專利名稱：同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測 定同型半胱氨酸濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色
譜法(HPLC)、氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯免疫分析法 (EIA)、毛細管氣相色譜-質譜，熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學 法及酶法等等。
1.高效液相色譜法(HPLC):是經典的參考方法，但其有操作比較 復雜，試驗耗時比較長，試驗數據變異比較大的缺點，在臨床應用方 面逐漸被酶聯免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相 色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還 原形式，然后與熒光劑進行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質復合物， 將衍生后的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質的吸附力不 同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據這一原理將樣品中 的不同物質分開，以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質復 合物的熒光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。
2. 酶聯免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的 常用方法，其特點是操作比較方便、快捷，重復性好，方法穩定可靠。 缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗時等。酶聯免疫分析法其基 本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成S-腺 苷-L-同型半胱氨酸,然后加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單 克隆或多克隆抗體，采用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶 標抗體競爭結合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止， 制作出同型半胱氨酸濃度與發色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟 處理，在標準曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
3. 離子色譜法主要用于實驗研究，臨床上較少使用。其基本分 析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質，根據 其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質分開進行測 定。
4. 毛細電泳法主要用于實驗研究，有在臨床使用的報道。其特
點與高效液相色譜方法相似，如其有操作比較復雜、試驗耗時較長和
試驗數據變異比較大的缺點。基本分析原理先使用還原劑使血樣中 所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然后與熒光試劑進行衍生 生成同型半胱氨酸-熒光物質復合物，將衍生后的樣品進行毛細電泳分
析。將樣品放置于io千伏左右的高壓電場中，因為各種物質所帶電荷
不同，其等電點也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根 據這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質分開，再以熒光檢測器檢測同型半胱氨酸-熒光物質復合物的熒光強度，將其與標準品/ 內標的比值進行比較和計算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5. 熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法， 該方法完全自動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優點。其基本 分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結合的同型半 胱氨酸的熒光偏振強度不同，將樣品、標準品與標抗體競爭結合，采 用競爭結合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強度的標準曲 線，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。
6. 酶法是因應市場需求而新開發出來的測試方法，目前國內有多 項專利申請CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半 胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉甲基酶
(E.C2U.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(￡.0.3.3丄1)的循環擴增作用， 再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶 等，或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應測定同型半胱氨酸含量; C^200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 產生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產生熒光，該方法使用 全自動熒光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優點。其基本分析 原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產物再與 熒光顯色劑發生化學反應形成可測量之熒光化合物。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)、酶聯法(Couple Reaction)偶聯化 學反應技術，計量通過酶聯及化學反應生成亞甲基蘭(Methylene blue) 所導致在660nm波長處吸光度的上升，得以測定同型半胱氨酸濃度的 方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的同型半胱氨酸診斷試
劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行同型半胱氨酸濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確 度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下 同型半胱氨酸S-腺苷同型半胱氨酸水解酶腺苷基同型半胱氨酸 腺苷基同型半胱氨酸+氧+水氨基酸氧化酶腺苷基硫代丁酮酸
+氨+過氧化氫
過氧化氫+10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺棊)吩噻嗪一"
亞甲基蘭
這種方法應用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(偶)聯合氨基酸氧化酶及化 學反應終點比色法。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶解同型半胱氨酸反 i產生腺苷基同型半胱氨酸，腺苷基同型半胱氨酸再通過(偶)聯合 氨基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪 的作用，最終生成亞甲基蘭，從而可以通過可見光分析儀器，在660nm 波長處，測定生成亞甲基蘭含量高低的光吸收大小，通過測量660nrn 處吸光度上升的程度，得出同型半胱氨酸濃度大小測定結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關系的本發明同型半胱氨酸診斷試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 8000 U/L
氨基酸氧化酶 12000 U/L
10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
6 mmol/L
本發明的同型半胱氨酸含量診斷試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶、10-(羧 甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑，更有利于消除內外源氨 基酸污染
試劑1
緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。 試劑2
緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙 酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑，不但有利于消除內外 源氨基酸污染，還有利于試劑的穩定 試劑l
緩沖液、穩定劑、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3,7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪。 試劑2
緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙 酰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 6000 U/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，測 試主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點 法，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。 實施例二
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L
氨基酸氧化酶 15000 U/L
10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩定劑 5Ommol/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 10000 U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型半 胱氨酸的濃度大小。
實施例三同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑，包括-試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩定劑 50 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙酰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑2
' 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑 50 mmol/L
氨基酸氧化酶 14000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37-C，反應時間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/30,反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源 物質量污染。
權利要求
1.一種同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 腺苷基同型半胱氨酸腺苷基同型半胱氨酸+氧+水 氨基酸氧化酶 腺苷基硫代丁酸+氨+過氧化氫過氧化氫+10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪-→亞甲基蘭腺苷基硫代丁酸(S-adenosyl-γ-thio-ketobutyrate)將最終反應物亞甲基蘭(Methylene blue)置于可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的大小程度，測算出同型半胱氨酸濃度大小測定結果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1~~" 50mmol/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶 200——500000 U/L 氨基酸氧化酶 200——500000 U/L 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪0.1-20mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(adenosylhomocysteinase EC 3.3.1.1 )、氨基酸氧lk酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪(10曙(carboxymethyl -aminocarbonyl)-3，7-bis(dimethylamino) phenothiazine )組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(adenosyl homocysteinase EC 3,3.1.1 )、氨基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪(10-(carboxymethyl -aminocarbonyl)-3，7-bis(dimethylamino) phenothiazine)組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、氨基酸 氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成; 試劑2，由緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶組成。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基) -3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于'由緩沖液、穩定劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(adenosyl homocysteinase EC 3.3.1.1 )、氨基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7誦雙(二甲胺基) 吩噻嗪(10-(carboxymethyl -aminocarbonyl)-3，7-bis(dimethylamino) phenothiazine)組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、氨基 酸氧化酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、10-(羧甲基-氮乙酰 基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、 s-腺苷同型半胱氨酸水解酶組成。s-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙酰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在 于還包括穩定劑l一OOO mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩 定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇 (Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少 一種。
全文摘要
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪(DA-67)及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶促反應，再將反應物置于可見光分析儀下，檢測主波長660nm處吸光度上升的大小程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度。
文檔編號C12Q1/00GK101097192SQ200610085579
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司