口服重組幽門螺桿菌疫苗及其制備方法

專利名稱：口服重組幽門螺桿菌疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種用于人幽門螺桿菌感染免疫預(yù)防的基因工程疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
2005年度諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎(jiǎng)授予了兩位發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的科學(xué)家，因?yàn)橛拈T螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是人類上消化道疾病的重要致病菌，為慢性胃炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍的主要病因。世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)其與胃癌密切相關(guān)的病原菌，同時(shí)將其列為第一級(jí)致癌因子。Hp是世界上感染率最高的細(xì)菌之一，世界人口的平均感染率達(dá)50％，發(fā)展中國(guó)家的感染率更高，中國(guó)Hp感染者達(dá)6億，每年因?yàn)槲赴┧劳稣哌_(dá)20萬人。人類健康正面臨著Hp的嚴(yán)重威脅與危害。目前抗生素治療Hp感染雖具有積極的臨床意義，但仍存在明顯不足1)毒副作用；2)耐藥菌株產(chǎn)生；3)費(fèi)用高；4)療程長(zhǎng)，患者依順性差；5)療效欠穩(wěn)定等。疫苗是控制感染性疾病最為經(jīng)濟(jì)有效的辦法，通過疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生不同于自然感染導(dǎo)致的特異性免疫應(yīng)答，可以達(dá)到預(yù)防或者治療Hp感染的目的。由于Hp大規(guī)模培養(yǎng)困難，粗制抗原中有潛在致癌物等有害成分，大大制約了全菌疫苗的研究進(jìn)展?；蚬こ桃呙缇哂邪踩?、有效、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，易于推廣和應(yīng)用，是Hp疫苗的一個(gè)主攻方向。國(guó)內(nèi)外竟相研究Hp疫苗，但迄今尚未成功。
尿素酶是一種催化尿素水解成氨和碳酸的鎳依賴性酶，為幽門螺桿菌中表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)，在Hp細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上都有分布，占Hp總蛋白的5％-10％。尿素酶通過中和胃酸幫助細(xì)菌在胃內(nèi)的定居并為細(xì)菌蛋白質(zhì)合成提供氨。宿主組織可直接受到尿素酶介導(dǎo)的氨產(chǎn)生的損傷，或間接受到尿素酶誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的刺激作用的損傷。阻斷尿素酶基因的表達(dá)將抑制幽門螺桿菌在宿主內(nèi)的定居、減少細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，并降低與幽門螺桿菌相關(guān)的炎性反應(yīng)。在Hp感染患者中，尤其是有癥狀的患者中都能夠檢測(cè)到尿素酶B的抗體，抗體水平與病情的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性?？诜臃N幽門螺桿菌尿素酶或重組尿素酶B亞單位(rUreB)可保護(hù)小鼠免受幽門螺桿菌的感染并可消除已存在的感染(Michetti etal.，Gastroenterol.1994)。尿素酶活性在Hp感染中具有重要作用，缺失尿素酶活性的Hp在動(dòng)物模型中不能導(dǎo)致感染，中和尿素酶活性的抗體可能在抵抗Hp定植中起關(guān)鍵作用。從以上的研究結(jié)果可以認(rèn)為尿素酶抗體，尤其是能夠中和尿素酶活性的抗體，在抵抗Hp感染中發(fā)揮著主要作用。
粘膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要包括腸粘膜相關(guān)淋巴組織和支氣管粘膜相關(guān)淋巴組織等，它在機(jī)體防御功能方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用。由腸系膜淋巴結(jié)，以及分散在粘膜固有層和腸上皮中的大量淋巴細(xì)胞組成免疫誘導(dǎo)部位和免疫效應(yīng)部位。胃腸道等粘膜表面各種免疫細(xì)胞通過攝取、加工和提呈抗原，產(chǎn)生并分泌針對(duì)該抗原的抗體(主要為sIgA)，后者能與攜帶此抗原的載體如細(xì)菌、病毒等發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，阻止其定植粘膜表面或侵襲機(jī)體，從而起到一定的免疫防御作用。
但是，粘膜免疫的最大缺陷是易對(duì)抗原產(chǎn)生免疫耐受，即使提高抗原量，機(jī)體或粘膜產(chǎn)生的抗原特異性sIgA水平卻很低，對(duì)相應(yīng)抗原的微生物感染幾乎沒有免疫防御能力或極弱、極易導(dǎo)致免疫耐受性的發(fā)生。不耐熱腸毒素(heatlabile toxin，LT)是由腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(enterotoxigenic escherichiacoli，ETEC)產(chǎn)生、能引起人和某些家畜嚴(yán)重腹瀉的一種不耐熱腸毒素，近年來被認(rèn)為是非常有前景的粘膜免疫佐劑。Rollwagen等研究表明，LT可以加強(qiáng)彎曲菌的粘膜免疫應(yīng)答，并加速腸道對(duì)該菌的清除，而且LT與抗原一起初次免疫動(dòng)物后，將長(zhǎng)期不會(huì)對(duì)該抗原產(chǎn)生免疫耐受。
LT作為粘膜免疫佐劑的觀點(diǎn)已獲公認(rèn)(Lycke N，et al.Immunology，1986，59(2)301-308；Clements JD，et al.Vaccine，1988，6(3)269-277；Giuliani MM，et al.J.Exp.Med.，1998，187(7)1123-1132)，但LT具有很強(qiáng)的腸毒性，所以目前主要以其B亞單位或構(gòu)建LT無毒和低毒突變體作佐劑(Yamamoto M，et al.J.Immunol.，1999，1627015-7021；Martin M，et al.J.Immunol.，2002，169(4)1744-1752；TamuraSI，et al.Vaccine，1994，121238-1240)。但是，LT的A亞單位除了ADP核糖基酶活性外，還與佐劑活性相有關(guān)(Giuliani MM，et al.J.Exp.Med.，1998)。LTA鏈刺激粘膜相關(guān)B細(xì)胞的同型轉(zhuǎn)換，同時(shí)LTA參與粘膜免疫系統(tǒng)的初始階段，使定型的IgA B細(xì)胞從產(chǎn)生部位遷移到遠(yuǎn)端效應(yīng)位點(diǎn)(DeHann L，et al.Vaccine，1996；(4)260-266)。De Haan等發(fā)現(xiàn)缺乏ADP-核糖基酶活性的LT突變體仍存在輔佐性，這些結(jié)果表示LT的輔佐性不依賴于ADP-核糖基活性，而A亞單位對(duì)LT的佐劑活性具有貢獻(xiàn)。De Haan實(shí)驗(yàn)還表明沒有毒性活性的LT突變體通過鼻腔粘膜免疫小鼠仍然保留野生型毒素的免疫特性，但單獨(dú)使用重組LTB比無毒性活性的LT突變體的免疫原性弱(De Haan L，et al.Infect Immun，1996)，說明LTA的ADP核糖基酶活性與毒素的免疫性沒有直接聯(lián)系。此外，LT全毒素產(chǎn)生高水平的全身的IgG和粘膜S-IgA反應(yīng)，而等量LTB僅產(chǎn)生低水平的IgG反應(yīng)，LT比LTB的免疫原性強(qiáng)，說明LTA在毒素的免疫反應(yīng)中起重要作用。
LT由1個(gè)A亞單位(LtA)和5個(gè)B亞單(LtB)位組成。5個(gè)完全相同的LtB在空間上形成環(huán)狀五聚體，1個(gè)LtA位于環(huán)狀五聚體中央，其C-端以非共價(jià)鍵與LtB結(jié)合。A亞單位分為A1和A2兩個(gè)組成，A1是毒素的毒性部分，A2與B亞單位結(jié)合在一起，A1與A2間有二硫鍵連結(jié)。胞漿中的A、B亞單位均以攜帶信號(hào)肽的前體形式存在，當(dāng)穿越細(xì)胞膜后才組裝成完整的LT。B亞單位的作用是與真核細(xì)胞表面的GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體特異性結(jié)合，使LT分子變構(gòu)，A亞單位脫離B亞單位進(jìn)入細(xì)胞膜，隨后二硫鍵降解，A1肽鏈活化，A1亞單位具有GTP依賴的ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，通過G蛋白介導(dǎo)的ADP-核糖基化反應(yīng)破壞胞內(nèi)cAMP的降解與平衡，刺激cAMP水平增高，從而引發(fā)毒素效應(yīng)。
綜上所述，本領(lǐng)域特別需要提供一種以腸產(chǎn)毒性大腸桿菌LT的A2亞單位與B亞單位融合成的LTA2B作為粘膜免疫佐劑的、對(duì)幽門螺桿菌感染具有更強(qiáng)、更完全的保護(hù)效果的重組Hp亞單位分子內(nèi)佐劑疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是公開一種人幽門螺桿菌感染免疫預(yù)防用的重組幽門螺桿菌分子內(nèi)佐劑粘膜疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述人幽門螺桿菌感染免疫預(yù)防用的重組幽門螺桿菌分子內(nèi)佐劑疫苗的設(shè)計(jì)、制備、生產(chǎn)工藝、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的一種人幽門螺桿菌感染預(yù)防和治療用的疫苗包含有由腸產(chǎn)毒性大腸桿菌LT的A2亞單位與B亞單位融合的LTA2B粘膜免疫佐劑和作為免疫原的尿素酶B亞單位。LTA2B缺少LT分子中具有ADP核糖基酶活性的A1部分，克服LT佐劑的毒副作用，同時(shí)在當(dāng)前常用佐劑LTB的基礎(chǔ)上，LTA2B首次增加LT的A2部分，可以提高佐劑活性和免疫原性。
本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，還證實(shí)了該疫苗所含的UreB-LTA2B融合蛋白具有全長(zhǎng)UreB相似的生物學(xué)活性和免疫原性及反應(yīng)原性，同時(shí)具有增強(qiáng)粘膜佐劑活性的功能。
為了更好地達(dá)到上述目的，該疫苗制備過程中選用可降解的緩釋微球(MS)包裹重組融合蛋白。首先，緩釋微球可以有效防止胃酸以及消化道酶類物質(zhì)對(duì)抗原的分解及破壞作用，保持抗原物質(zhì)的整體穩(wěn)定性及抗原活性；其次，MS粒徑大小決定了其在體內(nèi)各器官的分布，人為把握MS制作工藝，將其粒徑控制在一定范圍之內(nèi)并定向誘導(dǎo)其被靶器官俘獲，從而最大限度的發(fā)揮其免疫效力；包裹抗原時(shí)，通過改變載體材料與抗原的配成比例、調(diào)節(jié)載體材料的生物降解作用，從而改變MS的制作孔徑以及抗原物質(zhì)和MS的粘附作用，達(dá)到長(zhǎng)期緩釋抗原的功效。其中，上述包裹制劑主要由海藻酸鈉、植物油、CaCl2和殼聚糖組成。
上述疫苗最后開發(fā)為口服免疫凍干制劑，其凍干制品的賦形劑為8％甘露醇，穩(wěn)定劑為0.05％EDTA-Na2，最適pH值為10.0因?yàn)榭诜腥缦聝?yōu)點(diǎn)一是疫苗抗原成分直接刺激胃腸道粘膜相關(guān)的淋巴細(xì)胞，通過對(duì)腸道抗原的識(shí)別、呈遞和免疫效應(yīng)產(chǎn)生相關(guān)的粘膜免疫應(yīng)答，達(dá)到有效預(yù)防幽門螺桿菌感染所致相關(guān)疾?。欢强诜庖邔儆跓o痛、無創(chuàng)、便利、成本較低、易于被受試者接受。
本發(fā)明提供的一種制備人幽門螺桿菌感染預(yù)防和治療用的疫苗的方法主要包括以下步驟(1)分別克隆幽門螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素LTA2B的編碼核苷酸序列，或與其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的編碼核苷酸序列；(2)采用重疊PCR的方法，將步驟(1)中克隆得到的核苷酸序列連接成融合基因ltA2B-ureB，命名為lu；(3)將lu融合基因構(gòu)建到載體上，轉(zhuǎn)化宿主，表達(dá)重組蛋白LU；(4)步驟(3)具體為將lu融合基因構(gòu)建到載體pET11c上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建重組工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)。所得到的重組質(zhì)粒中至少包含了上述lu氨基酸序列或與其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的編碼核苷酸序列(5)從上述步驟(4)所述的重組工程菌用80L發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)重組蛋白LU(LTA2B-UreB)(6)分離純化由步驟(5)得到的重組蛋白；(7)將上述步驟(6)中所得蛋白制成包裹緩釋物質(zhì)的微球劑凍干品。
(8)步驟(7)的具體方法為取步驟(6)中所得蛋白與海藻酸鈉溶液混勻，加入植物油，乳化后，反向滴定方法滴入到CaCl2溶液中，制成海藻酸鈉包裹蛋白微球劑，將得微球固化后洗滌，離心取沉淀物后重懸；再將其加入到殼聚糖溶液中，形成再包裹，得到殼聚糖海藻酸鈉雙重包裹蛋白微球，再將微球混懸液緩慢倒入西林瓶中，液面高度低于1cm。-40℃冰箱預(yù)凍12小時(shí)后直接置于已預(yù)冷的真空干燥機(jī)內(nèi)干燥，并緩慢提升溫度使水分迅速升華，待氣體壓力指示計(jì)顯示無氣體生成時(shí)取出凍干品待檢。
本發(fā)明一較佳實(shí)施例中將所得疫苗進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該重組幽門螺桿菌疫苗的安全性和免疫原性本發(fā)明另一較佳實(shí)施例中對(duì)該疫苗進(jìn)行人體臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組幽門螺桿菌疫苗的免疫效果。
綜上所述，本發(fā)明以腸產(chǎn)毒性大腸桿菌LT的A2亞單位與B亞單位融合成的LTA2B作為粘膜免疫分子內(nèi)佐劑、以尿素酶B亞單位為免疫原組成重組幽門螺桿菌疫苗，用于人幽門螺桿菌感染免疫預(yù)防，安全有效。
為讓本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為重疊延伸方法得到的lu(ltA2B-ureB)融合基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為ureB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道3為ltA2B融合基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2pET-11c-LU重組質(zhì)粒的酶切鑒定，其中M1.PCR Marker；1.ltB PCR產(chǎn)物(0.4kb)；2.ureB PCR產(chǎn)物(1.7kb)；3.LU PCR產(chǎn)物(2.0kb)；4.pET-11c NdeI酶切(5.7kb)；5.pET-11c-LU NdeI酶切(5.7kb+2.0kb)；6.pET-11c-LU正向重組子BamHI酶切(6.0kb+1.0kb+0.7kb)；7.pET-11c-LU反向重組子BamHI酶切(6.4kb+1.0kb+0.3kb)；M2.λDNA/HindIII Marker。
圖3是融合基因LU重組菌表達(dá)PAGE電泳圖，其中泳道1基因重組菌誘導(dǎo)5小時(shí)；泳道2空質(zhì)粒菌誘導(dǎo)1小時(shí)；泳道3蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)。從中可見，基因重組菌經(jīng)過誘導(dǎo)后在分子量7.2KDa處有增加的蛋白表達(dá)條帶，與目的蛋白分子量一致。經(jīng)過UVP圖像掃描分析，誘導(dǎo)5小時(shí)目的蛋白表達(dá)量約26％。
圖4為目的蛋白LU純化效果PAGE電泳圖，其中，泳道1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道2包涵體溶解液(純化前樣品)空；泳道3，4，5，6，7，8，9目的蛋白洗脫峰樣品。結(jié)果顯示經(jīng)過純化步驟，目的蛋白的純度得到明顯改善，收獲的目的蛋白峰經(jīng)UVP掃描分析純度達(dá)到85-99％。
圖5rHp(重組幽門螺桿菌疫苗)疫苗凍干曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1融合基因lu(ltA2B-ureB)的構(gòu)建一、幽門螺桿菌的UreB和產(chǎn)毒大腸桿菌LTB編碼基因的克隆分別以野生型產(chǎn)毒大腸桿菌H44815(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，本室保存)的基因組DNA，及幽門螺桿菌CC59803(本室分離保存)的基因組DNA為模板，用P1和P2、P3和P4擴(kuò)增ureB和ltA2B基因，細(xì)菌基因組抽提按常規(guī)方法(顏?zhàn)臃f，王海林譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社，1998，P39)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液10μL，MgCl2(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2或P5和P6)各2μL，上述LTB基因組2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3單位/μL)1μL，加滅菌水至100μL。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
(下劃線的部分為相應(yīng)的酶的識(shí)別序列)P1cat atggct cct cag tct att aca gaa cta tgt tcNdeIP2tga tat cgg atc ctg agg gta gtt ttc cat act gat tgc cBamHIP3tac cct caggat ccg ata tca atg aaa aag att agc agBamHIP4cat atgcta gaa aat gct aaa gag ttg tgc caa gcNdeI按常規(guī)方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989聚丙烯酰胺凝膠電泳1.21-1.32)提取TA克隆轉(zhuǎn)化菌株的質(zhì)粒DNA，采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。
二、融合基因ltA2B-ureB的構(gòu)建分別回收ureB和ltA2B的PCR產(chǎn)物。以回收的ureB和ltA2B基因?yàn)槟０?，P1和P4為引物進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系為10×不含鎂離子擴(kuò)增緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(25mmol/L)4μL，上下游引物(P7和P10)各1μL，上述ureB和ltA2B基因各2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(5單位/μl)0.5μL，加滅菌水至50μL。
重疊延伸PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。
PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析同前。
重疊延伸PCR反應(yīng)體系回收的ureB DNA片段1μl回收的ltA2B DNA片段 1μlP1(5pmol/μl) 2μlP4(5pmol/μl) 2μl10×PCR緩沖液 10μldNTPs(5mmol/L)4μlTaq plus DNA聚合酶(3U/μl)1μlddH2O79μl總體積100μl將反應(yīng)體系振蕩混勻，離心處理后，加入20μl石蠟油。94℃預(yù)變性10分鐘，94℃變性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)，72℃完全延伸10分鐘。反應(yīng)完畢后取3μl反應(yīng)產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并回收目的基因片段ltA2B-ureB。采用PCR重疊延伸技術(shù)得到ltA2B-ureB融合基因片段。1％瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖1)，圖中所示片段大小與預(yù)計(jì)相符(1517bp)，初步判定為目的基因片段，并命名為ltA2B-ureB，如SEQ ID NO1所示。圖2中顯示融合基因片段大小與預(yù)計(jì)一致，表明重疊延伸得到融合基因。
實(shí)施例2重組工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的構(gòu)建一.重組工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的構(gòu)建將lu(ltA2B-ureB)融合基因擴(kuò)增(PCR)產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖電泳、膠回收純化后與載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，用NdeI酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
從pMD-18-lu/DH5α陽(yáng)性重組菌中抽提質(zhì)粒DNA，NdeI酶切，回收2.0kb luDNA片段與NdeI酶切且經(jīng)過去磷酸化處理的pET-11c載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，氨芐陽(yáng)性LB平板篩選，挑取可疑菌落抽提質(zhì)粒，NdeI酶切鑒定陽(yáng)性重組子，BamHI酶切鑒定正反向。酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。陽(yáng)性重組子質(zhì)粒DNA經(jīng)NdeI酶切后均產(chǎn)生5.7kb載體片段和2.0kb lu基因片段(第5泳道)，BamHI酶切后反向重組子產(chǎn)生6.4kb+1.0kb+0.3kb三個(gè)片段(第7泳道)，正向重組子產(chǎn)生6.0kb+1.0kb+0.7kb三個(gè)片段(第6泳道)。
有關(guān)操作具體步驟如下1)使用Omega公司提供的質(zhì)粒抽提試劑盒，按照試劑盒使用說明書推薦的方法提取質(zhì)粒DNA。
2)以常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳法(1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。50×TAE儲(chǔ)存液配方2.0mol/L Tris堿，1.0mol/LNaAc，0.1mol/LNa2EDTA；用冰醋酸調(diào)節(jié)pH8.3)分離質(zhì)粒DNA。
3)質(zhì)粒DNA的酶切鑒定反應(yīng)混合物包括1μg質(zhì)粒DNA；1μl 10×緩沖液(見上海生工公司產(chǎn)品說明書)；1μl限制性內(nèi)切酶Nde I(10u/μl)；用雙蒸水補(bǔ)齊至10μl?；旌虾?7℃溫育1-2小時(shí)。
4)瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5ml EP管。
加入Omega公司膠回收試劑盒的DNA結(jié)合緩沖液，65℃水浴使凝膠完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體。
加入配套的洗滌緩沖液，12000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體。重復(fù)洗滌1次。
12000g離心1分鐘，分離管移置另一干凈1.5mlEP管，加入一定體積的TE緩沖液，65℃孵育10分鐘，12000g離心1分鐘，取一定量電泳，UVP紫外掃描儀檢測(cè)回收純化效果。
5)連接反應(yīng)(使用上海生工公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)目的DNA片段和載體片段的濃度，根據(jù)外源片段與載體摩爾數(shù)比一般為1∶2～10的原則，設(shè)計(jì)連接反應(yīng)體系如下目的DNA 1μl；質(zhì)粒載體1～2μl；連接溶液5μl；ddH2O 2～3μl；總體積10μl。22℃連接反應(yīng)12-16小時(shí)。
6)感受態(tài)菌的制備(CaCl2法)無菌接種環(huán)蘸取-70℃凍存的細(xì)菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)。挑取單個(gè)菌落接種于2ml LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)12～16小時(shí)。將過夜培養(yǎng)的DH5α按1％比例轉(zhuǎn)種至LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.2～0.4小時(shí)，8000g離心5分鐘收集細(xì)菌。加入1ml預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴3小時(shí)。4℃ 8000g離心5分鐘，棄上清。加入100μl了預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1小時(shí)，備用。
7)用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞取感受態(tài)菌液100μl，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物；冰水浴60分鐘，42℃水浴熱休克100秒，迅速放置冰水浴1～2分鐘。加100μlLB培養(yǎng)液，37℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)。以8000g離心10分鐘，吸棄100μl上清后混勻沉淀，各取50μl涂布平板，37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
二.高效表達(dá)融合蛋白工程菌的構(gòu)建及篩選將含LU融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并提取質(zhì)粒酶切鑒定。圖2為pET-11c-LU/BL21(DE3)重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為pET-11c-LU/BL21(DE3)重組質(zhì)粒NdeI酶切產(chǎn)物；泳道2為核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道3為空載體質(zhì)粒NdeI單酶切產(chǎn)物(5300bp)。酶切片段大小與設(shè)計(jì)一致，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功?；蚬こ檀竽c桿菌BL21的感受態(tài)菌制備、轉(zhuǎn)化及重組菌的質(zhì)粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)2.5小時(shí)，以IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式和表達(dá)量，篩選高效表達(dá)菌株，圖3。
本發(fā)明還通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了UreB和LTA2B的穩(wěn)定性及能否代替尿素酶B全長(zhǎng)蛋白。采用PCR方法擴(kuò)增目的UreB和LTA2B片段基因，并構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-11c(+)上，轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)UreB-LTA2B融合蛋白。首先，ELISA及免疫印跡分析，證實(shí)重組UreB-LTA2B具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性；其次，純化后的UreB-LTA2B免疫家兔，產(chǎn)生的抗體在體外能夠中和尿素酶活性，表現(xiàn)出與天然HP的UreB相似的生物學(xué)活性；再者，重組UreB-LTA2B口服免疫BalB/c小鼠，能有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生Th1、Th2平衡的免疫應(yīng)答反應(yīng)，與重組UreB(吳超，鄒全明等.幽門螺桿菌UreB與大腸桿菌LTB基因融合及表達(dá)的研究。中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2002，22(2)175-179)一致；最后，小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，UreB-LTA2B的保護(hù)率為88.7％，明顯高于全長(zhǎng)UreB 68％的保護(hù)率。GM1-ELISA試驗(yàn)表明融合UreB-LTA2B無ADP核糖基酶活性，但保留了與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1相結(jié)合的生物學(xué)特性，小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，UreB-LTA2B的保護(hù)率，明顯高于UreB-LTB74.1％和UreB與LTB物理混合組合78.6％的保護(hù)率。首次證實(shí)了UreB-LTA2B具有全長(zhǎng)UreB相似的生物學(xué)活性和免疫原性及反應(yīng)原性，同時(shí)具有增強(qiáng)粘膜佐劑活性的功能。
實(shí)施例3重組工程菌pET-11c-LU/BL21(DE3)的發(fā)酵發(fā)酵工藝如下采用德國(guó)B.Bron 80L發(fā)酵罐，發(fā)酵過程中種子菌10％比例接種；溫度37℃；pH7.0，通過自動(dòng)加入30％氨水使pH值保持恒定；轉(zhuǎn)數(shù)起始設(shè)定為500rpm，隨著菌體密度的增大、耗氧的升高，轉(zhuǎn)數(shù)改為級(jí)聯(lián)溶氧控制，即以PO2控制器為主控制器，攪拌控制器為伺服控制器；溶解氧濃度采用級(jí)聯(lián)控制及負(fù)氧旁路控制，使其終濃度控制在45％-50％；在A600未達(dá)到2時(shí)不加補(bǔ)料，之后每0.5小時(shí)流加補(bǔ)料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次補(bǔ)料后待葡萄糖濃度降為0.1％時(shí)加入IPTG 500μmol/L誘導(dǎo)4小時(shí)收菌；發(fā)酵過程在級(jí)聯(lián)溶氧控制的分批培養(yǎng)基礎(chǔ)上，流加補(bǔ)料。
發(fā)酵過程所用培養(yǎng)基為改良M9-CAA培養(yǎng)基，在M9-CAA的基礎(chǔ)上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/LH3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
發(fā)酵結(jié)束后回收菌液，4℃離心(8000g)15分鐘。吸棄上清，收集細(xì)菌，稱重后凍存?zhèn)溆谩?br> 結(jié)果結(jié)果顯示菌體產(chǎn)量均在75g/L以上。目的蛋白表達(dá)量均穩(wěn)定在30％左右。證明此中試發(fā)酵工藝先進(jìn)，工藝重復(fù)性及穩(wěn)定性均達(dá)了較高水平。
實(shí)施例4重組蛋白LU(LTA2B-UreB)的純化1.包涵體提取將高效表達(dá)的菌體5000g以TE緩沖液1∶10(W/V)比例懸浮，4℃預(yù)冷后采用細(xì)胞勻漿機(jī)使其混合均勻。采用高壓均質(zhì)機(jī)在壓力為40-70Mpa的條件下進(jìn)行破菌(共破菌4～6次)，破菌完畢后，取少量菌液涂片染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞的完整性，確保細(xì)胞破碎完全，隨后以500g離心25分鐘，棄沉淀，再以15,000g離心40分鐘，棄上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分別用洗滌液A和B各洗滌2次。洗滌條件為4℃攪拌20分鐘，15,000g離心40分鐘，收集包涵體沉淀；最后將包涵體用包涵體溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃攪拌3小時(shí)，15,000g離心45分鐘，取上清作為下一步純化的原料。
包涵體提取所用緩沖液1)TE緩沖液20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH8.0；2)包涵體洗滌液A5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.0；3)包涵體洗滌液B20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH 8.0；4)包涵體溶解液1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.0)。
2.層析純化該步純化確定為Q Sepharose HP陰離子交換柱及SephadexG-25柱層析純化，中試純化采用XK50/30柱，在KTA explorer100系統(tǒng)上進(jìn)行純化。由于KTA explorer100系統(tǒng)具有精確的自動(dòng)化操作特點(diǎn)，通過編制程序，采用2套KTA explorer100進(jìn)行連續(xù)自動(dòng)化層析操作，每批rHp疫苗的中試產(chǎn)量可達(dá)40g。使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，采用NaCl梯度洗脫。
3.經(jīng)過Q Sepharose High Performance層析純化的重組蛋白純度達(dá)到80％以上，但有大量的鹽和尿素存在，根據(jù)分子量的差異，故選用分子篩層析方法來脫鹽和去除尿素，使用傳統(tǒng)的分子篩填料Sephadex G-25medium。
4.純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢定其純度最終獲得的目的蛋白純度＞80％，收率＞79％。
5.Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。
其中，步驟1所述采用生產(chǎn)或中試純化中使用的高壓破菌技術(shù)，破菌至細(xì)菌破解率大于98％，差速離心獲得包涵體沉淀物。
步驟2所述親和層析純化填料選自Chelating Sepharose Fast Flow。
步驟3所述陰離子純化填料選自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF和QSepharose XL。
實(shí)施例5口服重組HP疫苗的制備一.重組LU蛋白微球的制備在室溫下，將實(shí)施例4中制備的重組蛋白與2％的海藻酸鈉溶液混勻，加入植物油，植物油與海藻酸鈉AGS乳液的比例為2∶8。8000r/分鐘乳化10分鐘后逐滴滴入到CaCl2溶液中，800r/分鐘攪拌30分鐘后，形成O/W乳液，離心取沉淀物洗滌后重懸。將懸液加入到1％濃度的殼聚糖溶液中，800rpm×30分鐘攪拌完成再包裹制備出殼聚糖-海藻酸鈉包裹重組LU蛋白微球，離心洗滌3次后收集。
將上述微球混懸液緩慢倒入玻璃平皿中，液面高度低于1cm。-40℃冰箱預(yù)凍12小時(shí)后直接置于已預(yù)冷的真空干燥機(jī)內(nèi)干燥，并緩慢提升溫度使水分迅速升華，待氣體壓力指示計(jì)顯示無氣體生成時(shí)取出凍干品待檢。
分別取洗滌離心后MS、凍干粉以及凍干粉復(fù)溶物微量涂于載玻片上，光鏡下觀察其凍干前后微球形態(tài)變化，離心洗滌后的微球大小形態(tài)規(guī)則；凍干后則呈不規(guī)則分布，形態(tài)呈現(xiàn)出桿狀、梭狀以及扁圓狀等諸多不規(guī)則形狀；而用等量蒸餾水復(fù)溶后鏡下可見微球數(shù)量以及形態(tài)基本恢復(fù)凍干前原有特征。應(yīng)用粒徑分布儀進(jìn)行檢測(cè)，參照?qǐng)D4和圖5。所制備MS表面飽滿、大小均一，平均粒徑為3.33μm。
二.重組LU蛋白微球溶液的凍干經(jīng)高度純化的重組LU蛋白，經(jīng)適當(dāng)稀釋配制后，再分裝入凍干瓶進(jìn)行凍干。通過研究獲得了穩(wěn)定成熟的rHp疫苗凍干曲線制品預(yù)凍溫度為-35℃，時(shí)間3小時(shí)；第一次升華溫度為10℃，時(shí)間20小時(shí)；第二次升華溫度為30℃，時(shí)間5小時(shí)，整個(gè)凍干過程共耗時(shí)28小時(shí)。水分含量均＜3％，符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2000年版)二部對(duì)凍干制品水分含量的檢測(cè)要求。
通過較系統(tǒng)的凍干中試工藝研究，確定了rHp疫苗凍干制品的賦形劑為5-8％蔗糖、糊精及葡萄糖，最適pH值為7.0，并獲得了成熟的凍干曲線等參數(shù)。經(jīng)20余批次的反復(fù)驗(yàn)證表明，該中試凍干工藝性能穩(wěn)定，能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求。以每支凍干瓶裝量15mg計(jì)算，40g疫苗蛋白可裝2 600支左右。所采用的5m2凍干機(jī)一次可凍干制備32mm直徑的凍干瓶5 000支左右，能滿足大批量制品凍干的需要。
本發(fā)明還研究了人工胃液對(duì)rHp疫苗穩(wěn)定性的影響。rHp疫苗為口服免疫凍干制劑，在通過消化道到達(dá)靶器官的過程中，必須經(jīng)過胃內(nèi)酸性pH環(huán)境。由于rHp疫苗本身為蛋白質(zhì)物質(zhì)，易受酸作用而變性或酶降解，從而降低其免疫活性。研究發(fā)現(xiàn)，rHp疫苗蛋白在pH值為1和2的人工胃液中其抗原反應(yīng)活性降低明顯，蛋白降解顯著，但在pH 3～7的環(huán)境中能夠保持較高的抗原反應(yīng)性及蛋白穩(wěn)定性。該研究結(jié)果提示，在疫苗使用過程中，可以采取對(duì)胃酸進(jìn)行中和的方法，適當(dāng)提高胃內(nèi)環(huán)境的pH值，以保持rHp疫苗蛋白的生物活性，從而獲得良好的免疫效果。在口服重組疫苗的劑型上，建立了先進(jìn)實(shí)用的抗胃酸、抗胃蛋白酶的多聚微囊包裹制劑工藝，克服了胃酸和胃蛋白酶的破壞，提高了疫苗的有效性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例6服重組HP疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一.動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)LD50測(cè)定組各試驗(yàn)小鼠均未見異常反應(yīng)，無中毒癥狀，無死亡發(fā)生，未測(cè)出LD50，同時(shí)經(jīng)最大耐受劑量試驗(yàn)測(cè)出rHp疫苗口服的最大耐受劑量(MTD)大于150mg/kg(相當(dāng)于推薦人體正常用藥量的600倍)。在腹腔注射三批rHp疫苗后的觀察期內(nèi)，三批豚鼠均健存，未見異常毒性反應(yīng)，至第7天體重均有正常增加。分別進(jìn)行了以下試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果提示rHp疫苗安全性良好。
二.免疫原性研究分別采用家兔、BALB/c小鼠和恒河猴觀察了rHp疫苗的免疫原性。
1.rHp疫苗免疫接種家兔的免疫原性研究將rHp疫苗免疫接種家兔后，經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA檢測(cè)，結(jié)果該疫苗可誘生家兔產(chǎn)生高效價(jià)的抗UreB的抗血清，證實(shí)rHp疫苗蛋白具有良好的免疫原性。
2.rHp疫苗免疫接種沙鼠的免疫原性研究各組沙鼠于末次免疫后10天同時(shí)灌喂制備好的Hp菌液。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提前24小時(shí)斷食、斷水，每次每只灌喂菌液0.3ml，約108cfu/ml(每毫升菌落形成數(shù))；上、下午各一次，間隔6小時(shí)，末次灌喂后2小時(shí)供食水。攻毒后第4周所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均處死并采集標(biāo)本，處死前24小時(shí)斷食水，解剖沙鼠，取出鼠胃，沿胃大彎剖開，用生理鹽水輕輕沖掉胃內(nèi)殘留物，將一半胃粘膜組織涂布Hp培養(yǎng)基，三線法劃線接種，微需氧培養(yǎng)，本觀察免疫后小鼠Hp的定植情況如表1。
表1融合蛋白口服免疫小鼠后攻毒免疫保護(hù)效果


結(jié)果顯示，LU免疫組小鼠的保護(hù)率達(dá)到90％以上。
結(jié)論融合疫苗抗原LU免疫小鼠，與未免疫組相比可產(chǎn)生針對(duì)Hp全菌攻擊有效的保護(hù)作用。
以融合蛋白與三個(gè)亞單位體外混合后肌肉注射免疫已經(jīng)確定Hp感染的BalB/c小鼠模型，每0，2，4周各免疫一次，免疫劑量為100ug(100uL)/只與等體積鋁佐劑混合。末次免疫后4周，處死小鼠，采集不用樣本，以不同實(shí)驗(yàn)方法觀察治療后小鼠帶菌情況。
表2多亞單位蛋白疫苗治療Hp感染小鼠觀察

兩組結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.001。說明疫苗抗原LU或者四個(gè)亞單位抗原體外混合后對(duì)已經(jīng)感染小鼠進(jìn)行免疫治療后可有效減少小鼠帶菌量或者能夠清楚小鼠的感染。多亞單位疫苗抗原包括融合抗原LU對(duì)Hp感染有一定治療作用。
3.rHp疫苗口服免疫恒河猴的實(shí)驗(yàn)研究研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴經(jīng)rHp疫苗口服免疫后，血清中抗UreB IgG抗體和唾液中sIgA抗體水平均有明顯升高，且維持到免疫后15周，表明該疫苗可誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生顯著的系統(tǒng)免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。
為探討疫苗劑量與免疫應(yīng)答水平的關(guān)系，采用了三個(gè)不同的劑量進(jìn)行口服免疫，結(jié)果顯示0.5、2.0mg/kg劑量組誘導(dǎo)的系統(tǒng)及粘膜免疫應(yīng)答水平均明顯高于0.2mg/kg劑量組，而兩個(gè)高劑量組間未見明顯差異，提示該疫苗口服免疫恒河猴的最佳劑量為0.5mg/kg體重。
通過以上家兔、BALB/c小鼠及恒河猴動(dòng)物試驗(yàn)，證實(shí)rHp疫苗可有效誘導(dǎo)機(jī)體的粘膜免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。
實(shí)施例7口服重組HP疫苗的人體實(shí)驗(yàn)為表明本發(fā)明的治療效果，本發(fā)明作了臨床研究。本發(fā)明臨床研究資料如下一.入選標(biāo)準(zhǔn)1.自愿參加。
2.經(jīng)查問病史、體檢和臨床判定健康者。
3.近期無幽門螺桿菌感染史。
4.無同類疫苗接種史。
5.無疫苗接種禁忌癥。
二.療效和安全性判定(一)安全性判定受試者仔服苗后進(jìn)行30分鐘的即時(shí)觀察，并于6、24、48及72小時(shí)詳細(xì)觀察全身(體溫)和局部(胃腸道)反應(yīng)及它異常反應(yīng)的發(fā)生情況(包括發(fā)熱、大便形狀及次數(shù)異常、腹瀉、嘔吐等)。
1.全身(體溫)反應(yīng)無反應(yīng)體溫在37℃及以下；輕度反應(yīng)體溫在37.1℃～37.5℃；中度反應(yīng)體溫在37.6℃～38.5℃；重度反應(yīng)體溫在38.6℃或以上；2.局部(胃腸道)反應(yīng)無反應(yīng)無胃腸道反應(yīng)；輕度反應(yīng)經(jīng)一般處理，胃腸道癥狀消失；
中、重度反應(yīng)需經(jīng)多次處理或住院治療；(二)療效判定以全程免疫后14天抗體狀態(tài)評(píng)價(jià)免疫原性，以全程免疫后60天觀察抗體消長(zhǎng)情況。血清特異性IgG以免疫前＜1∶100而免疫后≥1∶100為陽(yáng)轉(zhuǎn)；血清特異性總Ig、唾液特異性sIgA、糞便特異性sIgA免疫后與免疫前滴度比值≥4倍者為轉(zhuǎn)陽(yáng)。
三.研究方法分I、II期兩個(gè)階段進(jìn)行。I期臨床研究為非對(duì)照研究。II期臨床研究為隨機(jī)、雙盲、對(duì)照研究。
四.研究對(duì)象I期臨床研究受試者對(duì)象共30名，其中男16名，女14名，最大年齡為13歲，最小年齡10歲，平均年齡為11.7歲。II期臨床研究受試者對(duì)象共623名，其分組情況表

五.結(jié)果15mg/次、30mg/次和45mg/次劑量的口服重組幽門螺桿菌疫苗對(duì)人體均具有良好的安全性，其中15mg/次劑量的口服重組幽門螺桿菌疫苗對(duì)人體更具有安全性。
15mg/次、30mg/次和45mg/次劑量的口服重組幽門螺桿菌疫苗對(duì)人體均能刺激人體產(chǎn)生較好的血清特異性IgG抗體、血清特異性總Ig抗體、唾液特異性sIgA抗體、糞便特異性sIgA抗體應(yīng)答，各受試組產(chǎn)生抗體陽(yáng)性率為80％以上，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在全程免疫后兩個(gè)月仍處于較高的水平。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>口服重組幽門螺桿菌疫苗<160>2289<210>1<211>2289<212>DNA<213>E.coli BL21(DE3)LU<220>
<221>gene<222>(1)...(42289)<400>
GCTCC CCAGT CTATT ACAGA ACTAT GTTCG GAATA TCGCA ACACA CAAAT ATATA CGATA AATGACAAGA TACTA TCATA TACGG AATCG ATGGC AGGTA AAAGA GAAAT GGTTA TCATTACATTTAAGAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATGGAAAACTAGACAATTACAGATGATACTTGTAATGAGGAGACCCAGAATCTGAGCACAATATATCTCAGGAAATATCAATCAAAAGTTAAGAGGCAGATATTTTCAGACTATCAGTCAGAGGTTGACATATATAACAGAATTCGGGATGAATTATGAAAAAG ATT AGC AGA AAA GAA TAT GTT TCT ATG TAT GGC CCT ACT ACA GGC GAT AAA GTG AGA TTG GGC GAT ACAGAT TTG ATC GCT GAA GTA GAA CAT GAC TAC ACC ATT TAT GGC GAA GAG CTA AAA TTT GGT GGC GGT AAA ACTTTA AGA GAA GGC ATG AGC CAA TCC AGC AAC CCC AGC AAA GAA GAA CTG GAT TTA ATC ATC ACT AAC GCT TTAATC GTG GAT TAC ACC GGT ATT TAT AAA GCG GAT ATT GGT ATT AAA GAT GGC AAA ATC GCT GGC ATT GGC AAAGGC GGT AAC AAA GAC ATG CAA GAT GGC GTT AAA AAC AAT CTT AGC GTG GGT CCT GCT ACT GAA GCC TTAGCT GGT GAA GGT TTG ATC GTA ACT GCT GGC GGT ATT GAC ACA CAC ATC CAC TTC ATC TCC CCC CAA CAA ATCCCT ACA GCT TTT GCA AGC GGT GTA ACA ACT ATG ATT GGT GGC GGA ACT GGC CCT GCT GAT GGC ACT AAC GCAACC ACT ATC ACT CCA GGC AGA AGA AAT TTA AAA TGG ATG CTC AGA GCG GCT GAA GAA TAT TCT ATG AAC TTAGGT TTC TTA GCT AAA GGT AAC ACT TCT AAC GAT GCG AGC TTA GCC GAT CAA ATT GAA GCC GGT GCG ATT GGTTTT AAA ATC CAC GAA GAC TGG GGA ACA ACT CCT TCT GCA ATC AAC CAT GCG TTA GAT GTT GCG GAC AAA TACGAT GTG CAA GTC GCT ATC CAC ACA GAC ACT TTG AAT GAA GCC GGT TGT GTA GAA GAC ACT ATG GCA GCC ATTGCC GGG CGC ACT ATG CAC ACT TTC CAC ACT GAA GGT GCT GGT GGT GGA CAC GCT CCT GAT ATT ATT AAA GTGGCC GGC GAA CAC AAC ATT CTG CCC GCT TCC ACT AAC CCC ACT ATC CCT TTC ACC GTG AAT ACA GAA GCAGAA CAC ATG GAC ATG CTT ATG GTG TGC CAC CAC TTG GAT AAA AGC ATT AAA GAA GAT GTT CAG TTC GCT GATTCA AGG ATC CGC CCT CAA ACC ATT GCG GCT GAA GAC ACT TTG CAT GAC ATG GGG ATT TTC TCA ATC ACC AGTTCT GAC TCT CAA GCT ATG GGT CGT GTG GGT GAA GTT ATC ACC AGA ACT TGG CAA ACA GCT GAC AAA AAC AAAAAA GAA TTT GGC CGC TTG AAA GAA GAA AAA GGC GAT AAC GAC AAC TTC AGG ATC AAA CGC TAC TTG TCTAAA TAC ACC ATT AAC CCA GCG ATC GCT CAT GGG ATT AGC GAG TAT GTA GGT TCT GTA GAA GTG GGC AAA GTGGCT GAC TTG GTA TTG TGG AGT CCC GCA TTC TTT GGC GTG AAA CCC AAC ATG ATC ATC AAA GGC GGG TTC ATTGCA TTA AGT CAA ATG GGC GAT GCG AAC GCT TCT ATC CCT ACC CCA CAA CCG GTT TAT TAC AGA GAA ATG TTCGCT CAT CAT GGT AAA GCC AAA TAC GAT GCA AAC ATC ACT TTT GTA TCC CAA GCG GCT TAT GAC AAA GGC ATTAAA GAA GAA TTA GGG CTT GAA AGA CAA GTG TTG CCG GTA AAA AAT TGC AGA AAC ATC ACT AAA AAA GACATG CAA TTC AAC GAC ACT ACC GCT CAC ATT GAA GTC AAT CCT GAA ACT TAC CAT GTG TTC GTG GAT GGC AAAGAA GTA ACT TCT AAA CCA GCC ACT AAA GTG AGC TTG GCA CAA CTC TTT AGC ATT TTC TAG
<160>729<210>1<211>729<212>PRT<213>E.coli BL21(DE3)LU<220>
<221>CDS<222>(1)…(729)<400>
MAPQSITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMENTITGDTCNEETQNLSTIYLRKYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRDELYPQDPISMKKISRKEYVSMYGPTTGDKVRLGDTDLIAEVEHDYTIYGEELKFGGGKTLREGMSQSSNPSKEELDLIITNALIVDYTGIYKADIGIKDGKIAGIGKGGNKDMQDGVKNNLSVGPATEALAGEGLIVTAGGIDTHIHFISPQQIPTAFASGVTTMIGGGTGPADGTNATTITPGRRNLKWMLRAAEEYSMNLGFLAKGNTSNDASLADQIEAGAIGFKIHEDWGTTPSAINHALDVADKYDVQVAIHTDTLNEAGCVEDTMAAIAGRTMHTFHTEGAGGGHAPDIIKVAGEHNILPASTNPTIPFTVNTEAEHMDMLMVCHHLDKSIKEDVQFADSRIRPQTIAAEDTLHDMGIFSITSSDSQAMGRVGEVITRTWQTADKNKKEFGRLKEEKGDNDNFRIKRYLSKYTINPAIAHGISEYVGSVEVGKVADLVLWSPAFFGVKPNMIIKGGFIALSQMGDANASIPTPQPVYYREMFAHHGKAKYDANITFVSQAAYDKGIKEELGLERQVLPVKNCRNITKKDMQFNDTTAHIEVNPETYHVFVDGKEVTSKPATKVSLAQLFSIF*<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>合成的引物序列P3<400>5tac cct cag gat ccg ata tca atg aaa aag att agc ag<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的引物序列P4<400>6cat atg cta gaa aat gct aaa gag ttg tgc caa gc
權(quán)利要求
1.一種以腸產(chǎn)毒性大腸桿菌LT的A2亞單位與B亞單位融合成的LTA2B作為粘膜免疫佐劑、以尿素酶B亞單位為免疫原的重組幽門螺桿菌疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其中所述的疫苗為口服免疫凍干制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的的重組疫苗，其中所述的疫苗凍干制品的賦形劑為8％甘露醇，穩(wěn)定劑為0.05％EDTA-Na2，最適pH值為10.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的重組疫苗，其中所述的疫苗制備過程中選用可降解的緩釋微球包裹重組融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的重組疫苗，其中所述的疫苗的包裹制劑由海藻酸鈉、植物油、CaCl2和殼聚糖組成。
6.一種制備口服重組幽門螺桿菌疫苗疫的方法，其包括以下步驟(1)分別克隆幽門螺桿菌尿素酶B亞單位UreB和產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素LTA2B的編碼核苷酸序列，或與其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的編碼核苷酸序列；(2)采用重疊PCR的方法，將步驟(1)中克隆得到的核苷酸序列連接成融合基因lu(ltA2B-ureB)；(3)將lu融合基因構(gòu)建到載體上，轉(zhuǎn)化宿主，表達(dá)重組蛋白LU(LTA2B-UreB)；(4)分離純化由步驟(3)得到的重組蛋白；(5)將上述步驟(4)中所得蛋白制成包裹緩釋物質(zhì)的微球劑凍干品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防人幽門螺桿菌感染的重組幽門螺桿菌粘膜疫苗及疫苗的制備方法，該疫苗主要由腸產(chǎn)毒性大腸桿菌LT的A2亞單位與B亞單位融合成的LTA2B和尿素酶B亞單位構(gòu)成。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1927394SQ20061009509
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者鄒全明, 童文德, 毛旭虎, 郭剛, 魯東水, 吳超, 曾浩, 王毅超, 楊珺, 張衛(wèi)軍, 劉開云, 羅萍 申請(qǐng)人:重慶康衛(wèi)生物科技有限公司