專利名稱：輔助篩選耐冷水稻的方法和它的專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種輔助篩選耐冷水稻的方法和它的專用引物。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物，芽期冷害是影響我國長江中下游的早稻種植區和東北、西北稻區及云貴高原的一季稻區水稻生產的重要限制因子之一。芽期生長遭遇冷害，將導致水稻幼苗生長遲緩、分蘗減少甚至嚴重者還會出現大面積的僵苗、死苗現象，最終造成水稻產量的大幅度降低，因此迫切需要培育出水稻芽期耐冷品種。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，野生稻在演化成栽培稻過程中，經過自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數減少。據統計，栽培稻的等位基因數約為野生稻的60％(Sun C Q，Wang X K，Li Z C，Yoshimura A.Comparison of the geneticdiversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102157-162)，從而導致當前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸(genetic bottleneck)問題。因此從水稻的近緣野生種(普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因組中發掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優異基因，并把它們應用于水稻育種生產中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解決當前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。
江西東鄉普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一。具有極強的耐冷性，它的地下莖能耐-12.8℃的低溫并可安全過冬(Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao SX，Xiong H J，Pi Y H，Luo L J.Studies on cold tolerance of seedling and headingstage in Dongxiang wild rice.Acta Agric Jiangxi，1996，81-6(in Chinese)；Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao S X，Pi Y H，Xiong H J，Luo L J.Genetic study onthe cold tolerance of Dongxiang wild rice at the seedling stage.Acta AgricJiangxi，1997，956-59(in Chinese))，而當前栽培稻無一具此抗性，因此江西東鄉普通野生稻是水稻耐冷性研究的理想材料。Liu et al.(Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li D J，Fu Y C，Wang X K.Identification and mapping of quantitativetrait loci controlling cold-tolerance of Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)at booting to flowering stages.Chinese Science Bulletin，2003，482068-2071)報道了3個來自東鄉野生稻的QTL能提高栽培稻受體親本(桂朝2號)的孕穗開花期耐冷性，進一步證實了從東鄉野生稻中發掘耐冷性基因的可行性。
我國野生稻資源豐富，從野生稻中發掘、定位耐冷基因，尋找與耐冷基因緊密連鎖的分子標記，建立耐冷基因分子標記選擇技術，不僅為培育超耐冷新品種提供新基因和新技術，而且對加強我國野生稻基因資源的保護，將資源優勢變成經濟優勢具有重要意義。
發明內容
本發明的目的提供一種輔助篩選耐冷水稻的方法及其專用引物。
本發明所提供的輔助篩選耐冷水稻的引物，名稱為p18，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
序列表中的序列1由18個脫氧核苷酸組成，序列2由20個脫氧核苷酸組成。
本發明所提供的輔助篩選耐冷水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如該待測水稻的擴增產物中有大小為750-1000bp的條帶，則該待測水稻為候選耐冷水稻。
可通過濃度為1-1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物中是否有目的條帶。
所述PCR擴增的反應體系可為水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％ Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。
所述PCR反應條件可為先94℃ 3min；隨后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35個循環；再72℃ 10min。
本發明的輔助篩選耐冷水稻的方法可用于選育耐冷水稻，縮短耐冷水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適于推廣應用，為選育耐冷的水稻種質提供了一種快捷的選擇方法。
下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步說明。
圖1為以東鄉普通野生稻、IL112和桂朝2號的基因組DNA為模板，分別在引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32的引導下的PCR擴增產物(分子標記)的帶型圖2為在引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32的引導下對耐冷滲入系F2∶3群體的鑒定結果圖3為以20個水稻品種的基因組DNA為模板，在引物p18的引導下的PCR擴增產物具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
下述實施例中的水稻品種，除IL112外，其余品種均來自國家種質資源庫。
實施例1、專用引物及分子標記的發現首先將江西東鄉普通野生稻與超高產品種桂朝2號進行回交和自交，構建了以桂朝2號為遺傳背景的高代回交群體(BC4F2群體)，并對此群體進行芽期耐冷性鑒定。具體的鑒定方法為將水稻種子用5％的次氯酸鈉浸泡20min，然后用清水沖洗3-4次后37℃浸種催芽1天，隨后將種子置于玻璃試管中浸水的濾紙上，將試管放入光照培養室進行發芽(28℃晝/25℃夜，每天12h光照12h黑暗，83％相對濕度)，待芽長至5mm左右時選擇100個健壯一致的芽置于直徑4cm、高9.5cm的玻璃試管中。將試管置于4-5℃冰箱中低溫處理5d，然后將幼芽移至光照培養室中恢復生長7d，測定各株系、桂朝2號及對照品種(麗江新團黑谷，來自國家種子資源庫)的活苗率，以活苗率[活苗率＝(活苗數/供試苗數)×100％]作為芽期耐冷性的指標進行耐冷性評價。篩選出芽期強耐冷系IL112(活苗率100％)，隨后以IL112和桂朝2號為材料進行芯片(芯片為Affimetrix公司的水稻全基因組芯片(GeneChipRice Genome Array)，貨號900599)雜交，并在芯片數據分析的基礎上，結合比較基因組學分析，篩選在日本晴和9311間存在基因組差異的差異表達基因為目的候選基因。依據日本晴序列，在二者存在基因組差異的區域設計引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32(序列如表1所示)，并分別以江西東鄉野生稻、IL112和桂朝2號的基因組DNA為模板進行PCR驗證，基因組測序驗證。PCR擴增的反應體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl10×PCR緩沖液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％ Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。PCR反應條件為先94℃ 3min；隨后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35個循環；再72℃ 10min。通過濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物中是否有目的條帶。檢測結果表明上述7個引物在江西東鄉普通野生稻和IL112中均有擴增產物，而在桂朝2號卻無擴增產物(圖1，所用Marker為天根生化科技有限公司的DL2000，貨號Cat#HT402-01)，江西東鄉普通野生稻和I L112的帶型相同，而與桂朝2號不同。其中引物p12在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在500-750bp之間，引物p8-3在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在100-250bp之間，引物p16在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在500-1000bp之間，引物p18在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在750-1000bp之間，引物p21在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在250-750bp之間，引物p22在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在500-1000bp之間，引物p32在江西東鄉普通野生稻和IL112中擴增到相同的帶型，大小在500-1000bp之間。
圖1中，泳道1、2、3分別是以江西東鄉野生稻、IL112和桂朝2號的基因組DNA為模板進行PCR擴增所得產物。
表1.7個引物的序列
在此基礎上，對各引物引導下的擴增產物進行測序和序列比對分析(clustalx軟件)，結果發現上述7個引物在IL112和江西東鄉普通野生稻中的擴增產物的序列相同。由p8-3得到的PCR擴增產物(分子標記)位于第2染色體上基因LOC_Os02g33330(www.tigr.org)的序列范圍內，由p12得到的PCR擴增產物(分子標記)位于第7染色上基因LOC_Os07g22494(www.tigr.org)的序列范圍內，由p16得到的PCR擴增產物(分子標記)位于第4染色體上基因
LOC_Os04g03579(www.tigr.org)的序列范圍內，由p18得到的PCR擴增產物(分子標記)位于第1染色體上基因LOC_Os01g51670(www.tigr.org)的序列范圍內，由p21、p22和p32得到的PCR擴增產物(分子標記)均位于第10染色體上，分別位于基因LOC_Os10g36160，LOC_Os10g38360和LOC_Os10g30350(www.tigr.org)的序列范圍內。
實施例2、p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32在IL112和江西東鄉普通野生稻的中的擴增產物(分子標記)與群體的耐冷性相關首先按照實施例1的方法對由IL112和桂朝2號回交并自交構建的F2∶3群體的芽期耐冷性進行鑒定，統計各株系的活苗率；同時提取各F2單株的基因組DNA，以實施例1中引物p8-3、p12、p16、p18、p21、p22和p32在IL112和江西東鄉普通野生稻的中的擴增產物(分子標記)為Marker進行PCR擴增(PCR擴增反應和電泳條件同實施例1)檢測各株系的帶型，分析基因型，用T-Test方法分析基因型與芽期耐冷性的關系，結果發現p8-3、p12和p18的擴增產物單獨滲入時即與芽期耐冷性存在顯著相關性，p16、p21、p22和p32的PCR擴增產物在與其它分子標記共同滲入時亦與芽期耐冷性存在顯著相關性(P＜0.05)(圖2)，這些標記和不同標記組合的滲入可使群體的活苗率增加6％-38％(表2)，從而表明這些標記與芽期耐冷性存在密切相關性，可作為篩選耐冷基因或QTL的專用標記。圖2中，A，C，D，E，F，G，H分別表示引物p22，p21，p8-3，p18，p16，p32，p12；A，C，D，E，F，G，H中的任兩對字母組合表示p22，p21，p8-3，p18，p16，p32，p12中任兩對引物的組合，如GH表示由引物p32和p12(p12+p32)的組合，其對應的縱坐標表示它們共同作用時與耐冷性的相關性。
表2.分子標記與水稻耐冷的相關性
活苗率平均值1分子標記滲入或不同分子標記組合滲入的各株系活苗率的平均值；活苗率平均值2無分子標記滲入的各株系活苗率的平均值實施例3、用引物p18篩選耐冷水稻的可行性驗證水稻品種(除IL112外下述水稻品種均為來自國家種子資源庫)IL112，746，云峰7，香粳糯，晚88-1，尚洲10，密陽111，合系35，REIMEL，IR66746-76-3-2，9505-138，桂朝2號，03A-11，03A-9，中優13，37760，水源349，水源332，水源287，VISTA，TP34和SR64446-1。
首先按實施例1中的方法對20個水稻品種進行芽期耐冷性鑒定，鑒定結果如表3表3.20個水稻品種的芽期耐冷性鑒定結果
分別提取上述不同水稻品種的基因組DNA，在引物p18的引導下進行PCR擴增。反應體系如下水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％ Triton X-100)，100μMdNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。PCR反應條件為先94℃ 3min；隨后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35個循環；再72℃ 10min。反應結束，利用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。檢測結果如圖3所示(泳道1和12分別為擴增產物在IL112和桂朝2號中的電泳結果；泳道2-11分別為在10個耐冷品種746，云峰7，香粳糯，晚88-1，尚洲10，密陽111，合系35，REIMEL，IR66746-76-3-2和9505-138中的擴增產物電泳結果；泳道13-22分別為在10個耐冷性差的品種03A-11，03A-9，中優13，37760，水源349，水源332，水源287，VISTA，TP34和SR64446-1中的電泳結果)。結果表明，引物p18在10個耐冷水稻品種中，有9個品種均可擴增出與IL112相同的帶型，且條帶大小在750-1000bp之間；在10個耐冷性差的品種中，有1個品種能擴增出與IL112相同的帶型，且條帶大小在750-1000bp之間。相關性分析結果表明由引物p18得到的擴增產物即分子標記與耐冷性存在顯著關系(表4)，因此，p18可用于篩選耐冷水稻品種。
表4.p18的PCR產物與水稻耐冷的相關性分析
ratio1＝有分子標記滲入的耐冷水稻品種數目/10；ratio2＝有分子標記滲入的不耐冷水稻品種數目/10；**p＜0.01
序列表<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ctacgccgaa ggcagaag18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tcattcggaa caatttgtgg 20
權利要求
1.一種輔助篩選耐冷水稻的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
2.一種輔助篩選耐冷水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如該待測水稻的擴增產物中有大小為750-1000bp的條帶，則該待測水稻為候選耐冷水稻。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液，100μMdNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補充反應體系至20μl。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反應條件為先94℃3min；隨后94℃ 1min，58℃ 1min30sec，72℃ 2min，共35個循環；再72℃ 10min。
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述檢測擴增產物帶型的方法是進行1-1.2％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發明公開了一種輔助篩選耐冷水稻的方法和它的專用引物。輔助篩選耐冷水稻的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。該輔助篩選耐冷水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如該待測水稻的擴增產物中有大小為750－1000bp的條帶，則該待測水稻為候選耐冷水稻。本發明的輔助篩選耐冷水稻的方法可用于選育耐冷水稻，縮短耐冷水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適于推廣應用，為選育耐冷的水稻種質提供了一種快捷的選擇方法。
文檔編號C12N15/11GK1904075SQ20061008880
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月18日 優先權日2006年7月18日
發明者孫傳清, 劉鳳霞, 譚祿賓, 蘇震, 朱作峰, 付永彩 申請人:中國農業大學