專利名稱：惡臭假單胞菌及其在拆分扁桃酸外消旋體中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株惡臭假單胞菌及其用途。
背景技術：
扁桃酸(α-羥基苯乙酸)是一種重要的制藥中間體。較之扁桃酸的消旋體，其單一對映體(右旋或左旋的扁桃酸)的使用價值更高。因此，如何能簡便高效地獲得扁桃酸的單一對映體成為研究熱點。
美國專利4,322,548提到了一種利用光學活性苯甘氨酸酯和苯甘氨酸酯鹽酸鹽作為拆分劑，通過與扁桃酸形成非對映異構體來達到拆分扁桃酸的目的，此方法的缺點是必須使用昂貴的手性拆分劑和大量的有機溶劑，而且拆分步驟比較繁瑣；文獻J.Chem.Soc.Perkin TransI.1992，2253-2255報道了脂肪酶在有機相中催化轉酯化拆分扁桃酸及其衍生物，獲得光學純度≥97％ee的(S)-(+)-扁桃酸和≥99％ee的(R)-(-)-扁桃酸，但此方法的缺點是反應時間較長，轉化率不高；文獻Appl.Environ.Microbiol.1991，57(10)，3028-3032報道了利用糞產堿桿菌細胞催化消旋體扁桃腈選擇性水解生成光學純(R)-(-)-扁桃酸，其缺點是存在安全隱患。因此，如何能簡便、安全和高效地獲得扁桃酸的單一對映體成為本發明需要解決的技術問題。
發明內容
本發明目的之一在于，提供能選擇性降解(R)-(-)-扁桃酸的菌株；本發明目的之二在于，提供一種應用上述菌株拆分扁桃酸外消旋體的方法。
本發明的發明人從土壤中，經初篩、復篩及分離純化，獲得一株能選擇性降解外消旋扁桃酸中(S)-(+)對映體的芽胞桿菌(Bacillus sp.)ECU1008，該菌株在2005年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1387；同樣，發明人通過篩選從土壤中獲得另一株能選擇性降解外消旋扁桃酸中(R)-(-)對映體的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009，該菌株在2005年6月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.1388。
CGMCC No.1387菌株具有如下特征1、大小形態桿狀，大小2～3μm，在產芽孢培養基中培養數天后產梭狀芽孢，革蘭氏染色陽性；2、適合生長環境可在溫度10～40℃，pH5～9、NaCl濃度0～7％(w/v)環境中生存；3、平板培養菌落特性同心圓狀；突臍狀；黃色。
CGMCC No.1388菌株具有如下特征1、大小形態桿狀，大小2～3μm，不產芽孢，革蘭氏染色陰性；2、適合生長環境可在溫度10～40℃，pH5～9、NaCl濃度0～7％(w/v)環境中生存；3、平板培養菌落特性圓形，邊緣整齊；低凸面；乳白色。
CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在拆分扁桃酸外消旋體中的應用，其主要步驟如下將CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株按1～10v/v％接種量接種至生物轉化培養基，于20～40℃(優選25～35℃)狀態下保持1～5天(優選2～3天)后經離心除去菌體后得水相，調節所得水相pH值小于3后，經萃取后得(R)-(-)-或(S)-(+)-扁桃酸；其中所說的生物轉化培養基為外消旋扁桃酸0.1～5wt％，玉米漿0.1～2wt％，NH4NO30.1～0.5wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，余量為水。
在本發明中，CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在用于拆分扁桃酸外消旋體前最好在由葡萄糖0.1～3wt％，蛋白胨0.1～3wt％，酵母膏0.1～3wt％，外消旋扁桃酸0.1～3wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，瓊脂0～2wt％和余量為水組成的預培養基中進行預培養，預培養的溫度20～40℃，預培養的時間為1～6天。
利用本發明公開的兩株細菌及類似的工藝，還可以拆分扁桃酸衍生物的消旋體，如對羥基扁桃酸、對氯扁桃酸、間氯扁桃酸和鄰氯扁桃酸等消旋體。
采用本發明所用的生物轉化工藝，不僅能簡單方便地獲得高純度的(R)-或(S)-扁桃酸，而且生產成本比現有技術的低，是一種具有廣泛應用前景的生產方法，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需要。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明的技術內容作進一步的描述。其目的僅在于更好理解本發明內容，而非限制本發明的保護范圍實施例1菌株的篩選取少量土壤稀釋液上清涂平板(含富集培養基，其組成為苯甲酰甲酸2.0g，(NH4)2SO42.0g，K2HPO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7.0)，在25～40℃下倒置培養2～4天，挑單菌于豐富培養基平板上培養1～2天，再將單菌落接種至液體發酵培養基(甘油15.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，自來水1000ml，pH 7.0)中培養24小時，離心收集菌株Bacillus sp.ECU1008或Pseudomonas putida ECU 1009。
實施例2將Bacillus sp.ECU1008(CGMCC No.1387)菌株接種至40ml生長培養基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl 0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余為水，pH7.0)中，30℃、160rpm搖床上預培養12h后，加入0.5％外消旋扁桃酸做為誘導物，繼續培養12h；以該培養液為種子，按10v/v％的接種量接種至40ml轉化培養基(消旋扁桃酸20.0g，玉米漿1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm搖床上發酵轉化2天。反應結束后以10000×g離心10min，收集上清液，旋轉蒸發除去大部分水，用50％硫酸酸化濃縮液至pH 1～2，再以食鹽飽和，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發掉有機溶劑得結晶粗品，通過硅膠柱層析(苯∶乙酸乙酯∶甲酸，體積比10∶2∶1)純化后，得純品(R)-扁桃酸380mg，產率46.5％。
實施例3將Pseudomonas putida ECU1009(CGMCC No.1388)菌株接種至40ml營養培養基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余為水，pH7.0)中，30℃、160rpm搖床上預培養12h，加入0.5％扁桃酸做為誘導物，繼續培養12h，以該培養液為種子，按10％的接種量接種至40ml轉化培養基(消旋扁桃酸10.0g，玉米漿1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，自來水1000ml，pH 7.0)中，28℃下160rpm搖床上培養2天。反應結束后10000×g離心10min，去除菌體，保留上清液，加入1g活性碳加熱脫色，過濾除去活性碳，濾液在減壓條件下旋轉蒸發除去大部分水，濃硫酸酸化濃縮液至pH 1～2，以食鹽飽和，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發掉有機溶劑得結晶粗品，經硅膠柱層析(苯∶乙酸乙酯∶甲酸，體積比10∶2∶1)純化后得純品(S)-扁桃酸350mg，產率42.0％。
實施例4將Bacillus sp.ECU1008(CGMCC No.1387)菌株接種至40ml營養培養基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl 0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余為水，pH7.0)中，30℃、160rpm搖床上預培養12h，加入0.5％扁桃酸做為誘導物，繼續培養12h，以該培養液為種子液，按10％的接種量接種至200ml轉化培養基(消旋扁桃酸10.0g，玉米漿1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，自來水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm搖床上培養，在21h、34h和58h時補加2g消旋扁桃酸，并以濃氨水調pH，使其保持在6.5～7.0之間，94小時后結束轉化。
整個過程中，監測菌體生長情況，用分光光度計測定發酵液在600nm下的光密度(OD值)。扁桃酸濃度的測定方法取反應樣品1ml，離心取0.1ml上清，加入0.1ml 1M HCl溶液、0.2ml 10mM苯乙酸甲醇溶液與0.4ml甲醇混合均勻，然后用反相HPLC柱分析產物扁桃酸的濃度；0.4ml用0.1ml 1.0M HCl溶液酸化，乙醚萃取，蒸發干乙醚后，以三甲基氯硅烷進行甲酯化，然后用手性色譜柱(Chiracel OD)分析扁桃酸甲酯的對映體過量值(ee)。反相色譜柱用Shim-Pack VP-ODS(Shimadzu，150×4.6mm)；流動相為甲醇/KH2PO4水溶液(13/87，v/v；0.8ml/min)；225nm紫外檢測。扁桃酸、苯甲酰甲酸、苯甲酸和內標的出峰時間分別為6.5、9.2、24.8和29.9min。采用手性色譜柱(Chiracel OD，Daicel Co.，Japan)分析扁桃酸甲酯對映體過量值，流動相為正己烷/異丙醇＝(90∶10，v/v，0.7ml/min)，出峰順序依次為苯甲酰甲酸甲酯(8.5min)、(S)-扁桃酸甲酯(12.0min)、(R)-扁桃酸甲酯(20.0min)；228nm紫外檢測。
發酵結束后在10000×g條件下離心10min分離除去細胞，得420ml上清調pH至5.0，加入1g活性碳加熱脫色，過濾除去活性碳，濾液減壓旋轉蒸發大部分水，得到94ml濃縮液，加4ml濃硫酸酸化，用40ml乙酸乙酯萃取四遍，合并萃取液，減壓蒸發掉溶劑，得粗結晶，以15ml甲苯重結晶兩遍。干燥后得(R)-扁桃酸6.5g，產率40％，[α]D20＝-152.0°。
實施例5將Pseudomonas putida ECU1009(CGMCC No.1388)菌株接種至40ml營養培養基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余為水，pH7.0)中，30℃、160rpm搖床上預培養12h，加入0.5％扁桃酸做為誘導物，繼續培養12h；以該培養液為種子液，按10％的接種量接種至200ml轉化培養基(消旋扁桃酸10.0g，玉米漿1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，自來水1000ml，pH 7.0)中，30℃下160rpm搖床上培養，分別于21h、34h、45h和58h補加1g消旋扁桃酸，并以濃氨水調節pH，使其保持在6.5～7.0之間。94小時后結束培養。發酵過程扁桃酸濃度測定同實施例4。
發酵轉化結束后在10000×g條件下離心10min，分離除去細胞，得440ml上清，調pH至5.0，加入1g活性碳加熱脫色，過濾除去活性碳，濾液減壓旋轉蒸發大部分水，得到94ml濃縮液，加4ml濃硫酸酸化，用40ml乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，減壓蒸發掉溶劑，得粗結晶，在15ml甲苯中重結晶兩遍。干燥后得(S)-扁桃酸4.95g，產率41％，[α]D20＝+152.2°。
權利要求
1.一株惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009，其保藏號為CGMCC No.1388。
2.如權利要求1所述的菌株在拆分扁桃酸外消旋體中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的拆分扁桃酸外消旋體的主要步驟是將CGMCC No.1388菌株按1～10v/v％接種量接種至生物轉化培養基，于20～40℃狀態下保持1～5天后經離心除去菌體后得水相，調節所得水相pH值小于3后，經萃取后得(S)-(+)-扁桃酸；其中所說的生物轉化培養基為外消旋扁桃酸0.1～5wt％，玉米漿0.1～2wt％，NH4NO30.1～0.5wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，余量為水。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，其中CGMCC No.1388菌株在用于拆分扁桃酸外消旋體前，在由葡萄糖0.1～3wt％，蛋白胨0.1～3wt％，酵母膏0.1～3wt％，外消旋扁桃酸0.1～3wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，瓊脂0～2wt％和余量為水組成的預培養基中進行預培養，預培養的溫度20～40℃，預培養的時間為1～6天。
全文摘要
本發明公開了一株專一性降解(R)－扁桃酸的假單胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009(CGMCC No.1388)及其用途。利用本發明提供的菌株來拆分扁桃酸外消旋體，具有操作簡單安全、成本低廉、目標產物容易純化及對環境友好等優點。
文檔編號C12P41/00GK1924003SQ20061008237
公開日2007年3月7日 申請日期2005年6月23日 優先權日2005年6月23日
發明者許建和, 黃漢榮, 徐毅, 潘江 申請人:華東理工大學