專利名稱：一種培育抗病小麥的方法及其專用基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗病小麥的方法及其專用基因。
背景技術：
抗菌肽是一類廣泛存在于昆蟲、動物和植物體內的小分子活性抗菌多肽。它分子量小，熱穩定性好，具有廣譜抗性(于健，邱芳萍，張玲.抗菌肽及其應用前景.長春工業大學學報[J]，2004，25(1)65-67)。自從1975年瑞典科學家Boman從天蠶蛹中分離到抗菌肽天蠶素cecropin(BomanHG，Hultmark D.Cell-free immurityin insects[J].Ann Rev Microbiol，1987，41(2)103-107)，大量抗菌肽已被逐漸發現、分離和利用。抗菌肽大體分為4類殺菌肽(Cecropin)、蛙皮素(Magainin)、蜂毒素(Melitiny)和植保素(Defensin)。植保素(Defensin)是植物在長期進化過程中為抵御生物逆境而預存的一道天然屏障。迄今為止，已經從蘿卜種子和葉片中分離到4種抗菌肽Rs-AFP，它們為富含胱氨酸的植保素，在體外均表現出不同程度的抗菌活性，其中Rs-AFP1、Rs-AFP2對于蘿卜種子萌發過程中抵御真菌侵染起著重要作用(Terras FRG，Eggermont K，Kovaleva V，et al.Small cysteine-richantifungal proteins from radishtheir role in host defense[J].PlantCell，1995，7573-588)。體外實驗表明，Rs-AFP1、Rs-AFP2對多種絲狀病原真菌生長具有抑制作用，特別是Rs-AFP2在體外抑菌效果更強，能夠強烈抑制小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)的菌絲生長(IC50＝1-3μg/ml)，對粉色面包霉菌(Neurospora crassa)的菌絲生長也有較高的抑制活性(IC50＝1μg/ml)，還對麥類德氏霉菌(Pyrenophora tritici-repentis)、稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)等具有廣譜抗性(Spelbrink RG，Dilmac N，Allen A，et al.Differentialantifungal and Calcium Channel-Blocking activity among structurally relatedplant defensins[J].Plant Physiology，2004，8(135)2055-1067)。2004年支大英等人用農桿菌介導法將Rs-AFP1基因轉入小麥中，初步觀察轉基因株系表現出白粉病延遲發病或發病較對照明顯減輕(支大英，徐春暉，薛哲勇，等.農桿菌介導AFP1基因轉化小麥獲得轉基因植株[J].山東農業科學，2004(3)14-16)。成熟的Rs-AFP1與Rs-AFP2蛋白的氨基酸序列除第5位和第27位外其他氨基酸相同，Rs-AFP1中第5位氨基酸為Glu，而Rs-AFP2第五位氨基酸為Gln，Rs-AFP1第27位氨基酸為Asn，而Rs-AFP2第27位氨基酸為Arg，Rs-AFP2具有更高的正電荷，顯示出更高的抗真菌活性，特別是在高離子強度培養基中此現象尤為顯著，而且Rs-AFP2的生物活性受Ca++的影響很小(Terras FRG，Schoofs HME，De Bolle MFC，et al.Analysis of two novel classes of antifungal proteins fromradish(Raphanus sativus L.)seeds[J].J.Biol.Chem，1992，26715301-15309；Samblanx GWD，Goderis IJ，Thevissen K.Mutational analysis of a plantdefensin from radish(Raphanus sativus L.)Reveals two adjacent sitesimportant for antifungal activity[J].J.Biol.Chem，1997，272(2)1171-1179)。過量表達Rs-AFP2的轉基因煙草明顯抑制煙草赤星病(Alternarialongipes)(Terras FRG，Eggermont K，Kovaleva V，et al.Small cysteine-richantifungal proteins from radishtheir role in host defense[J].PlantCell，1995，7573-588)。
近年，隨著肥水條件的改善和小麥產量水平的提高，小麥土傳病害特別紋枯病在我國小麥生產區危害日益嚴重。小麥紋枯病又稱小麥尖眼斑病(wheat sharpeyespot)，是由禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)AG4，AG5融合群引起的土傳真菌病害。紋枯病一般可使小麥減產10％-20％，嚴重地塊減產50％以上。據江蘇省植保站統計，1995年全省小麥因紋枯病造成的損失達3.72×106噸，超過江蘇省當年小麥赤霉病和白粉病引起損失之和。據全國農技推廣中心報道，2004年我國有1.2億畝遭受紋枯病的危害，2005年小麥紋枯病發生面積達1億畝。小麥紋枯病已對我國糧食安全構成嚴重威脅，成為小麥生產中亟待解決的重要問題。由于土傳病害難以預測和預防，培育和利用抗病品種是防治小麥紋枯病最經濟有效的措施之一。然而，紋枯病抗性是由多個基因控制的數量性狀，小麥種屬內抗源匱乏、遺傳基礎研究薄弱，常規育種進展緩慢。植物基因工程的發展為解決上述問題開辟了一條新途徑。然而，關于利用基因工程獲得抗紋枯病小麥的研究國內外均未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種培育抗病小麥的方法及其專用基因。
本發明所提供的用于培育抗病小麥的基因，名稱為TaRs-AFP2，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴謹條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
所述高嚴謹條件為在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中序列1的核苷酸序列，由243個核苷酸組成，名稱為TaRs-AFP2，自5′端第1-243位為編碼序列。
本發明所提供的培育抗病小麥的方法，是將上述用于培育抗病小麥的基因導入小麥，篩選得到可表達所述用于培育抗病小麥基因的轉基因植株，并進行抗病鑒定，得到抗病小麥。
所述用于培育抗病小麥的基因，可通過植物表達載體如Ti類質粒載體或病毒載體或其它重組表達載體導入小麥。
所述用于培育抗病小麥的基因，通過重組表達載體pUAFP2導入小麥；所述pUAFP2是將所述用于培育抗病小麥的基因插入pAHC25的限制性內切酶SmaI和SacI的識別位點間得到的重組表達載體。
所述含有用于培育抗病小麥的TaRs-AFP2基因的重組表達載體可通過基因槍法、使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化小麥細胞或組織。
所述含有用于培育抗病小麥的基因的重組表達載體優選通過基因槍法導入小麥。
所述方法中，是以小麥幼穗或幼胚為外植體，將含有用于培育抗病小麥的基因的重組表達載體導入小麥。
所述抗病小麥為抗紋枯病和/或白粉病小麥。
本發明用小麥偏愛密碼子改造蘿卜的Rs-AFP2基因得到用于培育抗病小麥的基因TaRs-AFP2，將TaRs-AFP2導入小麥，并對T0、T1代轉基因植株進行分子檢測和對T1代分子檢測陽性植株接種紋枯病致病菌進行抗病鑒定，得到28株抗紋枯病小麥，其中2株還兼抗白粉病。
圖1為表達載體pUAFP2的構建2為Sma I+Sac I酶切pAHC25電泳圖譜圖3為Sma I+Sac I酶切pTAFP2電泳圖譜圖4為重組表達載體pUAFP2酶切鑒定圖5為部分轉pUAFP2小麥T0代植株的Bar基因PCR檢測圖譜圖6為部分轉pUAFP2小麥T0代植株的TaRs-AFP2基因PCR檢測圖譜圖7為部分轉pUAFP2小麥T1代植株的TaRs-AFP2基因PCR檢測圖譜圖8為轉pUAFP2小麥抗紋枯病檢測照片具體實施方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、小麥偏愛的TaRs-AFP2基因獲得及抗病小麥的培育一、小麥偏愛的TaRs-AFP2基因獲得和轉化載體的構建1、小麥偏愛的TaRs-AFP2基因獲得根據Terras等(Terras FRG，Schoofs HME，De Bolle M FC，et al.Analysisof two novel classes of antifungal proteins from radish(Raphanus sativusL.)seeds[J].J.Biol.Chem，1992，26715301-15309)發表的序列和小麥偏愛的密碼子，設計小麥偏愛Rs-AFP2基因(序列2)，并在該基因的兩端加上SmaI和SacI限制內切酶的酶切位點，進行人工合成、重組到pMD18-T vector上，轉化到大腸桿菌細胞中，提取質粒和測序，將測序結果正確的小麥偏愛Rs-AFP2基因命名為TaRs-AFP2，該基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，將含有TaRs-AFP2的pMD18-T載體命名為pTAFP2。
2、轉化載體的構建(載體構建過程如圖1所示)用限制內切酶Sma I和Sac I酶切質粒pTAFP2切下目的基因片段TaRs-AFP2，回收目的基因得到255bp的條帶即為TaRs-AFP2，其酶切圖譜如圖3所示，圖3中泳道M為PCR分子量標準；泳道1為Sma I+Sac I酶切pTAFP2質粒DNA。同時用SmaI和Sac I酶切下單子葉高效組成性表達載體pAHC25(載體pAHC25由pUC8改造而成，含有2個表達盒，第1個表達盒具有玉米UBIQUITIN啟動子、Exon、Intron、GUS、Nos終止子，GUS兩端具有SmaI和SacI酶切位點，第2個表達盒具有玉米UBIQUITIN啟動子、Exon、Intron、Bar、Nos終止子)的GUS基因，得到約7700bp的切去GUS基因的載體片段，其酶切圖譜如圖2所示，圖2中泳道M為λDNA/HindIII雙酶切分子量標準；泳道1為Sma I+Sac I酶切pAHC25質粒DNA。將上述切去GUS基因的載體片段回收，然后用T4DNA連接酶與TaRs-AFP2連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，經過單菌落藍白斑篩選，選取陽性克隆重組質粒進行SmaI和SacI雙酶切鑒定，結果如圖4所示，將鑒定正確的含有TaRs-AFP2的pAHC25命名為pUAFP2，圖4中，泳道M為PCR分子量標準；泳道1和泳道2為Sma I+Sac I酶切的重組表達載體pUAFP2質粒DNA。該pUAFP2載體中TaRs-AFP2基因表達受Ubiqutin組成性啟動子控制，另外還具有1個受Ubiqutin啟動子控制的Bar基因表達盒，可為后續選擇利用雙丙胺膦(Bialaphos)篩選轉化再生植株提供抗性。
二、轉pUAFP2小麥的獲得溫室種植小麥品種揚麥12，采集授粉12-14天的未成熟種子，未成熟種子消毒后、取幼胚盾片向上，共1627個幼胚作為基因槍轟擊的受體，接種于SD2(MS培養基的無機鹽成分中添加維生素B1 1mg/L，天冬門酰胺150mg/L，2，4-D 2mg/L)或改良MS培養基(MS培養基添加2，4-D 2mg/L，谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白100mg/L)上，置于26℃暗培養1周，1627個幼胚全部得到愈傷組織。將幼胚的愈傷組織集中于裝有滲透壓培養基(含0.4mol/L山梨醇和0.4mol/L甘露醇的MS培養基)的培養皿中，滲透壓處理4-6h。經滲透壓處理的幼胚愈傷組織，用BIO-RAD公司的PDS1000/He基因槍(金粉、pUAFP2質粒DNA濃度分別為45μg/槍、1μg/槍)進行轟擊(psi1100，Hg27.5，轟擊距離6cm)，轟擊后的愈傷組織在滲透壓培養基上后處理16h。將愈傷組織轉移到SD2或改良MS培養基，恢復培養2周，26℃，暗培養。恢復培養后的愈傷組織轉移到分化篩選培養基中(在1/2 MS培養基中，添加NAA1mg/L+KT 1mg/L，Bialaphos 2mg/L)，24-26℃光照培養4-5周，將愈傷組織分化小苗轉移到生長篩選培養基中(1/2 MS培養基中添加Bialaphos 5mg/L)，24-26℃光照培養4-5周。經過2-3次Bialaphos篩選的轉化小苗轉移到壯苗培養基(1/2MS培養基中附加NAA 0.2mg/L，MET 0.5mg/L)上，待苗高7-8cm且根系發達的轉化苗移栽到花盆，在可控溫室生長發育。結果揚麥12獲得了轉pUAFP2植株316株，在移栽到溫室3周以后，絕大部分植株成活，在三葉期成活的植株每株取1片葉提取基因組DNA。
由于載體pAHC25與Anand等(2003)(Anand A，Zhou T，Trick HN，et al.Greenhouse and field testing of transgenic wheat plants stably expressinggenes for thaumatin-like protein，chitinase and glucanase against fusariumgraminearum[J].Journal of Experimental Botany，2003，54(384)1101-1111)文獻描述的載體相同，所以根據此文獻上發表的Bar基因序列合成了1對檢測Bar基因的特異引物，預期擴增產物片段約450bp。
Bar基因PCR檢測所用引物Bar-R5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3’Bar-F5’-CCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCC-3’擴增體系總體積為25μl，包含1×PCR buffer(Mg2+-free，天為時代公司)，MgCl22.0mM，四種dNTP各0.2mM，引物Bar-R/Bar-F各0.4μM，1U TaqDNA聚合酶(天為時代公司)，模板DNA 400ng，補水至25μl。
擴增程序94℃變性5min；94℃ 45sec，62℃ 45sec，72℃ 1min，45個循環；72℃延伸10min。擴增產物經1％瓊脂糖EB凝膠電泳，紫外拍照。
TaRs-AFP2目的基因PCR檢測所用引物是根據TaRs-AFP2基因序列和兩端酶切位點序列設計的，預期擴增產物片段約249bp。
AFP-F5’-GGGATGGCTAAGTTTGCTTCT-3’AFP-R5’-GAGCTCTTAACAAGGGAAATA-3’擴增體系總體積為25μl，包含1×PCR buffer(Mg2+-free，華美公司)，MgCl22.0mM，四種dNTP各0.2mM，引物AFP-R/AFP-F各0.4μM，1U Taq DNA聚合酶(華美公司)，模板DNA 200ng，補水至25μl。
擴增程序94℃變性5min；94℃ 30sec，60℃/59℃/58℃/57℃/56℃，各一個循環45sec，72℃ 1min；94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 1min，35個循環；72℃10min。擴增產物經1％瓊脂糖EB凝膠電泳，紫外拍照。
通過對表達載體上Bar基因和目的基因TaRs-AFP2的PCR檢測，獲得Bar基因和目的基因TaRs-AFP2檢測均為陽性的T0代轉基因植株58株。證明同一載體上的篩選基因Bar基因和目的基因TaRs-AFP2是同時轉入受體小麥揚麥12中，總的轉化率達到3.56％。T0代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代。T1代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T2代。T2代轉基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T3代。
部分轉pUAFP2小麥T0代植株的Bar基因PCR檢測結果如圖5所示，圖5中，泳道M為100bp分子量標準；泳道P為質粒pUAFP2陽性對照；泳道1-8為轉pUAFP2小麥植株；泳道9為非轉pUAFP2小麥植株陰性對照。
部分轉pUAFP2小麥T0代植株的TaRs-AFP2基因PCR檢測結果如圖6所示，圖6中，泳道M為100bp分子量標準；泳道P為質粒pUAFP2陽性對照；泳道1-11為轉pUAFP2小麥植株；泳道12為非轉pUAFP2小麥植株陰性對照。
對T1代轉pUAFP2小麥植株進行PCR檢測TaRs-AFP2，部分結果如圖7所示，結果表明，TaRs-AFP2基因已整合到小麥基因組中，能在小麥中遺傳傳遞；圖7中，泳道M為100bp分子量標準；泳道P為質粒pUAFP2陽性對照；其余泳道為轉pUAFP2小麥T1代植株。
三、對轉pUAFP2小麥進行小麥紋枯病菌抗病性鑒定在溫室花盆種植如下小麥材料68株T1代轉pUAFP2小麥和10株揚麥12，約4周(拔節-挑旗期)，用注射法接種小麥紋枯病菌禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1的菌絲液10微升到小麥葉鞘部，然后用水保濕一次，隔一周噴一次水。在收獲時考察葉鞘和莖稈的發病情況。病情分級標準按照李斯深等方法進行(李斯深，李安飛，李憲彬等.1997，小麥種質對紋枯病抗性鑒定初報.作物品種資源[J].(4)31-33)紋枯病病情分級標準為0無病；1第1、2葉鞘發病，但莖稈無病；2第1、2葉鞘發病，但病斑繞莖稈小于1/3；3第3、4葉鞘發病，或病斑繞莖稈1/3-2/3；4第5、6葉鞘發病，或病斑繞莖稈2/3-1周；5出現枯、白穗或整株枯死。
在三葉期，每株取1葉片提取基因組DNA進行轉入基因的PCR鑒定，并隨后接種白粉病菌，菌種為溫室采集的北京地區小麥白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.tritici)混合小種，采用活體摩擦結合抖落孢子的方法接種。接種2周后開始進行苗期和成株期的抗病鑒定。苗期以葉片上無孢子堆和壞死斑者定為高抗(0級)，葉片上有孢子堆者定為感病；成株期的抗病分級按照國際小麥玉米改良中心和國家標準(中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗標準(一)GB/T1798.22-200，殺菌劑防治禾谷類白粉病)分為9級。
結果表明，T1代轉pUAFP2小麥中有28株全生育期對小麥紋枯病菌高抗(0級)(圖8)，其中2株還兼免疫白粉病(0級)。楊麥12感紋枯病(3-4級)，高感白粉病(8級)。說明TaRs-AFP2基因在這些小麥中組成性表達能夠賦予小麥對紋枯病等病害高度抗性。
序列表<160>2<210>1<211>243<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggctaagt ttgcttctat catcgtcctt ctcttcgttg ctcttgtcgt ttttgccgct 60ttcgaggaac caaccatggt ggaagcacag aagttgtgtc agaggccaag tggcacatgg120tcaggagtct gtggaaacaa taacgcatgc aagaatcagt gcatccgact tgagaaagca180cgacatgggt cttgcaacta tgtcttccca gctcacaagt gtatctgtta tttcccttgt240taa 243<210>2<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cccgggatgg ctaagtttgc ttctatcatc gtccttctct tcgttgctct tgtcgttttt 60gccgctttcg aggaaccaac catggtggaa gcacagaagt tgtgtcagag gccaagtggc120acatggtcag gagtctgtgg aaacaataac gcatgcaaga atcagtgcat ccgacttgag180aaagcacgac atgggtcttg caactatgtc ttcccagctc acaagtgtat ctgttatttc240ccttgttaag agctc 25權利要求
1.用于培育抗病小麥的基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴謹條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于所述用于培育抗病小麥的基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.一種培育抗病小麥的方法，是將權利要求1或2所述的用于培育抗病小麥的基因導入小麥，篩選得到可表達所述用于培育抗病小麥基因的轉基因植株，得到抗病小麥。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述抗病小麥為抗紋枯病和/或白粉病小麥。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述用于培育抗病小麥的基因，通過重組表達載體pUAFP2導入小麥；所述pUAFP2是將所述用于培育抗病小麥的基因插入pAHC25的限制性內切酶SmaI和SacI的識別位點間得到的重組表達載體。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述用于培育抗病小麥的基因通過基因槍法導入小麥。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述用于培育抗病小麥的基因導入小麥的幼穗或幼胚。
8.根據權利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為揚麥12。
9.含有權利要求1或2所述的基因的表達載體、細胞系或宿主菌。
全文摘要
本發明公開了一種培育抗病小麥的方法及其專用基因。本發明的用于培育抗病小麥的基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的核苷酸序列；(2)在高嚴謹條件下可以與序列表中序列1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該基因導入小麥中，顯著提高了小麥的紋枯病的抗性。
文檔編號C12N15/82GK1844395SQ20061007621
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月19日 優先權日2006年4月19日
發明者張增艷, 辛志勇, 廖勇, 徐惠君, 杜麗璞, 姚烏蘭 申請人:中國農業科學院作物科學研究所