專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定 腺苷脫氨酶活性濃度的測定方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關 系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，
腦脊液鑒別診斷，重癥聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝 硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化
法。據申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是 腺苷(白色結晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine ) + 氨離子(NH/)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現，因 此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大 小然而，此方法無法用一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用 專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應用。
檢索發現，申請號為03128092.7 、申請日為2003.05.29 、名稱 為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國專利申請公開了應 用酶反應產物氧化型煙酰氨輔酶配制的測定試劑。該發明所指的酶法 測定試劑并不加入測定反應所需的還原型煙酰氨輔酶或其類似物，而 加入其反應產物氧化型煙酰氨輔酶或其類似物，及其相應的生成還原 型輔酶所需的酶和底物系統，通過在試劑內形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環
還原為還原型煙酰氨輔酶或其類似物，當被還原的還原型煙酰氨輔酶 或其類似物達到一定的濃度時，該發明所指的酶法試劑就可達到測定 樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發明的特點在于為腺苷 脫氨酶的測試提供一個內源合成腺苷脫氨酶反應所需要的還原型煙酰 氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點之一為，這個系統在生成反應所需 要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷 脫氨酶偶聯谷氨酸脫氫酶反應必定將還原型煙酰氨輔酶氧化成氧化型 煙酰氨輔酶)的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二 是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產生足夠 的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結果，給測試帶 來很大的不便。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric
Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶
(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺苷脫氨酶
活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨
酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全
自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度的測定，而且測定速度快、
準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下-腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子
氨離子+ a-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸
+輔酶+水 谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨離子+ (X-酮戊二酸+
過氧化氫
這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)將 腺苷酶解產生氨。
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3 或EC 1.4.1.4)及谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)作為循環酶谷氨酸脫氫酶的酶促作用產生谷氨酸；谷 氨酸氧化酶再將谷氨酸再次變回氨及a-酮戊二酸，使氨不斷地被 重復循環利用。
谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3 或EC 1.4丄4)作為顯色酶，使還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處 吸光度下降的速度，可以測算出腺苷脫氨酶活性濃度。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，.無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明腺苷脫氨酶 診斷試劑盒較為理想
緩沖液 lOOmmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 50000 U/L
谷氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
本發明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨
酸氧化酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l
-緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
- 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸。
試劑2
緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方
法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 50000 U/L
谷氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起 始.吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，檢測方 法為速率法，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生 化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷 脫氨酶活性濃度的大小。 實施例二
本實施例的腺苷脫氨嗨診斷試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩定劑
還原型輔酶
a-酮戊二j
100腿ol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑
谷氨酸脫氫酶 谷氨酸氧化酶
100腿ol/L 50 mmol/L 40000 U/L 15000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測樣品 與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 檢測方法為速率法，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 .加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑
50 mmol/L
10
還原型輔酶
a-酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑
谷氨酸脫氫酶
0.25腿ol/L
10 mmol/L
100mmol/L
50 mmol/L
60000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
50 mmol/L 20000 U/L
穩定劑
谷氨酸氧化酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度
37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm, 測試副波長405nm，被測樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，檢測方法為速率法，延遲 時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫 氨酶活性濃度的大小。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好、不受內外 源物質的污染，便于推廣應用。
權利要求
1.一種酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸+輔酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨離子+α-酮戊二酸+過氧化氫將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出腺苷脫氨酶活性濃度大小測定結果。腺苷脫氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作為作用酶，功能為將腺苷酶解產生氨。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環酶谷氨酸脫氫酶的酶促作用產生谷氨酸；谷氨酸氧化酶再將谷氨酸再次變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被重復循環利用。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作為顯色酶，使還原型輔酶變成為輔酶，在340nm波長下發生吸光度下降，從而可以測算出腺苷脫氨酶活性濃度。還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括 緩沖液 40~~500 mmol/L 穩定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35mmol/L谷氨酸脫氧酶 2000-500000 U/L谷氨酸氧化酶 2000——500000 U/L a-酮戊二酸 2-20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4,1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成單劑 試劑。4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成雙 劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、ot-酮戊二酸、 組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶 組成。a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成多 劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸組 成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶組成；試劑3,由 緩沖液、穩定劑、谷氨酸氧化酶組成。a-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、 谷氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 6.根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑l一OOO mmol/L或0.in/。-100n/。體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種酶循環擴增法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、腺苷、α-酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、谷氨酸氧化酶、還原型輔酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶(偶)促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度大小，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/34GK101096701SQ20061008557
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司