細胞培養容器、細胞培養容器的制造方法以及培養細胞的制作方法

專利名稱：細胞培養容器、細胞培養容器的制造方法以及培養細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及到細胞剝離特性優良的細胞培養容器、該細胞培養容器的制造方法以及通過該細胞培養容器培養的培養細胞。
背景技術：
近些年來，用于醫療目的的細胞培養技術不斷進步，并已實際應用于皮膚移植等領域。另外，并未停留在從少量細胞向皮膚等組織的移植，面向角膜、牙齒、骨骼、臟器等復雜器官的自體移植及異體移植的培養技術也取得了進步。
在細胞培養中需使用玻璃或樹脂制成的培養皿等容器。例如，公開了下面所述的培養皿。利用移液器將規定濃度的膠原溶液注入到培養容器中，使之形成表面，涂布后，干燥15分鐘～72小時。或者，將規定濃度的膠原溶液涂布于硅膜等具有伸縮性的培養基材上，在15～42℃的孵箱中進行20～120分鐘的聚合，之后將所述硅膜等具有伸縮性的培養基材放置在UV燈下15分鐘～72小時，待膠原干燥之后再用磷酸緩沖液潤濕，之后通過使之伸展10～40％并固定等方法制成細胞培養用器皿(參見專利文獻1)。
根據上述第1種方法，雖然可以在與細胞具有親和性的膠原上進行細胞培養。但存在的問題是由于細胞與培養容器的附著力較強，因此，難以剝離細胞。對于這種附著力，如果以機械方式剝離細胞，則會對細胞造成物理性損傷，如果用胰蛋白酶等酶進行化學處理，則會破壞細胞表面的膜蛋白質，從而降低移植后的細胞向組織的固著率。
發明人等在以下的專利文獻中披露了解決上述問題的細胞培養容器。使用的方法為通過在設有能夠控制形狀的有機聚合物制成的柱狀微小突起群的功能性基板上進行細胞培養，易于將培養液分配至細胞下部，并且，可改善細胞的剝離性(參見專利文獻2)。
上述第2種方法通過減少細胞與培養容器表面接觸的部位來降低表面附著力，由此來解決剝離問題。但是，其存在的問題為在使用此方法時，在片材的端部、或放置有功能性基板的器皿的底面上未設置機能性基板之處也會吸附細胞，因此會降低細胞的培養效率。此外，存在的問題還有當在微小突起的上面培養的細胞表現出與在通常的培養容器中培養時不同的性狀時，在這種微小突起的上面培養的細胞與在沒有微小突起的平滑部上培養的細胞混合在一起了。
特開2002-142751號公報(實施例A)[專利文獻2]特開2004-170935號公報(實施例5)發明內容發明所要解決的的問題本發明的目的在于提供細胞培養容器，其能夠通過簡單的結構防止剝離時對細胞的損傷，促進營養物質的輸送及舊廢物的排出，同時，能夠提高這種結構實現的培養效率的改善效果。
用于解決問題的手段為了解決上述課題，本發明首先提供了一種細胞培養容器，該容器的特征在于形成具有等效直徑比在培養容器中培養的細胞小的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁，培養面側壁的各個部位與其附近的培養面上的突起物的間隔小于培養細胞的直徑。由于細胞培養容器的培養面端部附近無未形成突起物的部位，因此，能夠更有效地發揮突起物賦予培養細胞的效果。在這里之所以使用“等效直徑”這一術語，是因為突起物的剖面并不一定是圓形，也可能是橢圓形、多邊形、非對稱形等形狀，為了包含所有這些形狀，在本發明中使用了等效直徑。在本發明中，等效直徑指突起物底面上剖面的直徑。
不能忽視對容器粘附力較強的細胞系對培養面側壁的吸附。另外，存在在這樣的側壁上培養的細胞不喜歡混合到培養面上的細胞系。對于這種細胞系而言，最好在培養面側壁上也設置與培養面相同的突起物，但是在這樣做有困難的情況下，也可以通過表面結構或材質使培養面側壁具有細胞非接合性。此外，可以通過在具有微小突起物的培養面與培養面側壁之間形成圍繞培養面且比培養面低的緩沖面，由此可以防止吸附于培養面側壁上的細胞移動并移動至具有突起物的培養面。即使在這種情況下，仍可以通過使培養面的微小突起物中離緩沖面最近的微小突起物與培養面端部間的距離小于培養細胞的直徑，從而能夠更有效地發揮在培養面上突起物賦予培養細胞的效果。
為了遍布培養液，可以對細胞培養容器的培養面表面進行親水處理，以促進培養液的流動。但是，根據培養的細胞種類，必須對容器表面進行疏水處理，或用金屬或蛋白質等覆蓋容器表面。因此，本發明可以僅對形成于細胞培養容器的微小突起物與細胞接觸的前端部實施細胞培養必需的疏水處理，或者金屬包被、蛋白質包被等細胞培養所必需的處理。
此外，在對培養的細胞要求取向性等特定形狀時，可根據培養細胞的形狀對細胞培養容器底面的一部分進行疏水處理等特定處理。在本發明中，可在容器表面有選擇地對細胞培養容器表面微小突起物的前端部進行疏水處理或金屬包被、蛋白質包被等細胞培養所必需的處理。
發明效果通過采用本發明，可防止剝離時對細胞的損傷，促進營養物質的輸送及舊廢物質的排出，同時，通過設置這些突起物能夠獲得進一步提高培養效率的改善效果。此外，還具有防止在未設置突起物的部位培養的細胞與突起物上的細胞混合的效果。


圖1為模式圖，其顯示了本發明的細胞培養容器的一個例子的鳥瞰圖。
圖2為模式圖，其顯示了本發明的細胞培養容器的一個例子的剖面圖。
圖3為模式圖，其顯示了本發明中細胞培養容器的另一個例子的鳥瞰圖。
圖4為模式圖，其顯示了本發明中細胞培養容器的另一個例子的剖面圖。
圖5為模式圖，其顯示了本發明中細胞培養容器的第三個例子的鳥瞰圖。
圖6為模式圖，其顯示了本發明中細胞培養容器的第三個例子的剖面圖。
圖7為顯示本發明中細胞培養容器的制造工序的模式圖。
圖8為顯示本發明中另外的細胞培養容器的制造工序的模式圖。
圖9為顯示本發明中第三種細胞培養容器的制造工序的模式圖。
圖10為顯示本發明中細胞培養容器的使用方法的模式圖。
圖11為模式圖，其顯示了在培養面沒有突起物的區域的細胞培養容器中的細胞培養。
圖12為顯示本發明中突起物的掃描電子顯微鏡照片的模式圖。
圖13為顯示實施例1中模具的制造工序的模式圖。
圖14為模式圖，其顯示了實施例2中培養面側壁的鳥瞰圖。
圖15為模式圖，其顯示了實施例2中培養面側壁的制造工序。
圖16為模式圖，其顯示了實施例4中細胞培養容器的鳥瞰圖。
圖17為模式圖，其顯示了實施例4中突起物的掃描電子顯微鏡照片。
符號說明100細胞培養容器101突起物102培養面103培養面側壁104緩沖面105容器原料106、117模具107培養液108細胞109附著于平坦部的細胞110培養面基底111第一模具原型部件112第二模具原型部件113模具原型114復制材料115模具復制品116鎳板
具體實施例方式
下面，參照附圖對本發明的細胞培養容器進行詳細說明。
圖1是表示本發明中細胞培養容器100的第一形式的鳥瞰圖。在裝入細胞及其培養液的細胞培養容器100的培養面102上形成等效直徑小于培養細胞的突起物101。這些突起物101的等效直徑優選在10nm以上，10μm以下，高度優選在10nm以上、1mm以下，另外，為了減少與細胞的接觸面積，將其設定為遠小于細胞直徑，例如細胞直徑的1/5以下。突起物101相互之間的間隔也必須為小于細胞直徑的值。換句話說，使突起物的剖面面積小于細胞的剖面面積，形成在細胞剖面內布置多個突起的形狀。此外，由于必須使培養液充分浸透到突起物101的下部，因此，這些突起物101的高度要足夠高，例如為等效直徑以上，最好是等效直徑的5倍以上。但是，從結構強度來考慮，最好在100倍以下。雖然一個細胞培養容器100可以只有一個培養面102，但也可以如圖1所示，通過培養面側壁103將其分隔為2個以上，從而利用一個細胞培養容器100就可在多種條件下培養細胞。
圖2(a)為概念圖，其顯示了本發明中細胞培養容器100的第一形式中圖1所示的AB之間的剖面圖。圖2(b)為重點表示圖2(a)的培養面102與培養面側壁103之間邊界部的概念圖。突起物101一直延伸到培養面側壁103附近，突起物101實際上全面覆蓋了培養面102。將位于培養面側壁103與培養面102的邊界線處的任意位置與最近的突起物101之間的距離I設計為小于培養細胞的等效直徑。含有突起物101的培養面102與培養面側壁103形成一體，并由相同的材料形成。如果在培養面側壁103也形成突起物101，則能夠更有效地發揮突起物101的效果，因此是最優選的，但在加工困難的情況下，可以采用比培養面102更不易使細胞吸附的其它表面結構，或者實施具有細胞非粘附性的表面處理。培養面側壁103的高度優選能夠保持培養液不從培養面102的表面溢出的高度。雖然這一高度可根據培養面102的面積及形狀、親水性及分布在培養面102上的培養液的量選擇最佳值，但是，培養面側壁103距離培養面102的高度h優選在0.05mm以上、100mm以下。此外，該培養面側壁103優選高于培養面102上的突起物101，更優選設定為突起物101高度的10倍以上。雖然該高度取決于培養面102的形狀，但是，高度的下限取決于能否在具有突起物101的培養面102上保持適量的培養液，高度的上限取決于對培養液或細胞的操作性。此外，由于培養面側壁103相對于培養面102的傾斜角度e會妨礙培養液的保持和細胞在培養面側壁103上的附著，因此，優選45度以上。另外，也可根據需要形成具有多個臺階的階梯狀培養面側壁103，以便于在培養面側壁103上形成表面結構。
圖3是顯示本發明中細胞培養容器100的第二種形式的鳥瞰圖。雖然培養面102上的突起物101的形狀與第一種形式相同，但是，培養面側壁103由細胞附著性低于培養面102的材料形成，并連接至培養面102上。培養面側壁103與培養面102之間的接合采用可在不損傷突起物101的情況下可拆卸的結構，從而易于例如培養后的觀察操作。
圖4為概念圖，其顯示了本發明的細胞培養容器100的第二種形式中圖1所示的AB之間剖面圖。與第一種形式相同，形成突起物101直至培養面側壁103附近，并且，突起物101實質上覆蓋了培養面102的整個表面。將位于培養面側壁103與培養面102的邊界線處的任意位置與最近的突起物101之間的距離I設計為小于所培養細胞的等效直徑。
圖5為顯示本發明中細胞培養容器100的第三種形式的鳥瞰圖。培養面102上的突起物101的形狀與第一、第二種形式相同，在培養面102與培養面側壁103之間圍繞培養面102設置位置比培養面102低的緩沖面104。這樣，即使細胞吸附于培養面側壁103上，通過形成該緩沖面104，仍能夠防止吸附于培養面側壁103上的細胞移動到培養面102上。
圖6為概念圖，其顯示了本發明中細胞培養容器100的第三種形式中圖1所示的AB之間的剖面。突起物101形成至緩沖面104附近，突起物101實質上全面覆蓋了培養面102。將培養面102的緩沖面104側的端部的各部位與其最近的突起物101之間的距離I設計為所培養細胞的等效直徑以下。緩沖面104最好具有阻止移動到其上的細胞進一步向培養面102移動的深度。雖然該深度因細胞種類及培養條件而不同，但是，距離培養面102的高度應在0.01mm以上，為了形成可使培養液浸透培養面102的結構，定為小于培養面側壁103的高度的值。另外，為了阻止細胞向培養面102移動，緩沖面的寬度(從培養面側壁至培養面端部的距離)d最好大于培養細胞的等效直徑。
本發明中細胞培養容器100的材料雖沒有特殊限制，但可根據所需的加工精度、表面特性、光學特性、強度等進行選擇。具體來說，可以采用聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯醇、聚偏氯乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、ABS樹脂、AS樹脂、丙烯酸樹脂、聚酰胺、聚縮醛、聚對苯二甲酸丁二醇酯、玻璃強化聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、改性聚苯醚、聚苯硫醚、聚醚醚酮、液晶聚合物、氟樹脂、聚芳酯、聚砜、聚醚砜、聚酰胺酰亞胺、聚醚酰亞胺、熱塑性聚酰亞胺等熱塑性樹脂、或酚醛樹脂、蜜胺樹脂、尿素樹脂、環氧樹脂、不飽和聚酯樹脂、醇酸樹脂、硅樹脂、鄰苯二甲酸二烯丙酯樹脂、聚酰胺二馬來酰亞胺、聚二酰胺三氮雜茂等熱固性樹脂、以及混合了上述二種以上的材料。此外，也可以使用玻璃類等無機物。由于細胞培養容器100的材料一般要求對細胞具有親和性，因此，必須根據培養的細胞確認親和性來選擇。另外，為了易于進行培養的評價，在細胞培養容器100中最好使用對于觀察時所用波長的光是透明的且實質上不會產生該波長的熒光的材料。此外，例如，除了聚乳酸、聚己內酯等脂肪族聚酯或多酸酐、合成多肽等合成系以外，通過使用殼聚糖或纖維素等天然物系等生物降解性樹脂，可以構成在培養后能夠易于生物降解細胞培養容器100。
本發明中突起物101的材料雖沒有特殊限制，但可根據所需的加工精度、表面特性、光學特性、強度等選擇上述樹脂組合物、或玻璃類等無機物。優選這些突起群與培養面102形成一體。
圖7顯示了形成本發明中細胞培養容器100的第一種形式的方法。圖7顯示了通過所謂納米壓印法(nanoimprint)形成細胞培養容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養面102及培養面側壁103形狀的模具106按壓在該容器原料105上，以此方式將模具106的形狀轉印至容器原料105上，從而獲得具有突起物101、培養面102、及培養面側壁103的細胞培養容器100。
圖8顯示了形成本發明中細胞培養容器100的第二種形式的方法。圖8顯示了通過所謂納米壓印法形成細胞培養容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養面102的模具106按壓在該容器原料105上，由此將模具106的形狀轉印到容器原料105上。之后，通過使另外形成的培養面側壁103與培養面102接合，從而能夠獲得細胞培養容器100。
圖9顯示了形成本發明中細胞培養容器100的第三種形式的方法。圖9顯示了使用所謂納米壓印法形成細胞培養容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養面102、培養面側壁103及緩沖面104的形狀的模具106按壓在該容器原料105上，由此將模具106的形狀轉印到容器原料105上，從而能夠獲得具有突起物101、培養面102、培養面側壁103及緩沖面104的細胞培養容器100。
此外，在上述第一至第三種形式的形成方法中，也可采用高縱橫比納米壓印法，該方法在將模具106按壓在容器原料105上后，使模具106從容器原料105上剝離時，通過使在模具106中與突起物101相當的形狀內填充的容器原料105延伸，從而能夠形成縱橫比高于模具106上形狀的突起物101。通過該方法，可以方便地形成高縱橫比的圖案。
以上在各個細胞培養容器100的形成中所用的模具106要求在表面形成與細胞培養容器100上的突起物101相當的形狀，即等效直徑在10nm以上且10μm以下、高度在10nm以上且1mm以下的形狀。因此，模具至少含有金屬、碳或硅等無機物、及樹脂組合物的一種，其表面形狀通過光刻法、電子束直接描繪法、粒子束加工法、掃描微探針加工法等微加工法或微粒子的自身組織化或由這些方法形成的主模板(マスタ)、通過納米壓印法、噴射成型法、無電解電鍍法等進行形狀轉印來形成。此外，與突起物101的微小形狀相比，規定培養面側壁103的形狀為宏觀尺寸的形狀，若在形成這種形狀時并用機械加工及使多個模具接合等方法，則可形成高精度的模具106。此外，通過在規定宏觀尺寸的方法中組合焦點深度大的光刻法、激光加工法或微粒子的本身組織化法等方法，能夠對培養面側壁103實施微細加工，從而使其具有細胞非附著性。在圖7～圖9中，形成突起物101的方法雖采用了將模具106壓在軟化后的容器原料105上的所謂納米壓印法，但是，除此之外也可使用以噴射成型法為代表的樹脂成型法、或者通過不用模具的激光加工法等直接進行加工。
在本發明中，細胞培養容器根據需要，實施通過浸入含有過氧化氫或臭氧等氧化劑的溶劑或紫外線照射、等離子處理等氣相處理進行親水處理，或者通過浸入溶液形成的多聚賴氨酸、白蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、層粘連蛋白等蛋白質包被，或者通過電鍍、氣相蒸鍍法形成的金屬包被，通過光或電子束、粒子束等進行一項以上的表面改性，并實施細胞培養所必需的表面處理。此外，也可使用由硅橡膠或樹脂膜、金屬薄膜等彈性體形成的壓模或部分分配法進行加熱，或用含有樹脂膠、硅潤滑脂、氟系包被劑等疏水劑或蛋白質的溶劑進行部分涂布，根據需要進行表面內的分布，例如僅在突起物101的前端部或培養面側壁103進行表面處理。
與前面所述的培養面102不同，圖3、圖4、圖8中使用的培養面側壁103是通過機械加工、成型加工等形成的。其材料可從前面所述的細胞培養容器100使用的材料中選擇。此處，若利用與培養面102相同的材料形成培養面側壁103，則能夠形成接合后的形狀保持和接合強度優良的結構，其外觀為如圖1所示的結構。在所述培養面側壁103與培養面102的接合時，除使用由精度高的加熱加壓或振動熔接、紅外線激光熔接等形成的熱接合以外，還可使用粘合劑。但是，在熱接合時，必須選擇不會使培養面102上的突起物101表現出超過允許范圍的變形的條件，在使用粘合劑接合時，必須選擇粘合劑不會蔓延到培養面102表面，另外，固化后細胞不會吸附于表面且溶出物對細胞沒有毒性的條件。此外，如果使用以PDMS(聚二甲基硅氧烷)樹脂為代表的具有彈性且與細胞培養容器100的粘附性很高的材料形成培養面側壁103，則只要將培養面側壁103與細胞培養容器100貼緊就可獲得足夠的粘結強度。若通過這種結構形成培養面側壁103，則可以在不損傷突起物101和其上培養的細胞的前提下，取下培養面側壁103，從而易于進行例如培養后的觀察操作。此外，為了減小培養面側壁103與培養面102表面的突起物101之間的距離，必須預先精確地使形成突起物101的位置與培養面側壁103的形狀或位置吻合。因此，如圖8(d)所示，可以使形成突起物101的范圍大于培養面102，在接合時通過培養面側壁103僅將培養面側壁103正下方的突起物101壓下，或者用培養面側壁103的下部將突起物101覆蓋，從而可減小培養面102中剩余的突起物101與培養面側壁103之間的距離。
本發明中細胞培養容器100雖具有二個以上的多個培養面102，但使用時也可將細胞培養容器100的培養面102單獨拆分以便在其它培養場所或其它的培養時使用。而且，還可將細胞培養容器100的一部分中妨礙培養的部分切斷除去。在進行這種切斷的情況下，通過預先在細胞培養容器100中加設有助于切斷的結構，例如切開線或能夠彎折切斷的切割線、切口，就能容易地進行切斷。
本發明中細胞培養容器100在制造后必須將其運送至實際培養細胞的場所。此時，必須防止從外界混入塵土、細菌等異物。因此，必須使用將細胞培養容器100整體裝入袋中并通過熱封等封閉入口或通過貼膜密封等方法使培養面102與外界隔離以便僅使培養面102及培養面側壁103中培養時與培養液接觸的部分封閉的包裝工序。為了在包裝后殺滅殘留于培養面102上的微生物，最好進行滅菌處理。雖然代表性的滅菌處理方法是使用高溫蒸汽的高壓滅菌法，但其存在因細胞培養容器100的材料或突起物101形狀而由高溫蒸汽引發變形、變質的可能性。因此，滅菌處理最好采用以低于構成細胞培養容器的材料的玻璃化轉變點的溫度實施的UV照射或環氧乙烷氣體滅菌、伽馬射線滅菌等方法。當然，在采用耐熱樹脂或玻璃類的情況下，則可以使用高壓滅菌法。滅菌處理一般是在包裝后進行的，但可根據滅菌處理的方法決定是否需要選擇可透過蒸汽的包裝，并且需要在包裝上設置滅菌處理前后會發生變化的指示物以區分是否進行了滅菌處理。
圖10顯示了本發明中細胞培養容器100的使用方法。將培養液107注滿培養面102，在突起物101上布置細胞108。之后，通過一般方法培養細胞108。在本發明的細胞培養容器100中，由于細胞108與培養面102的接觸是通過突起物101形成點接觸的，因此，可防止細胞108剝離時產生損傷。此外，還可通過培養的細胞108改變突起物101的形狀或對突起物101的表面處理，以便在剝離時不產生損傷地形成品質優良的培養細胞。此外，在本發明的細胞培養容器100中，由于突起物101實際上全面覆蓋了培養面102，因此，在圖11所示的端部存在于平面部的細胞培養容器100中附著于培養面102的平坦部上的細胞109是不存在的，因此，可有效發揮突起物101對細胞培養的改善效果。此外，通過實質上消除細胞108附著于培養面102上的平坦部區域，并且根據需要形成阻礙細胞108吸附于培養面側壁103上、或即使吸附，也可防止吸附于該部位的細胞108轉移到培養面102上的結構，由此能夠獲得在突起物101對細胞108具有特殊影響時，防止混合在未形成突起物101的部位培養的細胞108的效果。細胞108的概念也包含以培養組織、器官為代表的組織化培養細胞。
如圖10所示，在本發明中細胞培養容器100在培養面102處設有培養液107和細胞108的狀態下，根據常規方法，通常是置于恒溫恒濕的培養箱中培養，并根據需要進行培養液107的更換、細胞108的取出、添加試劑、振蕩操作、顯微鏡觀察等操作，有時還需在用冷凍機進行冷凍操作的單元操作間、進行操作的裝置之間移動。在進行這些操作和移動時，要防止細胞培養容器100彎曲變形而使培養液107、細胞108偏斜、或從培養面102泄漏，因此，細胞培養容器100最好整體具有足夠的剛性。例如，至少細胞培養容器100的周邊部位或培養面102之外的部分區域采用厚度大于0.5mm的剛性結構。此外，為了減輕構成培養面102的部件中的吸光或螢光，促進來自外部的溫度傳導，培養面102可以設計為比周邊部位薄。為了獲得更輕的高剛性的結構，通過在細胞培養容器100的端部等處進行彎折而形成增加強度的區域，或者使培養面側壁103相對于培養面102的反向側為中空結構，從而能夠除去不影響強度及操作性的部位。此外，如果細胞培養容器100單獨個體不具有足夠的強度時，可以在細胞培養容器100中形成培養面102之后，在細胞培養容器100安裝其它具有剛性的部件，由此賦予剛性。
下面，通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1下面對本發明的一個實施例進行說明。圖12為通過本實施例制成的培養面102的掃描型電子顯微鏡照片的模式圖。在培養面102中形成多個突起物101。突起物101的材料為聚苯乙烯，其分子量為2000至384萬，分子量的上限還可擴展到600萬。
突起物101是底面直徑為500nm、高度為1μm的圓柱形狀。高度與一邊之比為2，可知大于1。突起物101的間隔為1μm，這個值為小于通常細胞直徑的值。此外，突起物101的排列法為圖12所示的2維正方形排列。
突起物101前端部的直徑為400nm，小于底面部，可知呈末端張開形狀。在本實施例中，突起物101的形狀雖然是從底部向前端部逐漸變細的形狀，但是，其它例如不存在變細部分的柱形形狀或者從底部向前端部逐漸變細并在前端部又變粗的蘑菇形狀，均能獲得突起物101的功能。
突起物101與培養面基底110一樣也由聚苯乙烯制成，兩者連接形成一體。
由于突起物101的前端部比突起物101的底面部細并呈末端張開形狀，因此，能夠獲得突起物101難以從培養面基底110脫落的效果。而且，由于突起物101與培養面基底110的材料相同，并且，兩者形成一體，因此，能夠進一步加強不會從基板上脫落的效果。
在本實施例中，雖然突起物101與培養面基底110的材料使用了聚苯乙烯，但是，也可根據培養細胞種類、細胞培養容器100的使用方法，在前面列舉的可作為細胞培養容器100的材料中進行選擇。在后面所述的制造方法中，通過根據不同的材料改變條件，從而能夠經過同樣的工序進行制造。
圖1是由本實施例制成的細胞培養容器100的模式圖。細胞培養容器100全體均采用了前面所述分子量的聚苯乙烯材料，并且，具有具有突起物101的培養面102和培養面側壁103。培養面102為一片邊長1cm的正方形，培養面側壁103圍繞培養面102大致垂直豎立，其高度為0.7mm。此外，細胞培養容器100在中央部形成了二個培養面102，相互之間相隔5mm的距離。
上述細胞培養容器100利用下述方法制備。圖7是本實施例中細胞培養容器100的制備工序。在本方法中，通過納米壓印法形成細胞培養容器100。先將所述的聚苯乙烯制成的容器原料105(20mm×40mm、厚1mm)加熱至150℃并使其軟化。以4MPa的沖壓壓力、180s的時間，將形成限定突起物101、培養面102及培養面側壁103的形狀的鎳制模具106壓在軟化的容器原料105上。之后，在不解除加壓壓力的情況下冷卻到35℃后，取出模具106和容器原料105，從容器原料105上垂直地提起模具106，從而使其剝離，從而獲得具有突起物101、培養面102及培養面側壁103的細胞培養容器100。
模具106的制造方法如圖13所示。圖13(a)所示的第一模具原型部件111是具有限定突起物101、培養面102及培養面側壁103形狀的結晶方位(100)為1cm方形的雙面研磨硅晶片，第二模具原型部件112是限定培養面側壁103的最上部和其他區域形狀的20mm×40mm平滑的陽極接合用玻璃板。通過光刻法在第一模具原型部件111上形成與上述細胞培養容器100上的突起物101相當的微細凹凸形狀，通過刻模機從直徑為200mm的硅晶片以規定的尺寸切出后進行洗滌。之后，如圖12(b)所示，通過陽極接合法(400℃，1kV)將第一模具原型部件111與第二模具原型部件112接合，以形成模具原型113。這時，通過第一模具原型部件111的高度確定培養面側壁103的高度，但該高度可通過在第一模具原型部件111與第二模具原型部件112之間設置規定的隔板等方法改變。此外，如果在第二模具原型部件112中預先形成限定了培養面側壁的至少一部分形狀的形狀，則能以更大的范圍調整高度。根據這些隔板和各模具原型部件的材料、接合界面的平滑度及形狀，模具原型部件的接合法除了陽極接合法之外，還可從形成金屬系、無機系或有機系粘結層的方法、熔接法等方法中選擇，由此能夠提高加工精度。用氟系樹脂脫模劑對模具原型113施予脫模處理之后，如圖13(c)所示，以150℃、10MPa，在20mm×40mm、厚2mm的聚苯乙烯制復制材料114上加壓，在冷卻到25℃之后，將模具原型113剝離，由此形成模具復制品115。用無電解電鍍法在模具復制品115上形成一層鎳薄膜之后，再用電解電鍍法將鎳薄膜增加到3mm的厚度，從而形成模具106。之后，還要在模具106上含有規定突起物101、培養面102及培養面側壁103的部位的區域實施所定的氟系樹脂脫模處理。
除了上述電鍍法之外，也可使用復制成型中使用的納米轉印法或鑄造法，形成使用了耐熱性和強度均優良的樹脂的模具106，由于后者的形成工序比電鍍法更為簡單，因此，更為理想。此外，在形成少量試驗品的情況下，也可將模具原型113直接用作模具106。
在本實施例中，可通過在模具106中，在培養面102與培養面側壁103之間加設與圍繞培養面102設置的低于培養面102的緩沖面104的形狀，形成前面所述本發明的第三種形式所示的結構。
本發明中，雖然材料采用了厚度為1mm的聚苯乙烯制成的容器原料105，但是，厚度必須根據所要求的培養面102的面積及培養面側壁103的高度選擇最合適的厚度。例如，在對于具有大于本實施例中培養面102的培養面102的細胞培養容器100中，為了保證操作時容器整體的剛性，細胞培養容器100的周邊部或培養面的厚度必須在0.5mm以上。但是，考慮到節省細胞培養容器100整體所占的空間及操作性，容器原料105的厚度必須在兼顧上述剛性的前提下選擇最佳值。此外，在培養面102是與廣泛應用的微孔板一樣的互相分離的直徑16mm的圓形(相當于24孔微孔板)、直徑8mm的圓形(相當于96孔微孔板)、直徑4mm的圓形(相當于384孔微孔板)、直徑2mm的圓形(相當于1536孔微孔板)等時，則培養面102的厚度、培養面側壁103的厚度可以為小于0.5mm的值。但是，這些微孔板也必須保持作為容器整體的剛性，因此，例如優選要在微孔板的邊緣或多個培養面102之間的區域中設置至少厚度為0.5mm以上的區域。為了賦予這種剛性，在胞培養容器100上形成培養面102之后，另外安裝外框或底板等加強部件。特別是當以微孔板形狀形成細胞培養容器100時，各培養面102中培養面側壁103的高度大多為1cm左右，但是，該高度可以根據培養面102的面積改變。特別是在減小培養面102的面積以與上述384孔微孔板或1536孔微孔板相當時，只需要1～100μl左右的必需培養液，因此，培養面側壁103的高度可以取更小的值。
雖然為了防止培養液在培養面102中沉淀，培養面102的形狀最優選是圓形，但為了使模具106上的第一模具原型部件111的刻模工序更容易，因此，在本實施例中培養面102的形狀為正方形。除此之外，根據培養方法和制造方法、培養面102在細胞培養容器100上的布置，培養面102的形狀也可采用橢圓形或多邊形等形狀，但形狀沒有特殊限制。培養面102的大小、深度以及培養面102在一個細胞培養容器100上的數量可根據培養的細胞系、培養用途來選擇最佳值。例如，雖然在采用細胞培養容器100作為用于獲得較大培養組織或相同條件下的大量培養細胞的制備手段時，可以加大培養面102，但是，若在以試驗方式、在多種條件下進行分析培養時，培養面102較小，從而具有如微孔板那樣的形狀，該形狀在一個細胞培養容器100內具有相互分離的許多培養面102，因為用于培養的試劑和細胞數量少，因此優選。此外，可以根據培養的用途，在每個分離的區域中改變培養面102的突起物101的表面處理，前端部的形狀或直徑、高度等形狀或布置，從而可以測試由在相同條件下培養相同種類細胞時的突起物101的形狀、布置引起的培養細胞的狀態變化，或可以形成在培養不同類型的細胞時，最適于每一細胞種類的突起物101的圖形。此外，通過在各個培養面102中改變面內的突起物101的形狀或布置，僅用一個培養面102就能測試培養細胞的狀態變化，從而可用于如探索最適合該培養細胞的突起物101的圖形那樣的用途。
下面，對本發明的另一個實施例進行說明。圖2為由本實施例制成的細胞培養容器100的模式圖。細胞培養容器100中具有突起物101的培養面102采用了與實施例1分子量相同的聚苯乙烯，培養面側壁103由形狀如圖14所示的高0.7mm的PDMS(聚二甲基硅氧烷、ダウ·コ一ニング公司)形成。培養面102為一片邊長0.9cm的正方形，培養面側壁103圍繞培養面102大致垂直豎立。此外，在細胞培養容器100的中央部形成兩處培養面102，它們相互之間相隔5mm。在培養面102上形成的突起物101是底面直徑為500nm、高度為1μm的圓柱形狀，其結構與實施例1完全相同。
上述細胞培養容器100由以下所述的方法制成。圖8為本實施例中細胞培養容器100的制造工序。先將所述的聚苯乙烯容器原料105(20mm×40mm、厚1mm)加熱至150℃并使其軟化，將形成限定突起物101、培養面102(邊長1cm的正方形)的形狀的鎳制模具106壓在容器原料105上并以4MPa的壓力加壓180s。之后，在不解除加壓壓力的情況下，冷卻到35℃后，取出模具106和容器原料105，從容器原料105垂直方向上提起模具106，由此實現剝離，從而形成了突起物101、培養面102。之后，使由其它模具、通過鑄造法形成的圖14所示的PDMS培養面側壁103與培養面102貼緊，獲得細胞培養容器100。
雖然模具106的制造方法與實施例1相同，但是，由于培養面側壁103是之后接合的，因此，在模具106中不必形成與該部位相當的形狀。但是，為了增加培養面側壁103的高度，在模具106中可以形成與培養面側壁103下部相當的形狀。此外，雖然在培養面側壁103的形成中也使用了模具，并且，該模具大多用鐵、鎳等金屬制成，但是，根據加工精度、方便性、可視性等的必要性，也可由有機樹脂、硅晶片、玻璃等無機物形成。作為形成培養面側壁103的模具的成型方法，可以根據其加工精度和模具材料，從之前所述用于形成細胞培養容器100的模具106的制造方法中選擇。
本實施例中培養面側壁103的形成方法如圖15所示。在本實施例中，通過對厚度為2mm的鎳板116進行機械加工，形成模具117，該模具用于形成與培養面側壁103相當的具有邊長0.90cm、高度1mm的凸起形狀的形狀。之后，對模具表面實施氟系脫模處理，使固化前的PDMS與固化劑混合，在模具117中鑄造0.7mm厚后實施120℃、10分鐘的熱處理，并且在使PDMS固化之后，將其從模具上取下，從而形成培養面側壁103。由于細胞附著性較低，因此，以此方式形成的PDMS養面側壁103適于細胞培養容器100。由于PDMS制成的培養面側壁103與培養面102的附著性較高，因此，通過將培養面側壁103緊貼于培養面102上的所定位置處，就能獲得細胞培養時所需的粘附性。此外，培養面102的突起物101如上所述，形成于邊長為1cm的正方形區域中，培養面側壁103以覆蓋培養面102的端部0.05cm的方式粘緊，從而能夠使培養面側壁103與突起物101的距離等于作為突起物101的間隔的1μm。此外，在培養所需的細胞之后，通過除去培養液并使培養面側壁103與培養面102分離，從而易于除去培養面側壁103。因此，可以拆下在觀察時形成障礙的培養面側壁103，從而非常適于用直立型光學顯微鏡進行高清晰度的觀察或者用掃描型電子顯微鏡對培養后的細胞形狀進行評價。
本實施例也與實施例1相同，培養面102的大小、深度以及一個細胞培養容器100上培養面102的數量可根據培養的細胞系或培養用途選擇最佳值。例如，在將細胞培養容器100作為獲得大量相同條件下的培養細胞的制備手段時，最好加大培養面102，但是，在多種條件下進行試驗性分析時，培養面102較小，若在一個細胞培養容器100內具有如微孔板那樣的形狀，該形狀具有許多培養面102，則能夠減少培養時使用的試劑和細胞數量，因此優選。
下面，對在本發明的細胞培養容器100實施適于細胞培養的表面處理的例子進行說明。作為親水化處理，對通過實施例1的方法形成突起物101的細胞培養容器100進行氧等離子處理(100W，30s)。使以小于突起物101高度的可涂布50μg/mL的膠原I溶液(Cultrex(注冊商標)Bovine Collagen I，溶劑0.02M醋酸水溶液)的由表面親水化PDMS制成的平滑壓模緊貼該細胞培養容器100內部的突起物101的前端部。在除去平滑壓模之后，在室溫下保持1小時后再用PBS(磷酸緩沖液)洗滌，僅對突起物101的前端部施加了由膠原I形成的修飾，并進行適合細胞培養的表面處理。
在本實施例中，雖然在突起物101形成之后，用一種蛋白質膠原進行了修飾，但處理方法并不局限于此，可以根據培養細胞的種類、細胞培養容器100及突起物101的材料，進行氧等離子處理(例如100W，30s)、紫外線照射、浸入過氧化氫水、臭氧水等的親水處理、以氨基、羰基、甲基、CF3基等為代表的官能團的導入、以及多聚賴氨酸、白蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、層粘連蛋白等蛋白質包被等不同的適當表面處理。此外，還可通過僅對突起物101的一部分進行表面處理來控制培養細胞的形狀。
下面，給出了利用本發明的細胞培養容器100進行細胞培養，提高細胞剝離性的例子。
圖16為利用實施例1的方法在本實施例中制成的細胞培養容器100的形狀例子。圖17顯示了形成于細胞培養容器100上的突起物101的排列例子。在本實施例中，為了研究培養的細胞的剝離性與培養面102上的突起物101的形狀之間的關系，在細胞培養容器100中形成突起物101的直徑R分別為四個的(a)180nm、(b)240nm、(c)500nm、(d)2μm的四個培養面102。形成的突起物101的高度H在四個細胞培養容器100中均為1μm。突起物101的排列如圖17所示，為二維正方形格子形狀，相鄰突起物101的間隔D為直徑R的2倍。這些突起物101連續形成于各培養面102中并一直延伸到培養面側壁103附近。
為了進行剝離性評價，在各個培養面102上將人類間葉系干細胞(CAMBREX公司、Cyro hMSC No.2051)接種于培養基(CAMBREX公司、ブレツトキツトMSCGM(間葉系干細胞增殖用培養基))中，并在37℃·5％CO2條件下的孵箱中培養5天。為了進行比較，在一般使用的動物細胞培養用器皿(Corning公司)中也以同樣的條件進行人類間葉系干細胞的培養。
經5天培養之后，通過培養基中產生的水流剝離各個培養面102上的人類間葉系干細胞，從而評價其剝離性。水流是通過在250μl用電動移液器(EDP Plus EP-250)中安裝容量為200μl的移液器芯，并從各培養面102附近、以相對于底面呈70度的角度排出培養時使用的培養基而產生的。
在排出一次培養基后，用顯微鏡觀察各個培養面102上細胞的剝離，結果由表1所示。可以確定在本發明中形成的任一培養面102與作為比較例的動物細胞培養用器皿相比較，其人類間葉系干細胞的剝離性提高。其表明來自細胞培養容器100的人類間葉系干細胞的剝離性決定于突起物101的直徑R，在直徑較大的R＝2μm時，剝離性最大。因此，表明作為附著性細胞的人類間葉系干細胞的附著力在突起物101上變小，剝離性優良。此外，即使在任一培養面102上，仍可以在整個培養面102上觀察到該效果，由此表明在未發揮突起物101的效果的情況下，附著于培養面102上的人類間葉系干細胞實際上是不存在的。
表1

+++剝離非常好，++剝離較好，+能夠剝離，±僅能剝離一點，-完全不能剝離
權利要求
1.細胞培養容器，該容器包括具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁的兩個部位，其特征在于等效直徑比培養的細胞細小的突起物形成于整個培養面，在培養面側壁與培養面的邊界線上的任意位置與最接近的突起物的距離小于所培養細胞的直徑。
2.細胞培養容器，該容器包括具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁的兩個部位，其特征在于在培養面側壁與培養面之間還形成有比培養面低的緩沖面，等效直徑比培養的細胞細小的突起物形成于整個培養面，在緩沖面側的培養面端部的任意位置與最接近的突起物的距離小于培養細胞的直徑。
3.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于培養面由培養面側壁分為2個以上。
4.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于含有表面的突起物的培養面與培養面側壁由相同的材料形成，且形成一體。
5.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于表面的突起物和培養面由相同的材料制成，培養面側壁的至少一部分由與培養面不同的材料形成。
6.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于表面的突起物和培養面由相同的材料制成，培養面側壁的至少一部分可以從培養面上取下。
7.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于在培養面側壁上形成等效直徑比培養的細胞細小的突起物。
8.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于通過在培養面側壁上形成表面結構或形成細胞難附著性的表面修飾，與培養面相比，細胞難以吸附于培養面側壁上。
9.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于所述突起物的間隔小于該細胞的直徑。
10.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于表面的突起物的等效直徑在10nm以上且10μm以下，高度在10nm以上且1mm以下。
11.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于培養面側壁距離培養面的高度為0.05mm以上且100mm以下，相對于培養面的傾斜角度為45度以上。
12.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于含有細胞培養容器的厚度為0.5mm以上的區域。
13.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于在細胞培養容器的整體或其一部分上實施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機物涂覆中任意一種以上的處理。
14.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于在細胞培養容器內的特定區域有選擇地實施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機物涂覆中任意一種以上的處理。
15.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于對構成細胞培養容器內的突起物的各個突起物有選擇地實施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機物涂覆中任意一種以上的處理。
16.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其特征在于僅在構成細胞培養容器內的突起物的突起群的前端部上實施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機物涂覆中任意一種以上的處理。
17.細胞培養容器的制造方法，其中，所述細胞培養容器包括具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁的兩個部位，其特征在于，該方法包括以下工序將形狀與含有培養面表面的多個突起物的培養面和培養面側壁的形狀相當的一個模具放置在軟化狀態的容器原料上，在容器原料上形成含有突起物的培養面和培養面側壁的形狀的工序，和從容器原料上取下模具的工序。
18.細胞培養容器的制造方法，其中，所述細胞培養容器包括具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁的兩個部位，其特征在于，該方法包括以下工序將形狀與含有培養面表面的多個突起物的培養面相當的一個模具放置在軟化狀態的容器原料上，在容器原料上形成含有突起物的培養面的形狀的工序，從容器原料上取下模具的工序，和使培養面側壁與容器原料接合的工序。
19.根據權利要求17所述的細胞培養容器的制造方法，其特征在于模具具有確定比圍繞培養面的培養面低的緩沖面的形狀。
20.根據權利要求17所述的細胞培養容器的制造方法，其特征在于還包括切斷制造的細胞培養容器的一部分的工序。
21.根據權利要求17所述的細胞培養容器的制造方法，其特征在于還包括使制造的細胞培養容器的培養面與外界隔離的包裝工序。
22.根據權利要求17所述的細胞培養容器的制造方法，其特征在于還包括以比構成細胞培養容器的材料的玻璃化轉變點低的溫度對制造的細胞培養容器的培養面實施滅菌處理的工序。
23.培養細胞，其特征在于該細胞由權利要求1所述的細胞培養容器培養。
24.用于培養細胞的細胞培養容器，其特征在于該容器包括培養面以及圍繞培養面的培養面側壁的兩個部位，其中所述培養面具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物，該培養面由培養面側壁分為多個區域，培養面側壁距離培養面的高度為0.05mm以上且100mm以下，細胞培養容器的至少一部分的厚度為0.5mm以上。
25.用于培養細胞的細胞培養容器，其特征在于該容器包括具有等效直徑比培養的細胞細小的多個突起物的培養面，圍繞培養面的培養面側壁，以及在培養面側壁和培養面之間位于比培養面低的位置的緩沖面，該培養面通過培養面側壁被分為多個區域，該緩沖面的寬度大于培養細胞的直徑。
26.根據權利要求24所述的細胞培養容器，其特征在于在培養面側壁的一部分上形成用于切斷細胞培養容器的切口或切割線。
27.根據權利要求24所述的細胞培養容器，其特征在于形成于培養面上的突起物的表面處理、高度、前端部直徑、等效直徑、間隔或布置的至少一種形狀在被分開的每個區域均是不同的。
全文摘要
本發明的目的在于提供細胞培養容器，其能夠通過簡單的結構防止剝離時對細胞的損傷，促進營養物質的輸送及舊廢物的排出，同時，能夠提高這種結構實現的培養效率的改善效果。為了實現上述課題，本發明提供了一種細胞培養容器，其特征在于形成具有等效直徑小于在培養容器中培養的細胞的多個突起物的培養面以及圍繞培養面的培養面側壁，在培養面側壁與培養面的邊界線上的任意位置與最接近的突起物的距離小于培養的細胞直徑。細胞培養容器的突起物能夠更有效地對細胞提供有助于培養細胞的效果。
文檔編號C12M3/00GK1876804SQ200610089950
公開日2006年12月13日 申請日期2006年5月30日 優先權日2005年5月30日
發明者桑原孝介, 宮內昭浩, 久野范人 申請人:株式會社日立制作所