鼠在試驗(yàn)結(jié)束時存活。而其他2組小鼠全部死亡。圖13為E6E7-pcDNA3. 1+重組質(zhì)粒免疫接踵對腫瘤體積影響的測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖13中經(jīng)腫瘤攻擊后7天，單劑量免疫和加強(qiáng)免疫接踵對腫瘤體積影響的測定結(jié)果，接種劑量為每劑pcDNA3.1+(對照)，50嗎DNA疫苗，IOO嗎DNA疫苗，200嗎DNA疫苗，兩周后以同劑量加強(qiáng)，每周測量腫瘤體積，直至對照組小鼠全部死亡。圖14為HPV16 L1-pBacPAK8結(jié)構(gòu)圖。圖15為HPV16Ll-pBacPAK8重組質(zhì)粒的鑒定瓊脂糖電泳圖，其中1為J/ 。 I and勘1雙酶切HPV16L1-pBacPAK8; 2為HPV16L1-pBacPAK8; 3為DNA分
f標(biāo)準(zhǔn)。圖16為在sf9細(xì)胞中表達(dá)HPV16 Ll蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖，圖中泳道1 一5，重組桿狀病毒感染細(xì)胞后不同時間收集的細(xì)胞裂解物，分別為6、 5、 4、 3、 2天；泳道 6，空桿狀病毒感染的細(xì)胞裂解物；泳道7，蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)。圖17為HPV16 Ll表達(dá)蛋白的 Western-blotting分析結(jié)果圖，圖中1為空桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞裂解物；2為重組桿 狀病毒感染sf9細(xì)胞裂解物。圖18為VLPs CsCl密度梯度離心純化結(jié)果，圖18中Sf9細(xì)胞 核位于30%CsCl層，采用Beckman SW 32轉(zhuǎn)頭離心18h， 28000rpm，離心后觀察到白色區(qū)帶 位于1.28 g/ml CsCl密度。圖19為純化的HPV16病毒樣顆粒和假病毒電鏡照片其中(A) HPV16病毒樣顆粒；(B) EDTA和DTT處理VLP后獲得HPV殼膜；(C)在Ca2+和DNA存在的條 件卜-,殼膜重新組裝形成的假病毒。圖20為重組裝的VLPs的CsC].密度梯度離心結(jié)果，圖 20中出現(xiàn)2個峰，高峰為VLPs，低峰為假病毒，假病毒的沉降系數(shù)更高。 圖21為包裝進(jìn)假病毒的質(zhì)粒DNA對苯的穩(wěn)定性電泳分析圖，其中(1)質(zhì)粒DNA初始加入 衣殼蛋白；(2)苯處理前的裸DNA質(zhì)粒；(3)苯處理前在VLP中的E6E7-pcDNA3. l + ; (4)苯 處理前后VLP中的E6E7-pcDNA3. l+; (5)苯處理后的裸DNA質(zhì)粒；(6) lkb DNA分子標(biāo)準(zhǔn)。 圖22為假病毒免疫小鼠對HPV16 Ll的特異性免疫球蛋白G反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖22是假病 毒免疫小鼠對HPV16 Ll的特異性免疫球蛋白G反應(yīng)，通過ELISA檢測不同稀釋度小鼠血清對 VLPs的反應(yīng)性。圖23為假病毒免疫小鼠對HPV16 Ll的特異性免疫球蛋白A反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖， 圖23是假病毒免疫小鼠對HPV16 Ll的特異性免疫球蛋白A反應(yīng)，通過ELISA檢測不同稀釋 度小鼠血清對VLPs的反應(yīng)性。圖24為假病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的E7特異性CTL反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖 可見在VLPs免疫小鼠中未觀察到CTL反應(yīng)。
具體實(shí)施方式
以下提供本發(fā)明具體的實(shí)驗(yàn)及相關(guān)的檢測結(jié)果 1.材料與方法 1.1.實(shí)驗(yàn)材料 1丄1.菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞系菌種:￡c?！絠 DH5a，fcoh' BL21 (DE3)-coden plus均由本實(shí)驗(yàn)室保存 質(zhì)粒pET21a Novagen公司產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)室保存 pcDNA3.1十Invitrogen公司產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)室保存 pBacPAK8本實(shí)驗(yàn)室保存pBabe-puro Dr. M. Tommasino (International Agency for Reasearch on
Cancer， Lyon, France)惠贈，本實(shí)驗(yàn)室保存 pBluescript SK-本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞系TC-1細(xì)胞系美國John Hopkins University T.C,Wu教授 惠贈，利用HPV16的E6和E7基因轉(zhuǎn)化的C57BL/6小鼠上皮細(xì)胞系 B16C57BL/6小鼠黑色素瘤細(xì)胞系， Balb/c 3T3鼠胚成纖維細(xì)胞系 COS7猴腎成纖維細(xì)胞系 Sf9地衣蛾昆蟲細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保存 實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6小鼠，雌性，8-10周齡購于(北京試驗(yàn)動物中心)1丄2.主要實(shí)驗(yàn)試劑ALLN: Sigma公司(美國)產(chǎn)品Benzonase: Sigma公司(美國)產(chǎn)品IPTG: Promega公司(美國)產(chǎn)品 FBS: Hyclone公司(美國)產(chǎn)品單克隆抗體anti-HPV16 E7、 anti-HPV16 E6、 anti-HPV16 LI Labvision公司(美國)產(chǎn)品堿性磷酸酶(AP)-羊抗小鼠IgG:華美公司產(chǎn)品 辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗小鼠IgG:華美公司產(chǎn)品 RPMI1640培養(yǎng)基Gibco公司(美國)產(chǎn)品 DMEM培養(yǎng)基Gibco公司(美國)產(chǎn)品 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基T麗-FH: Gibco公司(美國)產(chǎn)品 硝酸纖維素膜(0. 45um): Millipore公司(美國)產(chǎn)品 Western-blotting堿性磷酸酶NBT/BCIP染色試劑盒華美公司產(chǎn)DNA膠回收試劑盒上海生物工程公司產(chǎn)品BacPAK6 DNA Kit: BD公司(美國)產(chǎn)品His bind Resin & Buffer Kit: Novagen公司(美國)pi 口 f 口口Cytotoxicity Detection Kit (LDH): Roche公司(德國)產(chǎn)品所有的實(shí)驗(yàn)用限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶均 購自Takara公司寡核苷酸引物的合成、多肽的合成及DNA測序均由 上海博雅公司完成1.2.實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 DNA操作實(shí)驗(yàn)方法1.2. 1. 1培養(yǎng)基配制LB液體培養(yǎng)基:1% Tryptone， 0. 5% Yeast Extract, 1% NaCl。含 Amp'的LB培養(yǎng)基中Amp的終濃度為lOOu g/ml。 LB固體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基中加入1.5y。的瓊脂，加熱融化ZB液體培養(yǎng)基1% NZ BROTH, 0. 5% NaCl。含有Amp+和Chr的ZB 培養(yǎng)基中Amp的終濃度是100" g/ml， Chi的終濃度是38 u g/ml ZB固體培養(yǎng)基ZB液體培養(yǎng)基中加入1.5。/。的瓊脂，加熱融化 1.2. 1.2質(zhì)粒DNA的提取采用堿法小提和大提質(zhì)粒，詳細(xì)步驟參照《分子克隆》1.2.1.3 DNA限制性內(nèi)切酶反應(yīng)根據(jù)質(zhì)粒構(gòu)建的需要選擇適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切緩沖液和 酶切條件的選擇可參考內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家的說明。若進(jìn)行雙酶切，盡量使 用同一種酶切緩沖液。如果找不到合適的緩沖液，則采用分次酶切的方 法。 一般先選用離子濃度低的酶切緩沖液進(jìn)行第一個酶切反應(yīng)，待酶切 結(jié)束后，補(bǔ)加一定的成分，再進(jìn)行第二次酶切；或者在第一次酶切后， 回收所需要的片段，再進(jìn)行第二次酶切反應(yīng)。1.2. 1.4 PCR反應(yīng)的條件PCR反應(yīng)一般采用50^x1的反應(yīng)體系5"1 10X PCR緩沖液，終
濃度為0.2 mM的四種dNTP， 25 pmol的PCR引物和適量的模板，加入 2-5 U的T叫DNA聚合酶(對于〉lkb的長片段PCR， 一般采用準(zhǔn)確率高 的pfuDNA聚合酶)，用水將體積補(bǔ)至50tU。另外按照PCR儀的使用說 明決定是否加入石蠟油。PCR反應(yīng)中退火的溫度和延伸的時間都需要根 據(jù)實(shí)際的情況進(jìn)行調(diào)整。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定正確后合并，用氯仿抽提， 去除其中的DNA聚合酶1.2.1.5 DNA酶切片段的回收(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳)在濃度合適的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(堿基數(shù)〈lkb的片段一 般采用1.5%的瓊脂糖凝膠，堿基數(shù)〉lkb的片段一般采用1%的瓊脂糖凝 膠)。回收電泳一般采用1XTAE電泳緩沖液，電壓不宜太高，不超過 15V/cm。電泳完畢后，在紫外燈下切下所需條帶。利用DNA回收試劑盒 回收目的條帶。注意， 一般小于200bp的DNA片段不宜采用這個方法回 收，因?yàn)榛厥章侍?。酶切小片段的回收我們采用下面的方法酶切?的反應(yīng)物用等體積酚-氯仿溶液抽提，回收水相，這樣基本可以除去內(nèi) 切酶，可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn) 1.2. 1.6 DNA連接反應(yīng)一般采用10 u 1的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)。10 u 1的反應(yīng)體系中含 有1 u 1 10X L DNA Ligase緩沖液，1-2 U T., DNA Ligase， 0. 1 u g載 體DNA和5-10倍于載體DNA摩爾數(shù)的插入DNA片段(根據(jù)插入片段的 長度)。16。C反應(yīng)12小時。1.2.1.7感受態(tài)細(xì)胞的制備(以常用的DH5a為例)將凍存的DH5 a菌株劃板培養(yǎng)過夜。挑取一個單菌落接種于5 ml LB 培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)12小時。然后按照1: 50的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 37。C繼續(xù)培養(yǎng)2小時。停止培養(yǎng)后，4000rpm 4。C離心IO分鐘，棄去上 清。用1/5培養(yǎng)基體積的預(yù)冷的0. 1 M CaCl2溶液懸浮菌體，冰浴30分 鐘。4000rpm 4。C離心10分鐘，棄上清。加入1/10培養(yǎng)基體積的預(yù)冷 的0. 1M CaCL溶液懸浮菌體，4。C過夜(此間可以檢測感受態(tài)細(xì)胞的效 率)。感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入50%甘油至終濃度為15%，每管100ul分 裝，凍存于-7(TC。 BL21的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法基本相同，只是將LB
培養(yǎng)液換成LB(ChD培養(yǎng)液。注意用作感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)的試管、 三角瓶和離心管最好不要使用洗滌劑洗滌，因?yàn)闅埩舻南礈靹蟠笥?響感受態(tài)細(xì)胞的效率。1.2. 1.8外源DNA的轉(zhuǎn)化①質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化取20iil感受態(tài)細(xì)胞，加入IO ng質(zhì)粒DNA， 冰浴30分鐘，42r準(zhǔn)確水浴90秒，冰浴5分鐘，涂布含有特定抗生素 如氨芐青霉素或者氯霉素，的培養(yǎng)板，37'C培養(yǎng)過夜；②連接DNA產(chǎn)物 的轉(zhuǎn)化取100ti 1感受態(tài)細(xì)胞，加入10nl連接反應(yīng)產(chǎn)物，冰浴30分 鐘，42。C準(zhǔn)確水浴90秒，冰浴5分鐘，涂布含有特定抗生素的培養(yǎng)板， 37'C培養(yǎng)過夜。 1.2.1.9重組子篩選我們采用酶切法和PCR法進(jìn)行重組子鑒定。實(shí)驗(yàn)中也可以根據(jù)實(shí)際 情況采用其他的鑒定方法。各種重組質(zhì)粒最后都要經(jīng)過DNA測序來確定 序列的正確性。1.2.2蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、鑒定方法1. 2. 2. 1外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到表達(dá)菌株當(dāng)中，培養(yǎng)表達(dá)菌株E"7j BL21(DE3)-codenplus至濃度達(dá)到0D0.6 (600nm紫外光吸收值)，加入 誘導(dǎo)物IPTG，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。培養(yǎng)溫度、菌的濃度、誘導(dǎo)物的濃度 以及誘導(dǎo)表達(dá)時間要根據(jù)不同的情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。我們實(shí)驗(yàn)中，采 用￡^"' BL21(DE3)-coden plus菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)。 一般培養(yǎng)溫度采 用30°C，菌濃度OD值0. 6時加入誘導(dǎo)物IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)物濃度一般為 0. 5 mM，誘導(dǎo)時間9小時到12小時。 1.2.2.2包涵體的處理在中表達(dá)的蛋白有時會形成包涵體，包涵體的處理方法-一 般是①5000rpm， 5分鐘離心收集菌體，用TN buffer (pH7.5 50mM Tris-HCl+O. 15M NaCl)重新懸浮菌體；超聲破碎菌體，超聲破碎的條 件一般為功率300W、超聲15秒、間歇15秒、循環(huán)30次。在這樣的
條件下一般可以取得滿意的破碎效果；②10 OOOrpm， 15分鐘離心收集 包涵體；用TNT buffer (TN buffer+1% Triton X-100)充分洗滌包涵 體，建議采用超聲波懸浮或使用電磁攪拌子充分?jǐn)嚢?；③重?fù)步驟② @使用8M尿素或6M鹽酸胍溶解包涵體，10 OOOrpm， 15分鐘離心，棄 沉淀；上清為變性的目的蛋白 1.2.2.3表達(dá)蛋白的純化 因?yàn)槲覀兪褂玫膒ET21a表達(dá)載體，在表達(dá)蛋白的C-末端會帶有一 個由6個組氨酸殘基組成的His-tag，利用His bind Resin親和色譜 柱可以將帶有His-tag的蛋白純化。為了達(dá)到更高的純度，還可以選用 其他種類的色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步的純化1. 2. 2. 4表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定 參照《分子克隆》中的步驟配制凝膠和進(jìn)行電泳；電泳結(jié)果用考馬 斯亮藍(lán)染色液染色，使用脫色液脫色后觀察。主要試劑及配方30%丙烯酰胺貯存液100ml溶液中含有29g丙烯酰胺， lg甲叉雙丙烯酰胺1.5M Tris-HCl(pH8. 8) :100ml溶液中含有Tris 18. 15g，用濃HCl 調(diào)整pH至8. 81. OM Tris-HCl (p恥.8): 100ml溶液中含有Tris 12. lg,用濃HCl調(diào)整pH至6.82X上樣緩沖液:lOOmM Tris-HCl(pH6. 8)，0. 2%溴酚蘭，20%甘油， 4%SDS, 1%p-巰基乙醇SDS電泳緩沖液1000ml溶液中含有Tris 3. 02g，甘氨酸18. 8g， SDS lg 考馬斯亮藍(lán)染色液1000ml溶液中含考馬斯亮藍(lán)R-250 2. 5g，甲 醇450ml ，冰醋酸100ml脫色液1000ml溶液中含冰醋酸100ml，甲醇250ml1. 2. 2, 5表達(dá)蛋白的Western-blotting鑒定 利用轉(zhuǎn)移裝置將SDS-PAGE電泳結(jié)果轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(轉(zhuǎn)移緩沖 液Tris 25mM，甘氨酸192mM， 20%甲醇，pH8. 3)， 一般采用350mA恒
流轉(zhuǎn)移i個小時(冰浴)。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜用封閉液(1. 5%BSA或 者1.5%的脫脂奶粉)封閉過夜；用TBST (TBS+0.05% Triton 100)和 TBS (Tris-HCl lOraM, pH 7.4， NaCl 150mM)溶液各洗三次，每次10 分鐘；然后加入適當(dāng)稀釋的一抗，室溫反應(yīng)2-4小時；用TBST和TBS 溶液各洗三次，每次10分鐘；加入二抗進(jìn)行雜交，室溫反應(yīng)2-4小時 用TBST和TBS溶液各洗三次，每次10分鐘；根據(jù)二抗的標(biāo)記物選擇合 適的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)采用的二抗一般是由堿性磷酸酶(AP) 標(biāo)記的抗體，采用試劑盒進(jìn)行染色。 1. 2.2.6蛋白質(zhì)濃度測定 利用考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白濃度。5ml考馬斯亮藍(lán)染色液 (lOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%的乙醇當(dāng)中，加入100ml 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，過濾)中加入100ul樣品，搖勻，放置 30秒后，595nm測定吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)的BSA蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定 待測樣品的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出蛋白濃度。堿性物質(zhì)對測定結(jié)果 有干擾，因此需要選擇正確的對照樣品。1.2.3免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法1.2. 3. 1免疫小鼠① 皮下注射免疫——將抗原調(diào)整到合適的濃度，將其與福氏佐劑等體積混勻?；靹虻倪^程比較麻煩，我們采用的方法是將抗原溶液和佐劑分別等體積吸入兩個注射器當(dāng)中，通過一個三通接頭將兩個注射器連 接。將兩個注射器連通，反復(fù)推動活塞，將兩個注射器里面的溶液混勻，一般需要推動50次以上。轉(zhuǎn)動三通，將己經(jīng)基本混勻的乳濁液放一滴 到水中進(jìn)行觀察，如果混合液不散開，而是形成小油滴，那么就混合的 比較完全了。如果不很完全的話，可以在混合幾次。分別用碘酒和醫(yī)用 酒精棉球?qū)π∈笃つw進(jìn)行局部消毒；針頭插入皮膚后應(yīng)該向前進(jìn)針，不 要過于向下，以免扎入小鼠體腔造成內(nèi)出血。 一般在第0天和第21天兩 次免疫，第二次免疫后一周可以進(jìn)行免疫效果的評估實(shí)驗(yàn)。② 肌肉注射免疫一~"將抗原調(diào)整到適當(dāng)濃度，在小鼠的大腿肌肉h
進(jìn)行注射，應(yīng)該多選幾個注射點(diǎn)，每個點(diǎn)注射量不需要太多；有條件的 話可以采用基因槍注射。不管采用哪種免疫方法，我們在注射前都將小鼠用 乙醚麻醉以減輕小鼠的痛苦，消除小鼠的緊張感。 2.2.3.2血清中抗體(IgG)的測定小鼠血清中特異性抗體的測定一般采用ELISA的方法。小鼠在麻醉 后斷頭，收集血液，在4。C放置數(shù)小時，可以見有淡黃色的血清析出，收集小鼠血清。按照1: 10、 1: 100、 1: 1000、 1: 10000的濃度梯度用洗滌及稀釋液(NaCl 8. 0g,肌PO, 0. 2g,歸PO, '12H力2. 9g， KC1 0. 2g: Tween-20 0. 5ml，加蒸餾水定容至1000m)稀釋血清。為了測定小鼠血清 中的特定抗體成分，將特定抗原用包被液(Na2C0:i 0. 159g, NaHC03 0. 294g: 在蒸餾水溶解后定容至100ml)配制成一定濃度的溶液，酶標(biāo)板上每孔 --般加10" g的特定抗原，4匸包被過夜。用洗滌及稀釋液洗三次，加 入100u 1封閉液(用洗滌及稀釋液配制成1. 5%的BSA溶液)室溫封閉 4小時；用洗滌及稀釋液洗三次，分別加入不同稀釋度的小鼠血清，室 溫反應(yīng)2小時；用洗滌及稀釋液洗三次，加入服P-標(biāo)記的二抗，室溫反 應(yīng)2小時。用洗滌及稀釋液洗三次，加入底物后顯色。用終止液(2M H,.SO,) 終止顯色，利用酶標(biāo)儀測定450nm光吸收。 底物溶液a.PB溶液:O. 1M pH6. 0磷酸緩沖液b. TMB!t存液:TMB 60mg,溶于10ml DMSO， 4。C歸c. TMB應(yīng)用液取PB溶液10ml，TMB jt存液100 y 1， 30% HA15u 11.2.3.3腸道及陰道抗體(IgA)的測定 小鼠殺死后，將小腸切出，用預(yù)冷的PBS沖洗小腸，每只小鼠使用 3ml左右的PBS進(jìn)行灌洗；或者在小鼠處于麻醉狀態(tài)下，用50u 1的PBS 沖洗小鼠陰道，收集沖洗液。腸道和陰道中得到的沖洗液經(jīng)過離心除去 其中的組織和細(xì)胞碎片。IgA的測定也是采用ELISA的方法，基本歩驟 同上。只是二抗換用抗小鼠IgA的標(biāo)記抗體。
1.2. 3.4淋巴細(xì)胞的分離將小鼠麻醉后斷頭處死，放血(用來進(jìn)行抗體實(shí)驗(yàn))將小鼠的尸體浸泡在75%的酒精溶液中消毒15-30分鐘。取小鼠脾臟，通過300 的濾網(wǎng)制備單個淋巴細(xì)胞。由于細(xì)胞懸液中混有大量的紅細(xì)胞，因此要 利用0.83%的氯化銨溶液洗滌細(xì)胞懸液，離心，棄上清。再用氯化銨溶 液洗滌一次，收集細(xì)胞。此時的細(xì)胞大多數(shù)都是淋巴細(xì)胞，可以用來進(jìn) 行下面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。為了得到更完全T淋巴細(xì)胞，可以使用尼龍棉進(jìn)行 進(jìn)一步的分離。1.2.3.5 CTL反應(yīng)的測定 我們測定CTL反應(yīng)沒有采用C,釋放法，而是采用了測定LDH方法。 其主要原理為乳酸脫氫酶(LDH)是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一，正常情 況下不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)耙細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞攻擊受損后，細(xì)胞中的LDH 就會釋放到介質(zhì)中。測定LDH的含量，即可知道靶細(xì)胞被殺傷的程度。 實(shí)驗(yàn)步驟①制備效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整至所需濃度② 于96孔圓底培養(yǎng)板上進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，設(shè)有殺傷實(shí)驗(yàn)孔 (效、靶細(xì)胞各100 "l)、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔(靶細(xì)胞100ul、培養(yǎng)液100"1)、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔(效應(yīng)細(xì)胞100ul、培養(yǎng)液lOOul) 和最大釋放孔(靶細(xì)胞100ul、 1% NP-40 100ul)，每孔均設(shè)三個復(fù) 孔③ 37 °C， 5% C02培養(yǎng)22小時，然后用冷的生理鹽水50 ii 1/孔終止反應(yīng)④ 每孔取上清100 u 1置于酶標(biāo)測試板中，每孔加100 u 1 LDH反應(yīng)液(LDH試劑盒，Roche公司產(chǎn)品)室溫避光反應(yīng)10-30分鐘； 每孔加入30ul 0.1 M檸檬酸鈉溶液終止反應(yīng)⑤ 酶標(biāo)儀上570nm處測定光吸收⑥ 利用下面的公式計(jì)算特異殺傷百分比CTL (%)=[(殺傷實(shí)驗(yàn)孔-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔-效應(yīng)細(xì)胞自
發(fā)釋放孔)/ (最人釋放孔-靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔)]X 1002. 2. 3. 6 T-proliferation反應(yīng)的測定 我們的實(shí)驗(yàn)采用MTT法來測定T-proliferation反應(yīng)。--般 T-proliferation反應(yīng)都是用H:i摻入的方法來測定的。我們由于受到實(shí) 驗(yàn)室條件的限制，采用了 MTT法來測定。MTT法測定T-proliferation -決徙、簡單、沒有同位素污染，但^敏度不如Ff方法。其原理是活細(xì)胞 內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物(MTT)由黃色還原為藍(lán)色的甲肷，后者可 以溶于某些有機(jī)溶劑，甲肷產(chǎn)量和活細(xì)胞數(shù)成正比。實(shí)驗(yàn)步驟①96孔板培養(yǎng)細(xì)胞(100ul/孔)，終止培養(yǎng)甜每孔加入 MTT(5 mg/ml)10-20u 1， 37 。C溫浴4小時②每孔加入溶劑lOOul (n了采用DMS0、無水乙醇、 10%SDS/0.01M HC1)，震蕩使甲肷產(chǎn)物充分溶解。560腦處測定光吸收 1.2.3.7腫瘤細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn) 采用腫瘤細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)口J以進(jìn)一步評價疫苗的預(yù)防作用和治療作 用。在我們的實(shí)驗(yàn)中采用了兩種實(shí)驗(yàn)方法來評價疫苗的作用。第一種實(shí) 驗(yàn)方法主要是用來評價疫苗是否能夠幫助小鼠抵御腫瘤細(xì)胞侵染，我們 稱之為"免疫預(yù)防"實(shí)驗(yàn)分別在第0天和第21天用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動 物；第二次免疫一周后，在小鼠皮下接種50 OOO個TC-l細(xì)胞(接種的 部位選擇也是比較重要的，為f使腫瘤的生長加快， 一般將腫瘤細(xì)胞接 種在小鼠的肩部、腋窩和大腿內(nèi)側(cè)這樣的經(jīng)常受到摩擦的部位。為「便 T二觀察和測量我們主要選定了病部進(jìn)行注射)， -般 -周左右可見明 的腫瘤生長。測量腫瘤的最t《軸、最短軸和高度，相乘得出腫瘤人小。 當(dāng)某一組的小鼠全部處亡后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在此期間，每當(dāng)有小鼠死亡， 都k!^下來，用來計(jì)算小鼠的生存率。另 -種實(shí)驗(yàn)方法主要是用來評價疫苗是否能夠使已經(jīng)出現(xiàn)的腫瘤減小或消退，我們稱之為"免疫治療"實(shí)驗(yàn)在第0天給小鼠皮下接種50 000個TC-1細(xì)胞， 一周后小鼠可見有腫瘤生長，^般當(dāng)腫瘤體積在 150醒3左厶吋開始實(shí)驗(yàn)。給小鼠接種疫苗，14大后加強(qiáng)免疫一次，測 量腫瘤的大小和小鼠的生存率。當(dāng)某一組小鼠全部死亡吋，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。1.2.4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.2.4.1外源基因在C0S 7細(xì)胞中瞬時表達(dá) 將目的基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA3. l+中，得到所需的重組 DNA。在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用DMEM/10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)COS 7細(xì) 胞，至細(xì)胞長成80"。匯片。將重組DNA進(jìn)行無菌化處理，調(diào)整其濃度為 0. 5" g/n 1。將4Qu i重組DNA (約20u g)、 50 n 1脂質(zhì)體和10 u 1無 菌水混勻，室溫下放置15分鐘。加入5ml DMEM培養(yǎng)液，混勻后加入細(xì) 胞培養(yǎng)皿中，37°C 5% COz培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)液吸出，加入新鮮的 DMEM/10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，然后收取細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒 定1. 2. 4. 2外源基因在肌肉細(xì)胞中的表達(dá)將目的質(zhì)粒通過針頭或基因槍注射的方法注入到肌肉當(dāng)中。 一般在 注射的3-4天后，取注射位置的肌肉，放入液氮速凍。使用研缽將冷凍 后的肌肉研磨，加入PBS和蛋白酶抑制劑ALLN。離心去除不溶物，上清 取樣進(jìn)行鑒定。1.2.4.3外源基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Balb/c 3T3哺乳動物細(xì)胞將目的基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabe-puro中，得到所需的重 組DNA。在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用DMEM/10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)Balb/c 3T3細(xì)胞，至細(xì)胞長成60%匯片。將重組DNA進(jìn)行無菌化處理，調(diào)整其 濃度為0. 5 u g/ u 1。將40 u 1重組DNA (約20 u g)、 50 u 1脂質(zhì)體和10 ul無菌水混勻，室溫下放置15分鐘。加入lml DMEM培養(yǎng)液，混勻后 加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C 5%0>2培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)液吸出，加入新鮮 的DMEM./10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。換用含有2 " g/u 1 puromydn 的匿EM/1(F。FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時，此時可觀察到細(xì)胞大量死亡；換 用含有1 P g/P 1 puromycin的DMEM/10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并且在 以后的培養(yǎng)中都采用這種培養(yǎng)基來保持選擇壓力。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)皿上出現(xiàn) 明顯的細(xì)胞克隆(白斑)時，將細(xì)胞克隆用胰蛋白酶消化后轉(zhuǎn)入24孔 培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)；長滿后再轉(zhuǎn)移到6孔板培養(yǎng)；最后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿
中培養(yǎng)。收集細(xì)胞，利用Western-blotting或流式細(xì)胞技術(shù)鑒定所得 到的細(xì)胞克隆是否含有目的基因1.2.4.4軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 將冷卻至5(TC的1. 2%瓊脂糖2ml與2ml 2XDMEM培養(yǎng)基混勻，倒 入60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中作為支持層。消化待檢査細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 500 000個/ml。取0. lml與2ml 0. 66%的瓊脂糖和2ml 2XDMEM培養(yǎng)基 混勻，加在支持層上待培養(yǎng)基凝固后加入2ml DMEM培養(yǎng)基，37°C 5% C02培養(yǎng)。每3天換一次培養(yǎng)液，4周后統(tǒng)計(jì)集落形成數(shù)量。每個細(xì)胞克 隆都進(jìn)行3個平行實(shí)驗(yàn)1.2.5 HPV 16 "假病毒"的制備1.2.5.1 sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組蛋白重組質(zhì)粒5u 1 (濃度100ng/ii 1)， BacPAK6 DNA 1和ddH20 86 u 1混勻，再加入BacPAK6 DNA Kit中的buffer 4u 1，混勻，室溫下 放置15-30分鐘；加入900"1T畫-FH培養(yǎng)基，混勻。25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng) sf9細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長到70%匯片的時候，加入前面配制的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染溶液，轉(zhuǎn)染6天，得到P1代含重組桿狀病毒的上清。取200ulPl 代上清侵染sf9， 4天后得到P2代上清。測定病毒滴度后，采用合適的 病毒量侵染大量培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，得到重組蛋白。接種量用下面的公式 計(jì)算所要moi(pfu/ml) X總細(xì)胞數(shù)所需接種量(mlh--------------------------------------病毒接種效價(pfu/ml) 1.2.5.2重組桿狀病毒的滴度測定在3個6孔培養(yǎng)板的每一個孔中加入2ml TNM-FH培 養(yǎng)基(含10y。FBS)和1X106個sf9細(xì)胞，置于27。C培養(yǎng)卜2小時； 將含有40 ml4y。瓊脂糖凝膠的100ml瓶在7(TC水浴，另將一個100ml 空瓶和1. 3 X的培養(yǎng)基在4(TC水??；sf9細(xì)胞在平板上培養(yǎng)一段時間后， 觀察單層細(xì)胞，確定細(xì)胞附著及達(dá)到50%匯片；稀釋病毒上清，得到 10—'到10"幾個稀釋度的病毒母株稀釋液；吸去sf9細(xì)胞的培養(yǎng)液，加 入lml不同稀釋度的病毒稀釋液，27'C培養(yǎng)1小時；吸去病毒稀釋液，加入2ml孔板覆蓋液(30ml 1. 3 X的培養(yǎng)基和10ml 4%瓊脂凝膠混合， 4(TC保溫)；27。C培養(yǎng)5-10天，每天觀察平板直至空斑計(jì)數(shù)連續(xù)兩天 不變；用6孔板上每一孔最佳計(jì)數(shù)范圍3-9個空斑測定接種液效價。用下面的公式計(jì)算Pfu/ml (原始母株)=(l/稀釋倍數(shù))X空斑數(shù)X (1/病 毒液接種量ml)1.2.5.3超速離心制備病毒樣顆粒 500ml sf9細(xì)胞培養(yǎng)物1000rpm離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀。沉淀 中加入30ml 0.5% NP-40溶液，懸浮后室溫放置15分鐘；10 OOOrpm 4 t:離心15分鐘，收集沉淀沉淀中加入20ml蒸餾水，超聲破碎；超聲 后樣品10 OOOrpm 4'C離心15分鐘，收集上清部分。向上清中加入固體 CsCl，使其終濃度達(dá)到30% (W/W)或直接配制30% (W/W)的CsCl溶 液，離心時將上清液加在CsCl溶液的上部。采用Backman sw32轉(zhuǎn)頭離 心，條件為28 OOOrpm 4°C 18小時。超速離心完畢，可見一乳白色區(qū) 帶，吸出后進(jìn)行鑒定。1.2.5.4電子顯微鏡觀察樣品 將需要觀察的樣品進(jìn)行透析，除去其中的高濃度鹽分；吸取10yl 樣品滴于銅網(wǎng)支持的碳膜上，40秒后用濾紙將多余的溶液吸去；向銅網(wǎng) 上滴加10iil 2%醋酸鈾染色液，染色90秒左右，用濾紙將溶液吸干； 晾千銅網(wǎng)。制備好的樣品銅網(wǎng)放入電子顯微鏡觀察，放大倍數(shù)33， 000。 1.2.5.5質(zhì)粒DNA的包裹100 u g的VLPs用解離緩沖液(pH7.5 Tris-HCl， 0.15M NaCl, lmM EDTA, 20mM DTT)室溫透析2小時。然后向已經(jīng)解離的 衣殼粒中加入100" g的真核表達(dá)質(zhì)粒，對5mM的CaCL溶液透析，室 溫過夜。為了驗(yàn)證有質(zhì)粒DNA包裹進(jìn)VLPs中，重新包裹完成后，先使 用10 IU Benzonase 20。C反應(yīng)1小時，除去沒有被包裹和吸附在VLPs上的質(zhì)粒 DNA。然后向混合物中加入SDS(3y。)和蛋白酶K(lmg/ml),56。C水浴2小時。然后 使用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀的方法得到質(zhì)粒DNA。利用電泳進(jìn)行鑒定。 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2人乳頭瘤病毒的核酸疫苗研究核酸疫苗是上世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種新型的疫苗，由于其在預(yù)防和治療病毒感染上潛在 的優(yōu)點(diǎn)，最近對它的研究比較熱門(Liu MA, 2003)。我們所研究的人乳頭瘤病毒(Hu隨n Papillomavirus, HPV)是比較典型的DNA病毒，因此我們在對病毒整個基因組和病毒的生活 史了解得比較充分的基礎(chǔ)上，開始了一種針對HPV16的DMA疫苗的研究。將病毒基因組中的 早期表達(dá)基因E6分成兩個部分，這樣做的目的主要是為了破壞E6蛋白的轉(zhuǎn)化活性，在它們 中間插入一段早期表達(dá)基因E7的片段(38-57位氨基酸)，構(gòu)成一個新的重組基因。將這個新 的基因構(gòu)建到可以在真核細(xì)胞中表達(dá)的pcDNA3. l+載體中。將重組基因注射到小鼠的肌肉中， 考察對小鼠的免疫保護(hù)作用。2.2.1真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3.1+的構(gòu)建2. 2. 1. 1 PCR得到HPV16 E7和E6的DNA片段以pHPV-16質(zhì)粒作為模板，分別采用下面的引物進(jìn)行PCR: E6 N-端PCK，使用引物sense p畫r 5 ， AGAGGATCCATGCACCAAAAGAG 3，antis匿primer 5， ACGAATTCTGG ATTCCCATCTC 3'C-端PCR，使用引物 sense primer 5' GCAAGCTT CCATAT GCTGTATG 3'antisense primer 5, GCACTCGAGCAGCTGGGTTTC 3'E6兩段DNA的PCR擴(kuò)增采用相同的條件94°C預(yù)變性300秒；94'C變性40秒'53 。C復(fù)性30秒，72'C延伸30秒，循環(huán)30次；72'C末延伸300秒。 E7:'": PCR，使用引物sense primer 5， GAGGAATTCATGATAGATGGTCC 3'Iantisense primer 5， GCGAAGCTTAAAGGTTACAATATTG 3'歷"疆PCR條件為94°C預(yù)變性300秒；94r變性40秒，5rC復(fù)性30秒，72。C延伸30秒， 循環(huán)35次；72r末延伸300秒。產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后(參見圖1),用氯仿抽提，冷凍保存。 2. 2. 1. 2將三段PCR片段在pBluescript SK-質(zhì)粒上進(jìn)行連接組裝利用正確的限制性內(nèi)切酶處理3段PCR產(chǎn)物和pBluescript SK-質(zhì)粒，回收純化DNA片段。 采用10ul連接體系進(jìn)行連接，加入3段PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒(參見圖2)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在Amp+LB平板上篩選。陽性克隆進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。構(gòu)建完全正 確的真核表達(dá)質(zhì)粒命名為E6E7-PBS，大量擴(kuò)增保存。 2. 2.1. 3將E6E7 DNA片段插入pcDNA3. 1+質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶I和W0 I從質(zhì)粒E6E7-PBS上切下E6E7片段，同時也利用這兩個 內(nèi)切酶酶切pcDNA3.1+質(zhì)粒，回收純化DNA片段。采用10ul連接體系進(jìn)行連接，加人酶切 回收的E6E7片段和載體質(zhì)粒(Fig. 3. 14)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在Amp+LB 平板上篩選。陽性克隆進(jìn)行雙酶切和測序鑒定(參見圖3)。構(gòu)建正確的真核表達(dá)質(zhì)粒命名為 E6E7-pcDNA3.1 + (參見圖4)，大量擴(kuò)增保存。2.2.2真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3.1+的表達(dá)2. 2. 2. 1真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3. 1+在體外細(xì)胞中的表達(dá)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中的步驟，將真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3.1+轉(zhuǎn)移到COS 7細(xì)胞中進(jìn)行瞬時表 達(dá)。通過Western-blotting鑒定，可以看出這個真核表達(dá)載體能夠在體外細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(參見圖5)。2. 2. 2. 2真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3. 1+在肌肉細(xì)胞中的表達(dá)將真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3.1+按照50li g、 100 y g和200 U g三個劑量注射入小鼠的 大腿肌肉中通過Western-blotting鑒定，我們發(fā)現(xiàn)不同的注射劑量引起的表達(dá)水平也是不同 的(Fig.3.18)，高的注射劑量引起的表達(dá)水平也高。同時我們也發(fā)現(xiàn)，真核表達(dá)載體 E6E7-pcDNA3.1+在肌肉中表達(dá)的時間還是比較長的，4周后還能在部分小鼠肌肉中檢測到表 達(dá)(data noi; shown)。2.2.3 E6E7基因的轉(zhuǎn)化活性研究2. 2. 3. 1 E6E7-pBabe-puro逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體的構(gòu)建利用構(gòu)建好的E6E7-pcDNA3.1+作為模版，進(jìn)行PCR得到E6E7 DNAPCR片段，通過5flw/ZI 和&// I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將其插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabe-puro中，得到逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體 E6E7-pBabe-puro(參見圖6)。2. 2. 3. 2含有E6E7重組基因的Balb/c3T3細(xì)胞系的克隆利用逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體E6E7-pBabe-puro轉(zhuǎn)染Balb/c 3T3細(xì)胞系，通過puromycin篩選，得 到轉(zhuǎn)化有E6E7重組基因的細(xì)胞系。作為對照，將pBabe-puro空載體和wtE6-pBabe-puro載體 也轉(zhuǎn)入到Balb/c3T3細(xì)胞中，抗性篩選，得到轉(zhuǎn)化克隆。 2. 2. 3. 3軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果從軟瓊脂集落形成的結(jié)果來看，轉(zhuǎn)染了 E6E7重組基因的細(xì)胞系的集落形成數(shù)和轉(zhuǎn)染空載體 的細(xì)胞系形成的集落數(shù)相近而ME6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系形成的集落數(shù)要明顯多于前兩者，大約為 9倍左右。可見經(jīng)過重組的E6E7基因的轉(zhuǎn)化活性要大大低于野生型的E6基因。這樣在使用 E6E7作為DNA疫苗進(jìn)行免疫時，其轉(zhuǎn)化的危險性要大大降低了 (參見圖7)。2.2.4 E6E7-pcDNA3.1+對小鼠的免疫反應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中的步驟免疫小鼠。將質(zhì)粒無菌化處理后，調(diào)整濃度為2ug/lU。與等體 積的弗氏不完全佐劑充分混合后，按照不同的免疫劑量進(jìn)行注射。所有小鼠分成四組，分別 使用空載體、50 y g E6E7-pcDNA3.1+、 100 U g E6E7-pcDNA3.1+和200 u g E6E7墨pcDNA3.H 注射大腿肌肉。14天后使用相同的注射劑量再進(jìn)行一次免疫。第二次免疫后一周，進(jìn)行免疫 效果的評價。 2.2. 4. l抗體的測定小鼠血清中特異性的E6E7抗體的測定采用ELISA的方法來完成。使用原核表達(dá)純化的E6E"7 蛋白包被酶標(biāo)板。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)特異性的抗體水平并不是很高。雖然使用200 "g E6E7-pcDNA3.1+進(jìn)行免疫可以最大的誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，但抗體的效價比較低(參見圖8)。 2. 2. 4. 2 CTL反應(yīng)重組質(zhì)粒能夠引起比較高的CTL反應(yīng)。從結(jié)果可以看出'CTL反應(yīng)的強(qiáng)弱和免疫的劑量 相關(guān)，使用更多量的DNA進(jìn)行注射可以得到更好的CTL反應(yīng)效果。如果使用B16細(xì)胞作為
靶細(xì)胞的話，各組之間的CTL反應(yīng)沒有明顯差別，同時水平也很低，這說明利汁j E6E7-pcDNA3.1+誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL反應(yīng)是特異性的(參見圖9)。 2. 2. 4. 3腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了評價E6E7-pcDNA3.1+對小鼠的免疫預(yù)防和免疫治療效果，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。頭'驗(yàn) 分為免疫預(yù)防組和免疫治療組兩組來進(jìn)行。免疫預(yù)防組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用不同劑量 E6E7-pcDNA3.1+進(jìn)行兩次免疫后(0天和第14天)，小鼠接受TC-1細(xì)胞皮下注射，在實(shí)驗(yàn) 觀察的7周里，200u g組僅有一只小鼠出現(xiàn)腫瘤生長，IOOu g組僅有一只小鼠沒有出現(xiàn)腫瘤， 而50yg組所有的小鼠最后都出現(xiàn)了腫瘤生長。由此可見，高劑量的DNA疫苗免疫能夠比 較有效的保護(hù)小鼠免受腫瘤細(xì)胞侵染(參見圖10， 11)。免疫治療組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用200ug E6E7-pcDNA3.1+免疫已經(jīng)有腫瘤生長的小鼠，其中一 部分的小鼠的腫瘤(約占60%)出現(xiàn)了縮小甚至消失的情況。但是還有部分小鼠的腫瘤在繼 續(xù)生長，并最終導(dǎo)致小鼠死亡，不過生長的速度要明顯慢于空白對照組(pcDNA3.1+空載體 免疫)。使用100ngE6E7-pcDNA3.1+免疫的小鼠，也有腫瘤消失的情況出現(xiàn)，但比例比較低 (大約20%左右)。50ug E6E7-pcDNA3.1+免疫組中，小鼠腫瘤成長的速度沒有明顯減緩， 和空白對照組基本上相同。結(jié)果表明，高劑量的DNA疫苗對清除已經(jīng)出現(xiàn)的腫瘤有比較明 顯的效果(參見圖13， 12)。2.3人乳頭瘤病毒的"假病毒"疫苗的研究在前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步提出了利用HPV 16型"假病毒"來進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn) 設(shè)想。就是利用HPV 16病毒的晚期表達(dá)蛋白Ll組成的病毒樣顆粒(vims-Uke particles, VLPs)， 包裹著表達(dá)病毒早期基因E6、 E7的真核表達(dá)載體組成的一個和天然病毒相似的結(jié)構(gòu)。這樣 的一個"假病毒"有可能模擬天然病毒對機(jī)體的感染過程，同時引發(fā)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。2.3.1人乳頭瘤病毒"假病毒"的制備2. 3. 1. l重組質(zhì)粒的構(gòu)建從謝雍老師實(shí)驗(yàn)室得到經(jīng)過優(yōu)化的HPV16L1的基因作為模版，采用引物 sense primer 5' CGCTCGAGATGCAGGTGACTTTTATTTAC 3' A7wlantisense primer 5， GCTCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCG 3' 勘I進(jìn)行PCR ( 95°C預(yù)變性300秒；95'C變性40秒，56。C復(fù)性40秒，72。C延伸60秒，循 環(huán)30次；72'C水延伸300秒)，得到的PCR片段經(jīng)A zo I和A7w I酶切后回收，通過連接反 應(yīng)插入到載體pBacPAK8中，得到表達(dá)載體HPV16Ll-pBacPAK8 (參見圖14)。經(jīng)酶切鑒定 (參見圖15)和DNA序列測定，質(zhì)粒構(gòu)建正確。 2.3. 1.2重組病毒上清將表達(dá)載體HPV16Ll-pBacPAK8以及線性化桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行重組。重 組后的病毒上清進(jìn)行滴度測定，我們得到的P2病毒上清的滴度為 2X107pfu/ml。2.3.1.3病毒樣顆粒(VLPs)的制備計(jì)算moi=0.1時的所需要的病毒接種量，使用病毒上清進(jìn)一步大量侵染sf9細(xì)胞。通過 SDS-PAGE(參見圖16)和Western-blotting(參見圖17)分析，可以看出HPV16 Ll蛋白可以在 sf9種高效表達(dá)，并且在感染后4天時，Ll蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大。Ll蛋白在sf9昆蟲細(xì)胞 中能夠自發(fā)組裝成病毒樣顆粒VLPs。通過CsCl密度梯度超速離心得到一條乳白色條帶(參 見圖18)，這里主要是VLPs。透析除去CsCl，通過電子顯微鏡觀察可見直徑約55nm的病毒 樣顆粒(參見圖19A) 2.3.1.4病毒樣顆粒的解離使用解離緩沖液處理病毒樣顆粒，室溫透析2-4小時，電鏡觀察可以看到呈解離狀態(tài)的病毒 樣顆粒亞基(Fig.3. 33 B)。 2.3. 1.5 "假病毒"的制備將解離的病毒樣顆粒亞基和真核表達(dá)載體E6E7-pcDNA3.1+混合，然后對5mM的CaCl2 透析，室溫透析過夜。超速離心后，收集組分進(jìn)行ELISA鑒定，"假病毒"的沉降密度要略 大于VLPs。通過ELISA鑒定收集到的組分，可見有兩個吸收峰(參見圖18)，所對應(yīng)的CsCl 梯度分別為1.28g/cri^和1.31 g/cm^在高密度的組分可以檢測出有質(zhì)粒DNA包裹在其中(參 見圖21)，這就是我們需要的"假病毒"顆粒(參見圖19C)。2.3.2 "假病毒"對小鼠的免疫保護(hù)作用將"假病毒"以及VLPs與等體積的弗氏完全佐劑完全混合。每只小鼠皮下注射50wg"假病
毒"或VLPs， 14天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，這次將佐劑換成弗氏不完全佐劑。第二次免疫 后7天，進(jìn)行免疫結(jié)果評價作為陰性對照的小鼠，皮下注射PBS與佐劑的混合物。2.3.2.1免疫后血清中有明顯的L1抗體產(chǎn)生使用"假病毒"和VLPs免疫的小鼠的血清中均可以檢測到明顯的抗VLPs的IgG抗體，而且在量上沒有明顯的差異。使用PBS免疫的小鼠則沒有明顯的抗體產(chǎn)生(參見圖22)。3. 3. 2. 2陰道或小腸中能檢測到IgA使用"假病毒"和VLPs免疫的小鼠的小腸和陰道中可以檢測到抗VLPs的IgA抗體，但是水平不是很高。 一般來說，通過粘膜免疫可以得到比較滿意的IgA抗體反應(yīng)，而皮下注射這種免疫方式對產(chǎn)生分泌型的IgA并不是十分有效。使用PBS免疫的小鼠則沒有明顯的抗體產(chǎn)生(參見圖23)，從這一點(diǎn)來看，皮下注射還是能夠產(chǎn)生一定的IgA抗體反應(yīng)。2.3.2.3 CTL反應(yīng)可以檢測出，但水平不是很高"假病毒"免疫過的小鼠可以檢測到E7特異性的CTL反應(yīng)，而使用VLPs免疫的小鼠沒有檢測出明顯的CTL反應(yīng)。不過使用"假病毒"所產(chǎn)生的CTL反應(yīng)也比較弱，有可能是因?yàn)?假病毒"中所包被的真核表達(dá)質(zhì)粒的量比較少，不足以引發(fā)更為明顯的CTL反應(yīng)(參見圖24)。
權(quán)利要求
1、一種HPV病毒的免疫原，其特征在于用HPVE7基因與IgG融合。
2、 一種HPV重組蛋白，其特征在于用HPVE6 、 E7基因嵌合。
3、 一種HPV的假病毒，其特征是采用病毒蛋白包裹重組質(zhì)粒構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人乳頭瘤病毒疫苗及其制備方法。在本發(fā)明中涉及到人乳頭瘤病毒的免疫原的建立，對人乳頭瘤病毒特定基因的改造，以及人乳頭瘤病毒假病毒的制備等方面。
文檔編號C12N15/62GK101148678SQ200610104659
公開日2008年3月26日 申請日期2006年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月22日
發(fā)明者黎 余, 旭 周, 靜 安, 胡美浩, 謝思遠(yuǎn), 錢雪瑩, 平 韓 申請人:蘭州生物制品研究所