專利名稱：轉人α－乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，特別是涉及轉基因—克隆技術領域。
背景技術：
轉基因動物研究是人類按著自己的意愿有目的、有計劃、有根據、有預見地改變動物的遺傳組成，而改變其遺傳組成的目的是多種多樣的。比如遺傳學家希望通過改變動物的遺傳組成來觀察其表型變化，生理學家希望通過特定基因的表達來研究該基因對機體生理狀況的影響。與動物生產有關的轉基因研究則希望通過轉基因技術來賦予動物新的表型性狀。該項研究在實驗技術上依賴分子生物學、動物胚胎和配子操作技術。
轉基因動物的制作方法目前主要有原核期胚胎的顯微注射，逆轉錄病毒感染發育早期的動物胚胎，精子載體法，ES細胞技術，PGCs技術，體細胞核移植技術，逆轉錄病毒載體感染MII期的卵母細胞，精子頭與DNA合并注射卵母細胞法。這些方法上的改進與提高大大地促進了轉基因動物研究由實驗室向生產實踐轉化的進程。
其中最傳統和最常用的方法是原核期胚胎的顯微注射，該方法由美國人Gordon發明，是目前應用比較廣泛、效果比較穩定的制作轉基因動物的方法之一。即在顯微操作儀下通過一毛細玻璃管將外源DNA注射進動物受精卵細胞的原核內，再將該受精卵細胞移植進受體細胞子宮內，再將該受精卵分裂時，外源DNA可能整合入宿主染色體組，待該受精卵發育成熟即可獲得轉基因動物。但是顯微注射法獲得的轉基因家畜的效率極低，特別是牛，羊和豬等，往往低于1％，這將大大增加制作轉基因家畜的成本。
隨著體細胞克隆技術的發展，基因操作技術與克隆技術相結合是將成為轉基因動物，特別是大家畜生產的主要方式。目前，取得的主要進展是轉基因技術和靶位操作技術在克隆動物上的應用。首先，利用克隆進行轉基因是指在核移植前，先把目的基因和標記基因的融合基因導入培養的體細胞，再通過標記基因的表現來篩選轉基因的陽性細胞及其克隆，然后再移植。1997年，英國PPL公司的科學家Schnieke與羅斯林研究所的Wilmut等聯手通過體細胞核移植技術率先在世界上制作了轉基因綿羊。利用胎兒成纖維細胞系，經過轉染之后，再克隆。被轉染的外源基因含有人的凝血因子IX基因的完整編碼區和β-BLG基因啟動子，凝血因子IX能被高效表達，每毫升奶中包含125μg的凝血因子IX蛋白。利用克隆進行轉基因，一旦核移植成功，從理論上講，轉基因成功率為100％。原核注射的方法會使大量的非轉基因胚胎被懷孕，這是一種資源浪費，而利用克隆進行轉基因技術不會造成代理母親去懷孕非轉基因動物。此外，利用克隆進行轉基因時，轉基因動物的性別會被提前決定。這樣的話，如果想得到能在乳腺中表達蛋白質，就可以使克隆的轉基因動物全是雌性動物。
由于動物轉基因技術能按照人們的意愿改變動物的生產性狀，得到人們所需要的產品，特別是一些蛋白藥品及保健品，科學家們已經開始將動物轉基因技術應用到實踐當中，目前動物轉基因技術主要有以下一些應用(1)、促進動物生長、提高畜產品產量、改善產品品質，(2)、動物抗病育種，(3)建立診斷和治療人類疾病的動物模型，(4)生產藥用蛋白。
動物乳腺生物反應器是一種利用動物轉基因技術在乳腺細胞中表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。通過基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我們進一步研究乳腺癌的機制，提高乳汁的營養成分，甚至可以合成藥物。該技術具有低投入高產出的特點，其效率是利用以大腸桿菌和動物細胞培養技術的一百倍，是一種非常有潛力的高新技術。1987年，Simons等人在轉基因小鼠乳腺中首次成功地表達羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶樣中的蛋白含量高達23克/升，大約是動物細胞表達蛋白的400倍以上。該技術一經出現就得到迅猛的發展。目前，牛乳白蛋白基因人組織血纖維蛋白溶酶原因子，人生長激素基因，人體抗胰蛋白酶基因，人尿激酶基因和人干擾素基因等基因都在小鼠的乳腺中得到表達。許許多多的著名科學家都認為這將是畜牧業前所未有的革命，可能會給社會帶來巨大的經濟效益。在過去的十年里，已經有十幾家公司開展這方面的研究工作。尤其，隨著動物克隆技術成熟，轉基因技術得到了更充分的發展。這將使乳腺生物反應器的大規模生產更加現實，因此一場圍繞該技術的國際性競爭將是必然。
利用乳腺生物反應器的方法改造奶牛、奶山羊，使生產出的奶成分近似于人奶，既有營養的功能，又有藥用的功能，這種奶可以使孩子長得高大，促進大腦和神經發育，增強免疫功能，這種新型保健品一定會有廣闊的前途。改善奶的營養成份或生理生化特征也是人們希望通過改變動物的遺傳組成來實現的目標之一，即制造所謂的營養藥品(Nutraceuticals)。家畜奶及其加工產品可提供人類30％的營養蛋白，含有豐富的必需氨基酸、鈣和無機磷酸鹽，以及消化率很高的酪蛋白，是人類高質量的營養來源；但乳用家畜奶在品質上還不盡如人意。因此，人們一直在研究如何改善奶品質。自Gordon創立動物轉基因技術以來，世界各國都爭先開展轉基因育種及其相關技術研究。研究表明外源基因不僅能在轉基因動物中得到整合與表達，而且能獲得組織特異性(乳腺組織、輸卵管)和發育特異性表達，并且現在能夠利用分子技術找到調節乳成分的所有基因。
α-乳清蛋白是分子量小、酸性的，高親和性的Ca2+結合蛋白，它幾乎存在于所有的哺乳動物乳汁中。在乳腺分泌細胞中，α-乳清蛋白作為調節亞基通過與半乳糖苷轉移酶相互作用催化乳糖的合成。最近還發現α-乳清蛋白的不同的折疊突變體具有殺菌和誘導腫瘤細胞死亡的功能，還能與油酸形成復合物殺死皮膚的乳突淋瘤，具有廣闊的應用前景。
α-乳清蛋白的功能(1)α-乳清蛋白的營養價值。由于α-乳清蛋白是人乳中重要的組成成分，約占總蛋白含量的28％，占乳清蛋白含量的49％，可以想象，α-乳清蛋白除了生理功能以外，還是乳汁中重要的營養成分。如果比較人奶和牛奶蛋白質的氨基酸組成，就會發現，牛奶中色氨酸和半胱氨酸的含量明顯低于人奶中的含量，而造成這一結果的主要原因是牛奶中α-乳清蛋白的含量比較低。人乳中α-乳清蛋白色氨酸和半胱氨酸的含量(wt/wt)分別為6％和5％。色氨酸為必須氨基酸，必須由母乳供給，而半胱氨酸雖然不是必須氨基酸，但由于初生嬰兒代謝系統不完善，如果食用牛奶的話，也可能造成半胱氨酸的缺乏。色氨酸和半胱氨酸也可能參與嬰幼兒重要的生理活動。例如，色氨酸可能與睡眠行為有關，一直食用牛奶的嬰幼兒，他們的睡眠可能會受到影響；而半胱氨酸是谷胱苷肽的組成部分，它可作為抗氧化劑，保護細胞免受氧化作用的傷害。因此，為使嬰幼兒的奶制品更加營養合理，人們已開始嘗試牛奶人乳化，我們實驗室也正在開展這方面的工作。
(2)α-乳清蛋白調節乳糖合成的功能。人們很早就知道，α-乳清蛋白是乳糖合成酶的一個組成部分，葡萄糖存在條件下，與半乳糖苷轉移酶結合在一起，調節該酶的專一性。由于α-乳清蛋白易于從半乳糖苷轉移酶上解聚，可把它看成乳糖合成酶的一個調節亞基，因而在乳糖合成中起的是調節作用。這個酶的另一個亞基是半乳糖苷轉移酶(GT)，它在多種分泌細胞中能夠催化半乳糖殘基從UDP-半乳糖到糖蛋白上。而在哺乳動物的乳腺中，專一性的半乳糖苷轉移酶與α-乳清蛋白相互作用，通過這一過程可增加GT對葡萄糖的親和性和專一性，使其催化底物對象變為葡萄糖，整個催化過程如下
這個反應在高爾基體中發生，α-乳清蛋白與高爾基體內膜上的半乳糖苷轉移酶結合形成乳糖合成酶，這種結合使乳糖合成酶對于葡萄糖的親和力大大增加。由于α-乳清蛋白是連續分泌的，因此，它對于乳糖合成的維持是十分必要的。從已知的各種動物乳中乳糖和α-乳清蛋白的含量看，它們二者之間以及它們與乳的分泌量之間呈正相關。乳糖的合成開始總與α-乳清蛋白的出現相伴，這在許多實驗中已得到證明。另外，體內實驗和體外實驗表明，α-乳清蛋白的合成受催乳素或胎盤催乳素以及糖皮質激素的影響，但懷孕期可被孕酮抑制。
(3)α-乳清蛋白的殺菌和誘導細胞凋亡的功能。Pelligrini等人發現用胰蛋白酶和糜蛋白酶水解α-乳清蛋白，產生了三種具有殺菌特性的多肽，這些多肽對絕大多數革蘭氏陽性菌起作用，這說明α-乳清蛋白被內肽酶降解后具有抗菌作用。Hakansson et al發現了一種α-乳清蛋白構象的突變體，這個突變體對抗生素敏感和有抗性的肺炎鏈球菌都具有殺傷能力。具有殺菌活性的蛋白可通過離子交換和凝膠色譜從酪蛋白中分離出來。更為有趣的發現是天然狀態的α-乳清蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以轉變成具有殺菌活性的形式，正如前面所提到的，α-乳清蛋白擁有幾個脂肪酸結合位點。
近來Hakansson和Svensson等描述了α-乳清蛋白可能的更為吸引人的功能，他們發現一些多聚體，雖然不能完全代表α-乳清蛋白衍生物的特性，但它們是有效的Ca2+增加和編程死亡的誘導劑，具有廣泛的細胞毒性，能夠殺死所有實驗的胚胎和淋巴細胞。多聚體的α-乳清蛋白形式可以從奶的酪蛋白部分分離出來。進一步研究發現，α-乳清蛋白誘導編程死亡的部分包含著該蛋白的寡聚體，而寡聚體又要經歷類似熔球構象的改變，寡聚化似乎保持著α-乳清蛋白具有生物活性的熔球狀態。前面已經提過，在Zn2+存在下，可以得到α-乳清蛋白的積聚體，但卻不知道它們有沒有細胞毒性。多聚化的α-乳清蛋白結合到細胞表面，進入細胞質并在細胞核中積累；同時，我們也發現脫離子的α-乳清蛋白和Zn2+結合與磷脂膜的相互作用比Ca2+結合蛋白與磷脂膜的相互作用更有效，這兩個現象是完全一致的。Kohler等人也指出聚合的α-乳清蛋白可激活Caspases，并誘導編程死亡，而且α-乳清蛋白直接作用線粒體，引起細胞色素C的釋放，這是細胞編程死亡起始非常重要的一步。
(4)α-乳清蛋白具有治療乳突淋瘤的功能對于人α-乳清蛋白，最近最激動人心的研究是發現α-乳清蛋白油酸復合物能抑制并清除乳突淋瘤。乳突淋瘤是一種由角化細胞感染乳突淋瘤病毒所引起的，常見的腫瘤，通常發生在皮膚和粘膜上皮。皮膚乳突淋瘤一般是良性的，而粘膜上皮乳突淋瘤會引起其它一些惡性腫瘤。Gustafsson等人(2005)利用陽離子交換層析獲得人α-乳清蛋白與C18:1脂肪酸復合物，對40個乳突淋瘤病人進行隨機的、以安慰劑為對照，雙盲的局部治療，一期治療結果顯示，75％的病人乳突淋瘤病灶明顯縮小，而對照組只有15％；二期治療兩年后，83％的病人乳突淋瘤病灶清除，而且沒有任何副作用，表明α-乳清蛋白油酸復合物對于乳突淋瘤具有良好療效。α-乳清蛋白油酸復合物還具有廣普的殺死腫瘤細胞的作用，并且對正常細胞沒有損害。
目前人α-乳清蛋白主要從人奶中純化，由于來源有限，限制了人α-乳清蛋白作為藥用蛋白和保健品的使用，因此利用轉人α-乳清蛋白基因的克隆牛乳腺生產重組人α-乳清蛋白將具有重要意義。
人、牛、山羊和綿羊的α-乳清蛋白基因分別被定位在第12、5、5和3號染色體上，世界上也已知得到多種編碼α-乳清蛋白的基因。除小袋鼠的α-乳清蛋白基因外，其它物種該基因的轉錄單元長度都在2Kb左右，一般包括4個外顯子。人和鼠α-乳清蛋白基因的序列和基因組最先研究清楚。人α-乳清蛋白基因全長2433bp，外顯子長717bp，內含子長1636bp。人α-乳清蛋白基因序列含有Alu重復序列，該序列反向插入內含子I中，Alu序列在人類基因組中約有500,000拷貝，占人類總基因組的5％～6％，成員眾多，大約有300,000種，故稱Alu序列家族。人α-乳清蛋白基因中的Alu序列與Alu共同序列其同源性達88％，含有各種Alu和Alu樣序列的保守內部組件。小袋鼠的該基因轉錄單元中除具有其它的四種相應的外顯子序列，可能還有第五個外顯子結構，在四個其它外顯子5′端上游的一段序列沒有任何調控序列存在，人們推測它可能包含了第五個外顯子，但這還需要進一步證實。
目前對于人α-乳清蛋白，轉基因研究報道并不多，主要側重于α-乳清蛋白基因的調控和表達研究。日本的Fujiwara等1997年利用210kb含人α-乳清蛋白基因完整表達調控單元進行轉基因大鼠研究，在轉基因大鼠奶中獲得了2.0-4.3mg/ml人α-乳清蛋白的高效表達，并且不受位置效應的影響。Takase和Hagiwara利用人α-乳清蛋白基因cDNA進行了轉基因煙草研究，在5g葉子中表達了具有天然活性的5mg人α-乳清蛋白。1999年Fujiwara等做了大量的分析研究工作后，認為包含50kb的5’側翼區和50kb的3’側翼區的人α-乳清蛋白基因可以獲得不受位置效應影響的穩定表達，但是只含有20kb的5’和20kb的3’側翼區的轉基因表達會受到位置效應的影響。2003年劉思國等人利用人α-乳清蛋白基因7.3kb的5’端調控區，2.0kb的編碼區以及227bp的牛生長激素3’端調控區構建載體，在五只轉基因小鼠中，僅有一只小鼠能檢測到人α-乳清蛋白的表達(0.3mg/ml)，表明這個表達載體并不是很理想。
人α-乳清蛋白除了具有重要的營養價值之外，還具有殺菌作用，以及治療腫瘤的功能。由于目前人α-乳清蛋白主要從人奶中提純，來源有限，因此利用轉基因動物特別是大家畜生產重組人α-乳清蛋白，將具有重要的應用前景。克隆技術的日趨成熟，不僅使動物轉基因技術得到了更充分的發展和補充，也使利用乳腺生物反應器大規模生產各種重要的功能蛋白更加現實。采用基因組DNA作為目的基因制作轉基因動物要比cDNA序列的獲得更高效率的表達[5]，但過大片段又不便于基因操作，因此獲得高效表達的小結構轉基因載體有著重要的意義。到目前為止，還不曾見到有α-乳清蛋白全基因組DNA的轉基因報道。
發明內容
本發明針對上述領域中的空白，通過轉基因、細胞轉染技術和體細胞克隆技術相結合，提供一種轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜生產方法，為我們實現牛奶人乳化及開發出重組人α-乳清蛋白保健品及藥品奠定基礎。
本發明提供了一種轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜生產方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因結構構建乳腺特異表達載體，(2)構建人α-乳清蛋白乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體的串聯結構，將此串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)利用轉基因細胞為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有人α-乳清蛋白的轉基因克隆大型家畜。
所述乳腺特異表達載體含有全長9459bp的人α-乳清蛋白基因序列，由6.9kb的人α-乳清蛋白基因5’側翼區、2.4kb的人α-乳清蛋白基因編碼區和159bp的人α-乳清蛋白基因3’側翼區組成。
所述的雙標記選擇載體以增強型綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因為標記選擇基因。
所述串聯結構DNA為phLa4-EGFP-NEO。
所述導入方法為電穿孔轉染法。
所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
所述大型家畜為牛。
本發明將在小鼠乳腺中得到高效表達的phLa4表達載體連接上雙標記選擇載體pEGFP-NEO構建成phLa4-EGFP-NEO。利用電擊轉染及G418篩選取出轉基因細胞，再進行單克隆培養。利用體細胞克隆技術獲得轉基因克隆牛，經PCR和Southern檢測，共獲得三頭轉有phLa4-EGFP-NEO的轉基因克隆牛。這些轉基因牛乳腺中均能表達具有天然活性的重組人α-乳清蛋白，表達水平為1.10-1.55克/升。這些轉基因奶牛乳腺特異表達的重組人α-乳清蛋白將可以開發成保健品和藥品，含重組人α-乳清蛋白的牛奶也可直接開發成高附加值的保健牛奶及奶制品。
本發明探索和完善了細胞轉染技術和體細胞克隆技術相結合生產攜帶外源功能基因(目的基因自身調控元件)的轉基因動物的途徑，并極大提高了轉基因動物，特別是轉基因大家畜的制作效率，本發明所使用的技術路線適用于轉基因牛、山羊、綿羊、豬和兔的基礎群生產和擴繁。
圖l人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4結構模式2雙標記選擇載體pEGFP-NEO的結構圖EGFP為增強綠色熒光蛋白基因，NEO為新霉素抗性基因，IRES為核糖體結合位點，SalI，NotI，AscI和BamHI為酶切位點，CMV-IE Enhancer為CMV-IE增強子，pEF321為EF了21啟動子。
圖3phLa4-EGFP-NEO酶切后的線性圖譜human alpha-lactalbumin為人乳清α-乳清蛋白基因，GFP為增強綠色熒光蛋白基因，Neomycin為新霉素抗性基因，SalI，NotI，BamHI和MluI為酶切位點，Ampicillin為氨芐青霉素抗性基因圖4hLA5’端引物的擴增結果.
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉基因克隆牛；5陽性對照；6陰性對照；7blank.
圖5hLA3’端引物的擴增結果.
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃4非轉基因克隆牛；5陽性對照；6陰性對照；7blank.
圖6GFP引物的擴增結果.
M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉基因克隆牛；5陽性對照1；6陽性對照2；7陰性對照；8Blank圖7NEO引物的擴增結果M1kb ladder；1興娃；2隆娃；3會娃；4非轉基因克隆牛；5陽性對照1；6陽性對照2；7陰性對照；8Blank圖8hLA轉基因克隆牛的Southern結果.
泳道1為興娃，泳道2為隆娃，泳道3和4為陰性對照，泳道5-7分別為1，2和5個拷貝的陽性對照.
圖9興娃、隆娃和會娃及對照牛乳樣非減性PAGE電泳圖，泳道1HLA標準品，2人乳，3興娃乳樣，4隆娃乳樣，5會娃乳樣，6雙標載體轉基因牛乳樣，7克隆牛乳樣，8普通牛催乳樣，9普通牛正常產乳樣，圖10興娃、隆娃和會娃及對照牛乳樣Western雜交結果，泳道1HLA標準品(14.1kD)，2人乳，3興娃乳樣，4隆娃乳樣，5會娃乳樣，6雙標載體轉基因牛乳樣，7克隆牛乳樣，8普通牛催乳樣，9普通牛正常產乳樣。
圖11重組和天然人α-乳清蛋白促進乳糖合成能力比較圖，S1-3為人α-乳清蛋白標準品，XW，LW和HW代表興娃，隆娃和會娃樣品。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1實驗材料1.1質粒及菌株宿主菌大腸桿菌DH5α和DH10B，pGEM-5Zf，pGEM-T購自Promega公司，pCMV-EGFP-IRES-NEO和pIRES-NEO購自Clontech公司1.2實驗動物Holstein奶牛約3月齡的胎兒取自屠宰場，黃牛卵巢來自北京周邊地區屠宰場。
1.3主要試劑DMEM/F12粉末、DMEM粉末培養基、臺盼藍(trypan blue)、TCM199粉末，谷氨酰胺和G418為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；dNTP以及PCR引物購于上海生物工程公司；Taq酶購于中國農業大學農業生物技術實驗室；內切酶SspI和BamHI為華美生物工程公司產品；IPTG、X-gal、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、匙孔血藍蛋白(KLH)均購自華美生物公司；飽和酚為鼎國生物工程公司產品；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素、EDTA、Hepes、FSH，LH，17β-E2，EGF，透明質酸酶，HEPES，無脂肪酸BSA，細胞松弛素B，Hoechest33342，cycloheximide，A23187，6-DMAP，D-甘露醇，丙酮酸鈉，肝素鈉，礦物油和其它無機鹽均為Sigma公司產品。
1.4培養基的配制SOB培養基配置每升培養基，應在950ml去離子水加入蛋白胨20g酵母提取物5g NaCl0.5g.搖動容器室溶質完全溶解，然后加入250mmol/L KCl溶液10ml，用5mol/L NaOH調節到pH7.0。滅菌LB液體培養基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，調節PH值至7.5，定容制1000ml，高壓滅菌。
LB固體培養基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶于800ml水中，加脂粉15g，調節pH值至7.5，定容至1000ml，高壓滅菌。
1.5試劑的配制DMEM培養液DMEM粉末13.4g，NaHCO33.7g，青霉素66mg，鏈霉素100mg，Mill-Q超純水定容到1升，PH7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。使用時加10％的血清。
0.1％Trypsin/EDTA酶消化液Trypsin0.1g，KCl 0.04g，NaHCO3，NaCl 0.8g，EDTA 0.02g，用滅菌的Mill-Q超純水溶解，定容至100ml，用0.2μm濾膜過濾滅菌，-20℃保存。
DPBS液DPBS粉未9.7g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.2，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
無鈣鎂PBS溶液KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO412H20 2.88g，Mill-Q超純水定容到1升，PH 7.0-7.4，滲透壓為280-320mOsm/kg，用0.2μm濾膜過濾滅菌，4℃保存。
Gimsa母液Gimsa粉末0.5g，加少量甘油將Gimsa粉末在研缽中充分研磨。再加入甘油至總量為22ml，56℃保溫2h，然后再加入33ml甲醇，保存在棕色試劑瓶中，備用。
細胞裂解液10mM Tris.Cl(PH8.0)，0.1M EDTA(PH8.0)，0.5％SDS。
蛋白酶K貯存液蛋白酶K100mg，溶于5mL滅菌水中，分裝，-20度保存。
TBS液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tris.Cl 3.0g，溶于1L重蒸水中，高壓滅菌。
G418貯液1g G418溶于1mL 1mol/mL HEPES溶液中(PH7.0-7.2)，加Mill-Q10mL，過濾滅菌，-20度保存。
兩倍電擊緩沖液(2×HeBS)280mM Nacl、10mM Kcl、1.5mM Na2HPO4、12mM Glucose、50mM Hepes，PH7.0-7.4，過濾滅菌，1mL分裝，-20度保存。
1Mol/L Tris.Cl(pH8.0)121.1gTris堿溶于800ml水中，用HCl調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5Mol/L EDTA(pH8.O)126.1g乙二胺四乙酸二鈉加入到800ml水中，用NaOH調PH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
RNase溶液將RNaseA溶于10mMol/L Tris.Cl(pH7.5)，5mMol/L NaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。
TE緩沖液10mMol/L NaCL，10mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mMol/L EDTA(pH8.0)，高壓滅菌。
5mol/L LiCl30.2g氯化鋰二水(LiCl.2H2O)完全溶于80ml水后，定容至100ml高壓滅菌。
50×TAE242gTris堿，57.1ml冰乙酸，100ml0.5Mol/L EDTA(pH8.0)，溶解后定容至1000ml。氨芐青霉素(Amp)貯存液將氨芐青霉素鈉溶于滅菌水后用0.22μm的濾器過濾除菌，配制成100mg/ml，保存于-20℃。
3mol/L NaAc(pH5.2)24.604g無水乙酸鈉溶于80ml水中，用冰乙酸調節pH值至5.2，定容至100ml，高壓滅菌。
lmol/L CaCl2在200ml水中溶解54gCaCl2.6H2O，過濾除菌，分裝成10ml每份，貯存于-20℃，制備感受態時取出一份稀釋至100ml，過濾除菌，預冷備用。
溴化乙錠貯存液在100ml水中加入1g溴化乙錠，溶解后于4℃棕色瓶內保存。
DNA提取抽提緩沖液50mMol/L Tris.Cl(pH8.0)，100mMol/L EDTA(pH8.0)，100mMol/LNaCl，1％SDS。
2×Cracking buffer0.2N NaOH，0.5％SDS，20％蔗糖。
酚∶仿(1∶1)等體積苯酚、氯仿混合，保存于4℃棕色瓶中。
表1 聚合結果
15)測序儀ABI 377型DNA sequencer，美國PERKIN ELMER公司16)恒溫水浴儀美國LIFESCIENCE公司17)9700型PCR儀美國PERKIN ELMER公司18)ABI 377 DNA測序儀美國PERKIN ELMER公司1.7分析工具軟件及網址同源性分析軟件DNAMANPCR引物設計軟件Oligo6.0DNA序列分析軟件ChromasDNA及蛋白序列數據庫NCBI/GenBank/Nucleotides，Protein2實驗方法2.1轉基因表達載體的構建根據GeneBank序列(X05153)設計引物F1(上游)5’GAGTGATGCTTCCATTTCAG3’F2(下游)5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’。擴增人α-乳清蛋白基因5′端非編碼區與第一內含子之間(包含第一外顯子)的790bp的片段，反應條件94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環，72℃7min。
利用這對引物從Clontech laboratories.Inc.公司粘粒文庫中篩選出含有人α-乳清蛋白基因的克隆(命名為phLa1)。利用NotI和NdeI雙酶切陽性克隆，回收8.5kb的片段，與pGEM-5Zf載體相連，得亞克隆hLa2。將末端測序結果與已知序列比較分析，發現這個克隆缺少包括部分第二內含子至第四外顯子在內的大約1kb的片段。為獲得完整的α-乳清蛋白基因，以人基因組DNA為模板擴增得到其3’端缺少的片段。設計引物F4-F5，同時在引物5’端分別添加一個酶切位點(F4 BglII，F5 NotI)和一個保護堿基T。F4(上游)5’-TAGATCTAGGGGTTAGGGGAACT-3’F5(下游)5’-TGCGGCCGCATTGAGTTGGTACAGACAGT-3’反應條件94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環，72℃7min。F4位于基因下游1375bp處，F5位于基因下游2521bp處，擴增1146bp的片段。將人α-乳清蛋白基因3′端的PCR擴增產物與pGEM-T載體相連，得到克隆phLa3，用BglII和NotI酶切該克隆，回收1.1kb的片段，并將此片段與BamHI和NotI雙酶切過的phLa2片段相連，即得到人α-乳清蛋白全基因克隆phLa4，酶切及測序鑒定其正確性。我們所構建的phla4載體含人α-乳清蛋白基因共9459bp，其中包括6.9kb的5’側翼區、2.4kb的編碼區和159bp的3’側翼區。其結構模式如圖1。
2.2phLa4-EGFP-NEO表達載體構建1).phLa4標記表達載體的構建策略為了便于篩選陽性細胞，我們首先構建了含綠色熒光蛋白基因(EGFP)和新霉素基因雙選擇標記載體(pEGFP-NEO)以及新霉素基因單選擇標記載體(pNEO)，然后分別將兩個標記載體與此前構建的pBC-hLa載體連接構建成phLa-EGFP-NEO和phLa-NEO表達載體。
1)pEGFP-NEO的構建用NotI和SalI酶切pBCl回收約6kb的片斷，連接一個依次含SalI，BamHI以及NotI的Linker，構建成pXM，用BamHI和NotI酶切pCMV-EGFP-IRES-NEO并回收4kb片斷EGFP-IRES-NEO，同時用BamHI和NotI酶切pXM，并與EGFP-IRES-NEO連接即構成pEGFP-NEO，如圖2。
2)phLa4-EGFP-NEO表達載體構建用NotI和SalI酶切phLa4和pEGFP-NEO，將兩者連接即構成phLa4-EGFP-NEO，通過酶切及測序分析，確定phLa4-EGFP-NEO載體構建成功，載體圖如下(圖3)2.3細胞培養，基因轉染及陽性細胞篩選2.3.1胎兒成纖維細胞的原代培養在超凈工作臺中將胎兒浸泡在70％酒精中30sec，用PBS漂洗幾遍，以消毒過的手術器械取下耳部及脊背部的數塊表皮組織于DMEM+10％FCS培養液里。
↓在直徑60mm平皿中將胎兒組織切碎成為1mm3大小的組織碎塊，再將組織碎塊轉移至15ml離心管中，1000rpm下離心洗滌數次。
↓用消毒玻璃彎頭吸管將小組織碎塊吸至25cm2培養瓶中，通過玻璃吸管彎頭使組織塊均勻分布在瓶壁上。
↓小心翻轉培養瓶(防止組織塊落下)讓組織塊黏附于瓶壁上，置于37度，5％CO2培養箱中放置2～4h，待組織塊貼壁后，再正置培養瓶，補加適量培養液繼續培養。
2.3.2胎兒成纖維細胞的傳代、冷凍、及復蘇待種植的原代細胞生長至80％匯合時，將細胞一部分冷凍，一部分傳代繼續培養。
2.3.2.1傳代用消毒玻璃彎頭吸管小心吸除培養瓶中的培養液，沿著細胞生長壁的對面瓶壁注入無鈣鎂PBS(37度溫育)沖洗細胞兩次，以祛除殘余血清及細胞代謝物。
↓用同樣方法加入0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液，加入量為可覆蓋細胞單層即可(直徑100mm培養皿一般加入1ml消化液，35mm培養皿中加入200u L消化液)，放入培養箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，待細胞開始變圓時，用手指敲打培養皿壁，使細胞徹底脫壁，然后加入培養液終止消化。
↓用消毒玻璃彎頭吸管反復吹打，細胞，使其分散成為單個細胞，1000rpm下離心5min收集細胞。用培養液按1∶2或1∶3比例稀釋并重新接種細胞至培養皿中培養。
2.3.2.2冷凍貼壁細胞消化后，收集細胞于離心管中，在1000rpm下離心5min以去盡上清。
↓加4度預冷的冷凍液(DMEM+20％FCS+10％DMSO)重懸細胞沉淀，使細胞濃度約為107個細胞/ml，轉移細胞至凍存管中。
↓放入4度冰箱預冷30min，再把凍存管插于厚泡沫上后置于液氮液面熏蒸2h，然后迅速投入液氮保存。
2.3.2.3復蘇從液氮中取出凍存管，快速投入37度水浴中，并在水浴中不斷快速搖動凍存管以迅速解凍。
↓待冷凍液徹底解凍后，以新鮮培養液稀釋10倍并將溶解液轉移至離心管中，在1000rpm下離心5min去除DMSO以緩減冷凍液毒性。
↓用新鮮的培養液懸浮細胞沉淀，將細胞稀釋至所需濃度，繼續培養。
2.3.3體細胞注射用DNA的準備大提質粒phLa4-EGFP-NEO和phLa4-NEO，以SalI酶切質粒，酶切反應如下質粒DNA 約10-20μg10×反應buffer 20μl限制性內切酶10-20UddH2O 補足體系至200μl上述試劑加好后，混勻，37度水浴消化2h，取5μL酶切產物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，若酶切完全，加酚、酚/氯仿各抽提一次，加2倍體積無水乙醇和0.1倍體積乙酸鈉(PH5.2)，混勻后置-20度過夜；12000rpm離心15min回收沉淀，70％乙醇洗滌一次，真空干燥，加TE溶解。
2.3.4牛胎兒成纖維細胞對G418毒性敏感性檢測細胞培養到第3代后用0.25％胰蛋白酶消化，按每孔0.5～1×105個細胞接種到13個直徑35mm培養皿中以使細胞盡量分散。次日在其中12孔中以100μg/ml的梯度依次加入終濃度從100μg/ml到1200μg/ml的G418，還有一孔中不加入G418作為對照。連續培養三周，每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡情況。
2.3.5電擊轉染轉染前將10～50μg純化回收的DNA融入500μl 2×HeBS中，補充滅菌超純水至1ml，冰浴預冷。
↓在轉染前2～3天，用0.25％胰蛋白酶溶液消化培養細胞。將1×106個細胞轉接于75cm2培養瓶內，加入完全培養液，置37度、5％CO2培養箱中培養。
↓轉染前，在倒置顯微鏡下觀察培養的細胞，確定細胞處于對數生長后期。用0.25％胰蛋白酶溶液消化細胞，1000rpm離心5min沉淀細胞。
↓將細胞沉淀用冰浴預冷的1×HeBS離心洗滌1次，同時進行細胞計數。
↓將一定數量的細胞重新懸浮于加有DNA的電極緩沖中，混合均勻后轉入電擊杯中，在電擊前冰浴10min。
↓當細胞準備好進行電擊時，設置電場強度(E)和脈沖時間(t)，先試一下，確保產生了所需的脈沖。將電擊杯插入電擊槽中，按照選定的電場強度(E)和脈沖時間(t)，電擊細胞。
↓將經電擊后的細胞冰浴10min后轉入75cm2的培養瓶中，加入含20％FCS的DMEM培養液中于37度、5％CO2培養箱中培養。
↓1-2天后待細胞生長狀態恢復，將細胞擴大10倍培養，加入適量的G418進行篩選。
↓每3～4天換液一次，同時補加G418。每天觀察細胞生長或死亡情況。6-10天后，挑選陽性克隆細胞。
2.3.6陽性細胞的單克隆培養在熒光顯微鏡下觀察上述方法所得細胞克隆的發光情況，用記號筆圈住分散良好(遠離其它克隆)且細胞數量多的熒光克隆；吸除培養液，用無鈣鎂PBS漂洗細胞二次，在高倍解剖鏡下，將30-50ul 0.25％胰蛋白酶消化液滴加在標記好的細胞克隆上，待克隆的大多數細胞收縮脫壁后，不等細胞懸浮，快速吸取細胞克隆，但注意不要吸入附近其它克隆的細胞；轉移細胞到加有500μl培養液的四孔板中，吹打分散細胞團塊；挑出的克隆繼續培養，降低G418濃度至300μg/ml維持篩選；待克隆細胞數量擴大后或匯合后，將一部分細胞轉移到35mm培養皿中繼續擴大培養，另一部分用于轉基因檢測，其它擴大后的細胞盡早冷凍。
2.4轉基因體細胞克隆
2.4.1卵母細胞的成熟培養從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2～8mm的卵泡，回收形態均勻、結構致密的卵丘-卵母細胞-復合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/ml bFSH+0.01U/mlbLH+Iμg/ml estradiol)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞-復合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養箱中成熟培養18～20h后，將成熟的卵母細胞放入0.1％透明質酸酶的管內振蕩2～3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻并排出第一極體的卵母細胞為體細胞核受體.
2.4.2卵母細胞的去核將帶有第一極體的卵母細胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/ml細胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養箱中備用.
2.4.3移核與融合將血清饑餓2～4d的供體細胞用0.25％trypsin消化2～4min，選擇直徑為10～12μm的體細胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細胞透明帶內，然后將其放入Zimmerman液[15]中平衡3～5min后放入融合槽內，轉動卵細胞使供體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5kV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進行下一步激活處理.
2.4.4重構胚的激活與培養將重構胚放入5μmol/L Ionomycin(Sigma)液中，4min后換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養箱中培養2d后觀察分裂率，7d后觀察囊胚發育率2.4.5胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d的克隆囊胚移入已同期的受體母牛的子宮角內.受體母牛選擇的都是經產母牛，其中紅系冀南黃牛的克隆胚胎被移入Holstein奶牛，Holstein奶牛的克隆胚胎被移入魯西黃牛.在移植后的第60d進行直腸檢測，以確定妊娠率.
2.5轉基因克隆的PCR和Southern鑒定2.5.1PCR檢測為了確證phLa4-EGFP-NEO轉入牛基因組中，對于hLa4，我們設計了兩對引物，引物1序列為，上游5’GAG TGA TGC TTC CAT TTC AG 3’，下游5’CAGAGATGTACAGGATCTGC 3’；反應條件為94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環，72℃7min；產物長度為790bp；引物2序列為，上游5’-TAG ATC TAG GGG TTA GGG GAA CT-3’下游5’-TGCGGC CGC ATT GAG TTG GT ACA GAC AGT-3’反應條件94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30個循環，72℃7min；產物長度為1146b。
于EGFP基因，引物序列為上游5`TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC 3`下游5`CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG 3`。PCR條件94℃5min；94℃40sec，62℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，產物長度為380bp。
對于NEO基因，引物序列為上游5`AGG ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTCCTG 3`下游5`AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3`。PCR條件94℃5min；94℃40sec，60℃40sec，72℃40sec，30cycles；72℃7min，4℃1∞，產物長度為490bp。
由于人α-乳清蛋白基因長約10kb，因此我們分別在其5’端和3’端設計一對引物，從圖4和圖5可以看出，克隆牛興娃、隆娃和會娃轉有完整的人α-乳清蛋白基因。從圖6和圖7則可以看出，這三頭克隆牛同時雙標記選擇載體。
2.5.2Southern檢測取PCR檢測為陽性的轉基因克隆牛DNA約10μg用EcoRI消化，低壓慢速電泳，轉膜后，進行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標記的1.5kb的hLA基因片段。以phLa4-EGFP-NEO質粒為陽性對照，以非轉基因克隆牛基因組為陰性對照，雜交可得到1.5kb片段，如圖8所示進一步確定了興娃和隆娃轉有人乳清蛋白基因，可以估計興娃和隆娃轉有1個拷貝的人α-乳清蛋白基因，根據轉基因小鼠結果，可以推測這兩頭轉基因牛將能在乳腺中高效表達人α-乳清蛋白.
2.6轉基因牛重組人α-乳清蛋白表達及活性分析2.6.1藥物催乳以西安草灘藥廠生產的催乳針按1/4劑量對6-8月齡的轉基因克隆牛進行藥物催乳，同時以雙標記載體轉基因克隆牛、普通克隆牛、同月齡普通黑白花奶牛作為對照進行催乳，還以普通牛奶為對照，每天收集3次奶樣，共收集兩周。
2.6.2轉基因牛奶的PAGE電泳、Western和放免測定對轉基因牛的乳樣用重蒸滅菌水稀釋三倍，進行去乳脂、去酪蛋白的處理，最后得到乳清部分。α-乳清蛋白即存在于乳清中。對轉基因牛奶樣和對照乳樣進行脫脂和去酪蛋白后，用減性(reducing)SDS上樣Buffer變性的PAGE膠進行電泳，結果如圖9。從此圖可以看出三頭轉基因牛奶樣有一條與人α-乳清蛋白標準品大小一致的特異條帶。用兔抗人α-乳清蛋白抗體進行Western雜交，結果如圖10。從Western結果可以看出三頭轉基因牛奶樣和人奶有一條與α-乳清蛋白標準品大小一致的特異條帶，表明轉人α-乳清蛋白基因的轉基因牛乳腺中能表達完整的重組人α-乳清蛋白。
利用放射性免疫法檢測轉基因牛奶樣中重組人α-乳清蛋白的表達量。人α-乳清蛋白標準品用125I用氯胺—T法標記，取6個時間點的乳樣進行檢測。測得乳樣中重組人α-乳清蛋白的表達量平均值為1.10-1.55g/l，表明我們所使用的具有完整自身調控區的人α-乳清蛋白基因結構可以在轉基因牛乳腺中高效表達完整的重組人α-乳清蛋白。
2.6.3重組人α-乳清白蛋白生物活性檢測α-乳清白蛋白可以改變β-1，4-半乳糖苷轉移酶底物的特異性，使乳糖能在生理條件合成。在缺乏α-乳清白蛋白的情況下，β-1，4-半乳糖苷轉移酶催化UDP-半乳糖與N-乙酰葡萄胺結合，合成N-乙酰乳糖胺和UDP，化學反應式如下。
而加入α-乳清白蛋白后，可以提高β-1，4-半乳糖苷轉移酶對葡萄糖的底物結合能力，化學反應式為。
為了鑒定重組的人α-乳清白蛋白是否具有此活性，進行體外驗證。在此反應體系下100ul溶液中加入5.78mU GTase，50mM Hepes (pH6.63)，0.0245％Triton X-100，0.0245％BSA，9mM MnCl2，25mM Glucose，0.4mM UDP-Galactose，10μl重組alpha-lactalbumin，37℃反應2小時，合成乳糖。用乳糖檢測試劑盒檢測乳糖的合成。結果如圖11所示，重組蛋白同樣可以合成乳糖，表明重組α-乳清白蛋白具有天然生物活性。
附1SEQ ID NO 1完整的人α-乳清蛋白基因序列，序列圖如下包括6.9kb的5’側翼區和159bp的3’側翼區，全長9459bp；四個外顯子及三個內含子，其中6937-7185為第一外顯子，7743-7911為第二外顯子，8390-8465為第三外顯子，8965-9297為第四外顯子。
1 ATATGAACTT TAAAGTAGTT TTTTCCAATT CTGTGAAGAA AGTCATTGGT AGCTTGATGG61 GGATGGCATT GAATCTATAA ATTACCTTGG GCAGTATGGC CATTTTCACG ATATTGATTC121TTCCTACCCA TGAGCATGGA ATGTTCTTCC ATTTGTTTGT ATCCTCTTTT ATTTCATTGA181GCAGTGGTTT GTAGTTCTCC TTGAAGAGGT CCTTCACGTC CCTTATAAGT TGGATTCCTA241GGTATTTTAT TCTTTTTGAA GCAATTGTGA ATGGGAGTTC ACTCATGATT TGGCTCTCTG301TTTGTCTGTT ATTGGTGTAT AAGAATGCTT GTGATTTTTG TACATTGATT TTGTATCCTG361AGACTTTGCT GAAGTTGCTT ATCAGCTTAA GGAGATTTTG GGCTGAGACG ATGGGGTTTT421CTAGATATAC ATTCATGTCG TCTGCAAAGA GGGACAATTT GACTTCCTCT TTTCCTAATT481GAATACCCTT TATTTCCTTC TCCTGCCTAA TTGCCCTGGC TAGAACTTCC AACACTATGT541TGAATAGGAG TGCTGAGAGA GGGCATCCCT GTCTTGTGCC AGTTTTCAAA GGGAATGCTT601CCAGTTTTTG CCCATTCAGT ATGATATTGG CTGTGGGTTT GTCATAGATA GCTCTTATTA661TTTTGAGATA CGTCTCATCA ATACCTAATT TATTGAGAGT TTTTAGCATG AAGGGTTGTT721GAATTTTCTC AAAGGCCTTT TCTGCATCTA TTGAAATAAT CATGTGGTTT TTGTCTTTGG781TTCTGTTTAT ATGCTGGATT ACATTTATTG ATTTGTGTAT ATTGAACCAG CCTTGCATCC841CAGGGATGAA GCCCACTTGA TCATGGTGGA TAAGCTTTTT GATGTGCTGC TGGATTCGGT901TTGCCAGTAT TTTACTGAGG ATTTTTGCAT CAATGTTCAT CAAGGATATT GGTCTAAAAT961TGTCTTTTTT GGTTGTGTCT CTGCCAGGCT TTGGTATCAG GATGATGCTG GCCTCATAAA
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5221TAACGATATG GAAGACCTTC AGTATGTAAG TCTTAAATAG ATTGGTTGGG ATAAATGTTC5281CCTGAAACAT AAGAAACAGC GCAGCGGCTC CTGTCTGTAA TCCTAGCACT TTGGGAGGCC5341GAGGCCCAGG CAGGCAAATT GCCTGAGCTC AGAAGTTTGA GACCAGCCTG GCCAACATGC5401AGAAACTCCG TCTCTACTAA AAATACATAA ATTAACCGGG CATGGTAACA CGTGCCTGTA5461GTCCCAGCTA CTCGGGAGGC TGAGGCAGGA GAATCACTTG AGCCTGGGAG GCAGAGGTTG5521CAGTGAGCCA AGATCGCGCC ACTGCATTCC AGCCTGGGCA ACAGAGTGAG ACTTGGTCAA5581AAAAAAAAAA AAAAAAGGAA GAAGAAGAAG AAATCAGGTT TAGAGATGAG GACAAAGAAG5641ACGAATGGTG GCATGAAGGA GCTAAGAGCT ACTTGTCACC ATGACATGAA GCTTCATGCC5701AGCAAATTAA AGGAGCTATT CAGAACTAGT ATCCTCAACT CTACTTGCTC AGGGGCACTG5761ACCTTATAGA GATTCCAGAC ATAAGCTTGT TCAGCCTTAA AGTCCAATCT TTCCACTGGC5821TTGGGTCCTT CCCACTTTCT GTGGCCAACT CTGAGGTTGT CTACAAGTTA TTGGTCTTAG5881ATTTATGTAA TGTCTCAATG CCAGTGTAGT ATTTGGTTAT TTACGGTAGG AGTGGTTAGG5941GGTGGGGAAT CTGATAATAG CTCGTAGGAT AGCTAGATTC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT6001TAAAGATAGG GTCTCACTTT GTCTCCCAGG ATGGATGGAG TGCAGTGGAG TGAACATGGC6061TCACTGCAGC CTCGACCTCC TGTGCTCAAG TGTTCCTCCT GCCTCAGCCC CTCAAGTAGC6121TGGGACTACA GGCACATGTC ACCATGCCCA GCTAATTTTT TTTGTAGAGA TGGGATTTTA6181CCATGTTGCC CAGGCTGGTC TCGAGCTCCT GGGCTCAAGT GATCCACCAG ACTCGGCCTC6241CCAAAATGCC GGGATTACAG GTGTGAGCCA CTGTGCCTGG CCTAGATGCT TTCATACAGG6301CTTTTCAATT ATGCATTTTC CTTAAGTAGG AAGTCTTAAG ATCCAAGTTA TATCGGATTG6361TTGTAGTCTA CGTTCCCATA TTCTATTCCT ATTTCTGAGC CTTCAGTCAT GAGCTACCAT6421ATTAAAGAAC TAATTCTGGG CCTTGTTACA TGGCTGGATT GGTTGGACAA GTGCCAGCTC6481TGATCCTGGG ACTGTGGCAT GTGATGACAT ACACCCCCTC TCCACATTCT GCATGTCTCT6541AGGGGGGAAG GGGGAAGCTC GGTATAGAAC TTTATTGTAT TTTCTGATTG CCTCACTTCT6601TATATTGCCC CCATGCCCTT CTTTGTTCCT CAAGTAACCA GAGACAGTGC TTCCCAGAAC6661CAACCCTACA AGAAACAAAG GGCTAAACAA AGCCAAATGG GAAGCAGGAT CATGGTTTGA6721ACTCTTTCTG GCCAGAGAAC AATACCTGCT ATGGACTAGA TACTGGGAGA GGGAAAGGAA6781AAGTAGGGTG AATTATGGAA GGAAGCTGGC AGGCTCAGCG TTTCTGTCTT GGCATGACCA6841GTCTCTCTTC ATTCTCTTCC TAGATGTAGG GCTTGGTACC AGAGCCCCTG AGGCTTTCTG6901CATGAATATA AATAAATGAA ACTGAGTGAT GCTTCCATTT CAGGTTCTTG GGGGTAGCCA6961AAATGAGGTT CTTTGTCCCT CTGTTCCTGG TGGGCATCCT GTTCCCTGCC ATCCTGGCCA7021AGCAATTCAC AAAATGTGAG CTGTCCCAGC TGCTGAAAGA CATAGATGGT TATGGAGGCA7081TCGCTTTGCC TGAATGTGAG TTCCCTGCCT CTGTGTTTCA TCCATTCCTC ATACGCTTCT7141CTCCTCCATC CCCTCTTTCT TCCACTTCGC CCCTCCACTT TTACTTAATT ATCTAATCAT7201CCTCTTTTCT GCTCATTTGC ATACTCTTTT ATTTCATGTA TGTATATATG TATGTATTTA7261TTTATTTTTG AGGTGGAGTT TCGCTCTTGT TGCCCAGACT GGAGTGCAAT GGTGTAATCT
7321CGGCTCACTG CAACCTCCGC CTCCTCGGTT CAAGTGATTC TCCTGCCTCA GCCTCCCAAG7381TAGCTGGAAT TACAGGCACC CACCACCATG CCTGGCTAAT TTTGTATTTT TTGTAGAGAC7441AGGGTTTCAC CATGTTGGCC AGGCTGGTCT CAAACTTCTG ACCTCAGGTG ATCCGCCCTC7501CTCAGCCTCC CAAAGTGTTG GGATTACAAG CGTGAGCCAT CATGCCTGGC CCCATTTATT7561TTCCTATCCT TTCTTTCTCT TATTGTCTGA TTTTTTTTTG GAATTCTCCA TCTCATCAAG7621AAACTCTGAG CTTTGCCATC TTTGGAGATT GGCTGGAAAG CATTTTTGTC TGAGAATTAC7681AGTTCCTCCT TTATGCAGAT CCTGTACATC TCTGTGGTAT CTCTTTCTCA TCTTTCCCTC7741AGTGATCTGT ACCATGTTTC ACACCAGTGG TTATGACACA CAAGCCATAG TTGAAAACAA7801TGAAAGCACG GAATATGGAC TCTTCCAGAT CAGTAATAAG CTTTGGTGCA AGAGCAGCCA7861GGTCCCTCAG TCAAGGAACA TCTGTGACAT CTCCTGTGAC AGTGAGTAGC CCCTATAACC7921CTCTTTCTCT GTTTTTCTGA GGCCTGCCCT TGGGATAATC TCCTTTTTAG TGCCAAGCAG7981ACCTCAGGCT TCATTGCCTT GGCTGGGCTC TATAAAAATT GTGGGACTTG AATTGGCAGT8041ACTGAGTAAG AAGCTGTTTG GATTTTTCAT GGTCATCAAA TCCCCAGACA GTTCCTTGAG8101GTTCAGTGGT AGACAATCGG AGCTGTCTGA GAGTCTTGGA ATCTGATTGT CTGCATTTTC8161AGGGTAAGTC AGTTGATGAA GCTGATGATT CCTCCAGAGA TATCCCAGGG AAATGAAGGA8221AGTCCCTACC CAGGGTTAGA CATTACCACA TTGGTCCTTT CATATAGAAA GACAACAGGC8281ACAAGCCTTG AGTTTAGAGA ACCCACTGGA TCAGGGGTTA GGGGAACTCA GTGCCTTTCT8341GGGTAATACT TGTCAGCTGT CTCAATCCTT TCCCTGTAAC TCCTGCCAGA GTTCCTGGAT8401GATGACATTA CTGATGACAT AATGTGTGCC AAGAAGATCC TGGATATTAA AGGAATTGAC8461TACTGGTGAA TCCTTATTCT ATTTTCTATT TCCCCATCCT CCTTCTCCTT ACCCCATTAG8521CCCAGCACCC CTTTCCTCTT ACCCTATCTC TTGGTCATTT AATCTAGAAT ACAGTGTCTG8581AAACAAAGCT TACCTAGAGA CTCAGGTTTC TGTTATTAAG CCTCTCTCGC TCCGCTCCTT8641GGTAGCAATT TTCCTAATAA GGGGTTGCCT AATGGAGGGC TCAGACCCAG GCCTCCTTTC8701ACTTAGACTT GGACATCTAA TTCCACTTGT TTAGTTCTAT GCCCTAAAGC AAGCTGTTGG8761TAACATTGCA TCTCTTTTTT AACCCTACAA TTTTCTTGGA TATTTTTTAT GGACTGTATT8821CCACTTGATG GCTTGTGTCG CTTGACATCA GGCCAGGAAT GTCTTTCTGT AATTCTCGTC8881CACGCTCTTC CACTTCAGCC CTCCTGGGAA TGAATGTAAA GATTCAGTCA GCTAACTCAC8941CTTGTCCCCC TTCTCCATTA TCAGGTTGGC CCATAAAGCC CTCTGCACTG AGAAGCTGGA9001ACAGTGGCTT TGTGAGAAGT TGTGAGTGTC TGCTGTCCTT GGCACCCCTG CCCACTCCAC9061ACTCCTGGAA TACCTCTTCC CTAATGCCAC CTCAGTTTGT TTCTTTCTGT TCCCCCAAAG9121CTTATCTGTC TCTGAGCCTT GGGCCCTGTA GTGACATCAC CGAATTCTTG AAGACTATTT9181TCCAGGGATG CCTGAGTGGT GCACTGAGCT CTAGACCCTT ACTCAGTGCC TTCGATGGCA9241CTTTCACTAC AGCACAGATT TCACCTCTGT CTTGAATAAA GGTCCCACTT TGAAGTCACT9301GGCTGTAATT TTTTTCCCCC TGGAGGGAAG GGGAAGAAAT AGGATGAGTA GGTGGACACT9361GAAGCCATAG GTCATAGCCA CCTTCCATCT CTACTGAAGA AGAAGTAGGC TGAATTTACA
9421 ATAGAAAGGT GAAGGTTACT GTCTGTACCA ACTCAATGC附2SEQ ID NO 2人α-乳消蛋白一級結構即氨基酸序列，共142個氨基酸，其中前19個為信號肽序列，HLA氨基酸序列圖如下1 MRFFVPLFLV GILFPAILAK QFTKCELSQL LKDIDGYGGI ALPELICTMF51 HTSGYDTQAI VENNESTEYG LFQISNKLWC KSSQVpQSRN ICDISCDKFL101DDDITDDIMC AKKILDIKGI DYWLAHKALC TEKLEQWLCE KL
權利要求
1.一種轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α-乳清蛋白基因結構構建乳腺特異表達載體，(2)構建人α-乳清蛋白乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體的串聯結構，將串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)利用轉基因細胞為核供體進行體細胞克隆，獲得含有人α-乳清蛋白的轉基因克隆大型家畜。
2.根據權利要求1所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其中所述乳腺特異表達載體含有全長9459bp的完整人α-乳清蛋白基因序列，所述完整人α-乳清蛋白基因序列由6.9kb的人α-乳清蛋白基因5’側翼區、2.4kb的人α-乳清蛋白基因編碼區和159bp的人α-乳清蛋白基因3’側翼區組成。
3.根據權利要求1所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，所述的DNA導入方法為電穿孔轉染法。
4.根據權利要求1所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，所述的雙標記選擇載體以增強型綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因為標記選擇基因。
5.根據權利要求4所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，所述串聯結構DNA為phLa4-EGFP-NEO。
6.根據權利要求1所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，所述大型家畜為牛、山羊、綿羊、豬或兔。
7.根據權利要求6所述的轉人α-乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜的生產方法，其中所述大型家畜為牛。
全文摘要
本發明涉及了一種轉人α－乳清蛋白基因的轉基因克隆大型家畜生產方法，其操作步驟如下(1)利用完整的人α一乳清蛋白基因結構構建乳腺特異表達載體，(2)構建人α一乳清蛋白乳腺特異表達載體與雙標記選擇載體的串聯結構，將此串聯結構DNA導入家畜體細胞核內，獲得轉基因細胞，(3)利用轉基因細胞為核供體進行體細胞克隆，獲得轉有人α－乳清蛋白的轉基因克隆大型家畜。這些轉基因奶牛乳腺特異表達的重組人α－乳清蛋白將可以開發成保健品和藥品，含重組人α一乳清蛋白的牛奶也可直接開發成高附加值的保健牛奶及奶制品。
文檔編號C12N15/85GK1850974SQ20061007624
公開日2006年10月25日 申請日期2006年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者湯波, 戴蘊平, 龔國春, 曹更生, 于舒洋, 張磊, 李寧 申請人:李寧