專利名稱：一種枯草芽胞桿菌胞外分泌表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽胞桿菌胞外分泌的表達載體，以及用該載體轉化的枯草芽胞桿菌。
背景技術：
大腸桿菌表達系統是最早應用于基因工程領域表達外源性蛋白，現在雖然仍然廣泛應用在該領域，但存在一些越來越明顯的缺點和難以解決的問題。比如，表達產物以包涵體形式存在、分泌的內毒素等，給下游純化增加困難。與大腸桿菌表達系統相比，枯草桿菌表達系統具有以下明顯的點(1)枯草桿菌有完善的分泌特征，可將產物分泌到細胞外，極大地減少了對產物的分離純化步驟，提高了回收率；(2)枯草桿菌是一種無致病性的安全微生物，長期以來作為工業微生物得到廣泛的應用；(3)已經在枯草桿菌表達系統中建立了成熟的工業化生產工藝和流程；(4)諸如IL-1等利用大腸桿菌不能表達的基因，能在枯草桿菌表達并且得到有活性的產物。因此，將枯草桿菌表達系統應用于基因工程領域引起人們很大的興趣。
雖然在以上多個方面，枯草桿菌表達系統優于大腸桿菌表達系統，但在表達量上卻不如大腸桿菌。造成的原因主要是因為枯草桿菌分泌大量蛋白酶，會將表達產物分解；科學技術人員對此研究后，已得到了枯草桿菌的突變株(缺失多種蛋白酶基因的菌株，如WB600、WB700)，該突變株不分泌或分泌少量蛋白酶，因而減少了蛋白酶對表達產物分解的現象。但是由于對枯草桿菌的研究不如大腸桿菌深入，目前仍缺乏像大腸桿菌一樣齊全多樣的高效表達載體。
發明內容
本發明的目的在于克服枯草桿菌表達系統在表達量上低的缺陷，利用分子生物學的技術手段，致力于轉錄和外分泌兩個環節，人工合成了含枯草芽胞桿菌適用的啟動子、增強子、SD序列和信號肽、轉錄終止序列等元件。構建了一種適用于在枯草芽胞桿菌中高效表達的載體。
為了完成上述目的，本發明首先人工合成了核苷酸片段，其包含的7個元件依次為SacB啟動子、果聚糖蔗糖酶翻譯增強子、SD序列和23個氨基酸殘基組成的完整信號肽、多克隆位點、α-Amylase轉錄終止、degQ序列。然后，將核苷酸片段拼裝后克隆進pBR322質粒(購自天為時代公司)，該載體可作為穿梭質粒載體。
本發明提供的枯草芽胞桿菌胞外分泌表達載體是通過如圖1所示的流程構建的。
首先合成58條寡核苷酸引物，如圖3和圖4所示，其中29條正鏈(標號為A)和29條負鏈(標號為B)間均有部分堿基互補，退火可以形成雙鏈的片段1。片段1從5’端到3’端的序列依次包括SacB啟動子、果聚糖蔗糖酶翻譯增強子、SD序列、信號肽、多克隆位點、α-Amylase轉錄終止和degQ序列。這樣設計的原因是由于構建本載體所用的各模塊是分散在基因組中，不連續的。所以一次PCR不能達到將所有模塊擴增出來。如用多次PCR的方法則增加了錯誤和突變率。所以采用了多組的引物互相互補，然后退火的方法，該方法簡單易行。按照設計，片段1的5’端退火后形成NheI酶切位點，3’端退火后形成BamHI酶切位點。pBR322的3’端經BamHI酶切后形成BamHI酶切位點，5’端用NheI酶切形成NheI酶切位點，正好與片段1相對應。所以片段1可以克隆進pBR322的NheI、BamHI位點。最終得到了本發明構建的載體pFYS.1(如圖2所示)。
本發明克隆進pBR322質粒中的7個元件序列如下所示(1)SacB啟動子ccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactttatgcccatgcaacagaaactataaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttagg(2)果聚糖蔗糖酶增強子CCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAA
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(7)degQ序列TCTGCTCAATAACGACTTCCCCCCTCCCATTCCATTTTACTAAATGGGACATTTAAAGGACAGCAGGTTTTTCGTTTTTTAACAATCATATAATACTTTATCCATTTATTGTATCGGTAGAACGAAAAAAAAGACTTGTTTCCAAGTCTTTTTCACGAAATTTTCATTGCATAATTGTATTTATCGAGTTGATCAATGCTTTTGTTAATGTTTCGTAATGAATCTGTCGTTTCTTTAATATCAAGTTCGAGTCGGAATAACAATTGTTTTACTTCTTCAAGTTTCTTTTCCATCGTTTCCACACTCCTTTTTTTGAAAGATCCCCATCAGATCTGCCGGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC
圖1為質粒pFYS.1的構建流程；圖2為質粒pFYS.1的結構3為化學合成29條正向寡核苷酸引物A圖4為化學合成29條反向寡核苷酸引物B圖5完整的片段1(1622bp)的序列組成圖6枯草桿菌和大腸桿菌中表達效果的比較泳道1為分子量Marker，泳道2為枯草桿菌表達的酶，泳道3為大腸桿菌表達的酶。
具體實施例方式
實施例1、29條正向寡核苷酸引物A和29條反向寡核苷酸引物B的合成及片段1的組裝所述的58條寡核苷酸引物的堿基序列如圖3和圖4所示，使用固相亞磷酞胺法化學合成，然后經PAGE純化；在所述的58條寡核苷酸引物中，正鏈(標號為A)和負鏈(標號為B)間均有部分堿基互補，退火可以形成互補鏈，利于片段的正確連接；分別取已純化好的寡核苷酸引物，用去離子水溶解。58種引物分別取1.72pmol，共100pmol，放在一個管中，在含有1×T4多核苷酸激酶緩沖液，10mmol ATP，5個單位的T4多核苷酸激酶的40μl反應體系中，37℃溫育1小時進行5’末端磷酸化，將磷酸化的正、反向引物等摩爾混合，90℃退火，自然冷卻至室溫，得到片段1。片段1依次包括SacB啟動子、果聚糖蔗糖酶翻譯增強子、SD序列和23個氨基酸殘基組成的完整信號肽、多克隆位點、α-Amylase轉錄終止、degQ序列，片段1的序列如圖5所示。
實施例2、質粒pFYS.1的構建實施例1的反應中得到的片段1，由于事先設計在退火后，自動分別在5’端和3’端形成了NheI和BamHI位點采用引物A15’ctagcccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgata，和引物B15’AGTGAACGGCAGGTATATGTGATGGG，退火后在引物A1的5’端形成NheI酶切位點。
采用引物A295’CGCCCTATAGTGAGTCGTATTACg和引物B295’GATCCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCGGCAGATCTGATGGGGATCTTTCAAA，退火后在引物A1的3’端形成BamHI酶切位點。
先用BamHI酶切pBR322后，然后用NdeI酶切分離出大片段。得到的pBR322酶切大片段10pmol和100pmol上述得到的片段1，在含有1mMATP、10mM DTT、1×T4DNA連接酶緩沖液、10單位T4DNA連接酶的反應體系中，于12℃連接過夜。從而片段1插入到pBR322，構建成質粒pFYS.1。
實施例3利用該質粒pFYS.1表達淀粉酶外源蛋白我們以前的工作曾克隆了淀粉酶基因(蔣專，2006，北京科技大學碩士學位論文，淀粉酶的基因工程研究)，其基因序列的GeneBank的號碼為AE006718.1。淀粉酶基因已經用PstI和HimdIII酶切處理后，被克隆進pFYS.1表達載體的PstI和HimdIII位點中，得到重組質粒。重組質粒純化后，通過電轉化方法轉化枯草芽孢桿菌。轉化的枯草芽孢桿菌在5ug/ml的硫酸卡那霉素的LB平板篩選陽性轉化子。將所得到的重組子直接接種到LB培養基中，培養48h后，離心取上清液進行SDS-PAGE電泳(6％濃縮膠，12％分離膠)，同時取上清測酶活。
作為對照，在大腸桿菌表達系統中，將淀粉酶基因重組進pET-21質粒(購自Invitrogen公司)的NdeI和BamHI位點中，得到重組質粒。重組質粒純化后，通過電轉化方法轉化大腸桿菌。在50ug/ml的氨芐青霉素的LB平板篩選陽性轉化子。將所得到的重組子直接接種到LB培養基中，培養48h后，離心取上清液進行SDS-PAGE電泳(6％濃縮膠，12％分離膠)，同時取上清測酶活。電泳的結果見圖6。從圖中可見，在枯草芽孢桿菌的蛋白清晰可見，而大腸桿菌中的蛋白不清楚。酶活測定的結果表明，在枯草芽孢桿菌中的最高產酶水平達到4.5U/ml，在大腸桿菌中的最高產酶水平達到0.22U/ml。枯草芽孢桿菌的表達水平是大腸桿菌產酶水平的20倍。
序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>北京中天諾亞體育科技有限公司<120>一種枯草芽胞桿菌胞外分泌表達載體<130>FPI06093<160>59<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>59<212>DNA<213>引物<400>1ctagcccatc acatatacct gccgttcact attatttagt gaaatgagat attatgata59<210>2<211>57<212>DNA<213>引物<400>2ttttctgaat tgtgattaaa aaggcaactt tatgcccatg caacagaaac tataaaa 57<210>3<211>57<212>DNA<213>引物<400>3aatacagaga atgaaaagaa acagatagat tttttagttc tttaggcccg tagtctg 57<210>4<211>57<212>DNA<213>引物<400>4caaatccttt tatgattttc tatcaaacaa aagaggaaaa tagaccagtt gcaatcc 57<210>5<211>57<212>DNA<213>引物<400>5aaacgagagt ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgat 57<210>6<211>57<212>DNA<213>引物<400>6aaagcaggca agacctaaaa tgtgtaaagg gcaaagtgta tactttggcg tcacccc 57<210>7<211>57<212>DNA<213>引物<400>7ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact tgccatcttc aaacagg 57
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1.一種表達載體，包含SacB啟動子、果聚糖蔗糖酶翻譯增強子、SD序列、23個氨基酸殘基組成的完整信號肽、多克隆位點、α-Amylase轉錄終止和degQ序列。
2.根據權利要求1所述的載體，其具有圖2所示的基因圖譜并且被命名為pFYS.1。
3.一種枯草芽胞桿菌，其被權利要求1或2所述的表達載體所轉化。
全文摘要
本發明公開了一種適用于在枯草芽胞桿菌中高效表達的載體。該表達載體包含SacB啟動子、果聚糖蔗糖酶翻譯增強子、SD序列、23個氨基酸殘基組成的完整信號肽、多克隆位點、α－Amylase轉錄終止和degQ序列。本發明還進一步涉及用該載體轉化的枯草芽胞桿菌。
文檔編號C12N1/21GK101041830SQ20061006568
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月21日 優先權日2006年3月21日
發明者楊建國, 汪兵 申請人:北京中天諾亞體育科技有限公司