熒光偏極化偵測法的方法

專利名稱：熒光偏極化偵測法的方法
技術領域：
本發明是有關一種能夠同時以高可信度(fidelity)和高可用率(workablerate)擴增多個DNA序列，具有高產出率以及低成本效益的方法，特別是關于一種結合條件化觸減策略(conditional touchdown strategies)的多重鏈聚合酶連鎖反應(Multiplex Polymerase Chain Reaction；MPCR)的熒光偏極化偵測法的方法。
背景技術：
為了清楚說明，茲將爾后所用的關于生物分子的各種字詞給予進一步定義。
1、定義“多型性”(Polymorphism)一般指的是一種物種或基因以兩種或更多的型式呈現的現象。特別對于本發明來說，“多型性”指的是同一個基因呈現兩種以上的型式。
“單一核甘酸多型性”(Single Nucleotide Polymorphism或SNP)指的是由于單一個核甘酸所產生的多型性現象。
“多重鏈聚合酶連鎖反應”(Multiplex Polymerase Chain Reaction或MPCR)指的是在單一個鏈聚合酶連鎖反應中同時擴增多個DNA目標片段的數量。
“高產出率”(High-throughput)指的是快速而且具有低成本效益的大規模制造方法。在本發明中，能夠在嚴苛要求的時間和預算下同時篩選在單一個DNA樣本中大量、多種的基因座(genetic loci)。
2、相關技術
“鏈聚合酶連鎖反應(PCR)”鏈聚合酶連鎖反應是科學上的一項偉大發明，它擴大了從少量DNA料來源制造出大量DNA分子副本的應用性，并使得應用更多元化，也使得分子生物學的世界產生了革命性的變化。
這個方法包括使用能夠和與它們互補的DNA序列粘合(anneal)，且已預先決定序列的數組成對寡核甘酸分子，或稱為起始引子分子(primer)，并且通過熱穩定的DNA鏈聚合酶限定特定的DNA片段擴增其數量。這些DNA分子產物是通過一個重復的一系列循環操作過程被合成出來，每一個循環都包括了模版分子變性分離(template denaturation)，引子粘合反應(primer annealing)，以及通過鏈聚合酶所進行的粘合引子的延伸反應(extension)。這些過程可以造成特定的DNA片段數量以指數函數的速度累積，這些DNA分子的末端特征是由引子的5’端來決定，可參考Saiki等人發表的“引子引導熱穩定的DNA鏈聚合酶酵素擴增DNA數量”，Science(1988)239487-91。
“單一核甘酸多型性基因型定型(genotyping)”有許多種為了不同領域的特殊目的的PCR變化方法已經被發展出來。PCR使用在基因型定型技術上，已經為揭開基因組結構的神秘面紗打開了一扇寬廣之窗，例如基因鑒定和辨認在實際上已經變得可行。目前科學界對于SNP的濃厚興趣使得對于基因型定型技術的要求已進一步到以費用、正確性、產出率和檢測的簡單程度作為判斷檢測是否可行的重要因子。如果有1000個人，每個人50萬個SNP要在一年內完成分析，那么每天就要完成一百五十萬個SNP基因型定型，而且總花費將達到五千萬美金。甚至，每個人需要數毫克的基因組DNA，例如收集十管以上的血液，也將增加樣本收集的費用，使得這項工作變得不可行。即使是通過保守的估計，這個嚇人的花費也將使得最大型的基因型定型中心望而卻步。因此，對于高產出率、具有低成本效益的方法的需求促成了許多創新的技術出現，包括PCR的衍生技術、以對偶基因座特異探針發展出來的雜交方法(例如TaqMan(商品名)PCR)、寡核甘酸嵌合反應(例如寡核甘酸嵌合檢測(OLA))、單一核甘酸引子延伸反應(例如基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜儀(MALDI-TOFMassSpectrometry)以及模版引導的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測(FP-TDI，template directed dye terminator incorporation with detection byfluorescence polarisation))、以及酵素切割方法(例如Invader(商品名))都已經被設計來增強自動化平臺或使基因型定型的生化反應更多樣化，參考Syvnen的“獲取基因變異資料基因型定型單一核甘酸多型性”(Accessinggenetic variationgenotyping single nucleotide polymorphisms)，Nat RevGenet(2001)2930-42。
然而，這些技術沒有一個真正代表了基因型定型技術上的突破。昂貴的儀器和試劑伴隨著珍貴而稀少的基因組DNA樣本阻礙了市場的接受度，并且使得檢測的設計更加復雜。此外，大部分被發展出來的技術需要消耗大量的樣本DNA，也抑制了大規模SNP基因型定型的實行。
“多重PCR”多重PCR，在單一個PCR反應中同時擴增兩個以上的基因座，參考Chamberlain，“杜馨氏肌肉營養不良癥基因座通過多重DNA擴增的缺失篩檢”(Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification)，Nucleic Acids Res(1988)1611141-56，此法是一個能大量減少時間、費用及所需基因組DNA樣本的強大基因分析技術。這個方法已經被成功的運用在許多的DNA檢測領域上，包括基因多型性的判斷。然而多重的PCR引子同時置于一個反應中可能會造成許多問題，包括假性PCR產物形成增加、引子形成雙聚體、以及較短的DNA片段數量會有擴增的傾向。所有這些可能的問題如果加諸于SNP基因型定型會導致不正確的結果。一個關于各種情況以及所會遇到的困難的詳細敘述已經在Henegariu等人所著的“多重PCR關鍵參數和詳盡的操作流程”(Multiplex PCRcritical parameters andstep-by-step protocol)，BioTechniques(1997)23504-511，被討論過了。
“傳統技術的問題”如同前述所討論到的技術，總括的說，至少有如下三項缺點沒有被克服1、最近的SNP基因型定型技術需要昂貴的設備和試劑，加上珍貴而稀少的基因組DNA樣本，阻礙了市場的接受度，并且使得檢測的設計更加復雜；2、多重PCR將多對PCR引子置于同一個反應中可能會造成許多問題，包括假性PCR產物形成增加、引子形成雙聚體和傾向于偏極性擴增較短的DNA片段，因此降低了它的可用率；3、由于上述所提到的可能產生的問題，從文獻中記載多重PCR的成功比率幾乎很難超過50％。
當然，有許多技術已經被提出來要解決該領域的各種問題。例如，美國專利第5,736,365號，由Walker等人在單一個擴增反應中使用多重分子鏈取代擴增技術(SDA)。這項技術能夠同時鑒定出結核桿菌(M.tuberculosis)，并提供大量篩檢所有臨床相關的分支桿菌屬的物種。
頒給Shuber的第5,882,856號和第6,207,372號美國專利則提供了通用的多重PCR擴增的引子序列，讓多重PCR反應能夠在不需要繁雜的最佳化步驟下被設計并且進行，不必管不同的引子可能造成的不一樣的性質，而且每一個被擴增的產物能同時被制造出相等數量。
Diamandis等人設計出一套能夠快速診斷和專一篩檢p53基因的突變的方法、試劑和套裝試劑，這項美國第6,071,726號專利可以快速而且經濟的診斷出病人樣本中p53基因的突變。不過這些方法都無法解決上面所提到的問題。
在美國專利公開第20020058281號中，Matsuzaki等人提出了一套多重核酸分子數量擴增的方法以及組成成分，這個方法能夠以相同的效率擴增不同序列的DNA分子數量，因此能夠得到相同摩爾數的分子產物。這個方法需要高濃度的引子并且使用相同的粘合溫度，而且它的產物是非特異性的，可用率也很低。
為了解決使用少量的基因組DNA做為模版，以及在多重PCR中置入大量的引子對所遭遇到的困難，Nakamura等人在美國專利公開第20020182622號中揭露一個SNP定型的方法，此法借著在多重擴增反應中使用熱起始的Taq(商品名)鏈聚合酶，可以用很少量的基因組DNA為成千上萬的SNP位置進行基因型定型。然而，這個方法仍然使用了高濃度的引子和單一粘合溫度，而且借著這個方法所得到的PCR產物仍有非特異性的問題，并且可用率仍然偏低(不超過50％)。因此，如何提供一種高產出率，并具有經濟效益，能以高可信度和高可用率同時擴增多個目標DNA數量的方法，成為人們所期盼。

發明內容
本發明的主要目的是提供一種條件化觸減多重鏈聚合酶連鎖反應，通過快速而且負擔得起的方法，借著多重PCR伴隨著條件化觸減策略，能夠用來進行多重目標DNA序列分子的同時擴增，應用在SNP基因型定型，達到進行SNP基因型定型所需的DNA模版的數量相較于傳統的方法大幅度地減少的目的。
本發明的目的是這樣實現的一種條件化觸減多重鏈聚合酶連鎖反應，其特征是它包括下列步驟(1)首先，在第一粘合溫度的同步鏈聚合酶連鎖反應，以增加許多引子粘合到模版上；(2)然后，在第二粘合溫度的特異性鏈聚合酶連鎖反應，以豐富許多指定的序列；其中，該第二粘合溫度高于該第一粘合溫度。
該第一粘合溫度實質上等于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度，該最佳化的粘合溫度是通過兩個基因組DNA樣本和混和的多個引子對被置入以各種觸減熱循環條件，執行的擴增反應步驟中，調整出最佳化的粘合溫度。
該第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度實質上等于該最佳化的粘合溫度。該第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，該第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。
在該同步鏈聚合酶連鎖反應的步驟之前，它更包括一最佳化引子混合物和相關鏈聚合酶連鎖反應條件的步驟；該最佳化步驟是通過使用同一個基因組DNA樣本和每一個引子對進行PCR來完成觸減PCR的循環模式，包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環，該第一循環包括第二種模版分子變性分離的第一時間區段，跟隨著第二時間區段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應，然后第三時間區段的第一種引子延伸反應；(3)許多的第二循環，該第二循環包括第三種模版分子變性分離的第四時間區段，跟隨著第五時間區段在最終觸減點的第二種引子粘合反應，然后第六時間區段的第二種引子延伸反應；(4)第三種引子延伸反應。
本發明又提供一種基因型定型方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應在一帶有許多引子對及基因組DNA的混合液中同步擴增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨立鏈聚合酶連鎖反應，每一該獨立鏈聚合酶連鎖反應通過一對指定的引子擴增來自前一步驟制造的多重PCR產物中的一特定的核甘酸序列分子。
該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實質上高于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實質上等于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。
該基因組DNA的數量低于50微毫克。該基因組DNA的數量等于或大于50微毫克。該同步擴增多種核甘酸序列分子的步驟采用一觸減熱循環模式。該循環模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環，該第一循環包括第二種模版分子變性分離的第一時間區段，跟隨著第二時間區段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應，然后第三時間區段的第一種引子延伸反應；(3)許多的第二循環，該第二循環包括第三種模版分子變性分離的第四時間區段，跟隨著第五時間區段在最終觸減點的第二種引子粘合反應，然后第六時間區段的第二種引子延伸反應；(4)第三種引子延伸反應。
它更包括在該多重獨立鏈聚合酶連鎖反應的步驟之前的純化該多重鏈聚合酶連鎖反應產物的步驟。該多重獨立鏈聚合酶連鎖反應的步驟采用一觸減熱循環模式。該循環模式包括如下步驟(1)第一種模版分子變性分離；(2)引子粘合溫度的下降梯度的許多第一循環，該第一循環包括第二種模版分子變性分離的第一時間區段，跟隨著第二時間區段在一指定的梯度溫度的第一種引子粘合反應，然后第三時間區段的第一種引子延伸反應；(3)許多的第二循環，該第二循環包括第三種模版分子變性分離的第四時間區段，跟隨著第五時間區段在最終觸減點的第二種引子粘合反應，然后第六時間區段的第二種引子延伸反應；(4)第三種引子延伸反應。
它更包括在該同步擴增多種核甘酸序列分子的步驟之前的一最佳化引子混合物和相關鏈聚合酶連鎖反應條件的步驟。它更包括一凝膠分析及定序分析的步驟以評估鏈聚合酶連鎖反應和基因型定型結果。
本發明還提供一種熒光偏極化偵測法的方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應在一帶有許多引子對以及基因組DNA的混合液中，同步擴增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨立鏈聚合酶連鎖反應，每一該獨立鏈聚合酶連鎖反應通過一對指定的引子擴增來自前一步驟制造的多重鏈聚合酶連鎖反應產物中的一特定的核甘酸序列分子。
該第一觸減程序使用一粘合溫度實質上等于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度實質上等于該最佳化的粘合溫度。該第一觸減程序使用一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二粘合溫度高于該最佳化的粘合溫度。
它更包括一設計該引子的步驟，以具備一融解溫度在一范圍內，供一數量的鏈聚合酶連鎖反應產物的擴增。
在本發明的方法中，將觸減PCR結合到多重PCR是為了要解決在PCR多重化時所遭遇到的引子起始錯誤的困難。觸減PCR是一個PCR的變化方法，它已經被采用來避開為了要判斷粘合溫度所需的更復雜的最佳化過程。它包含了每下一個回合降低溫度1℃，一般大約使用10個回合，以觸減(touchdown)方式達到最適合的粘合溫度。
它的精髓在于任何正確和不正確于融解溫度(Tm)的粘合之間的差異會造成每回合產物數量2倍的差異，因此會造成正確的產物數量超過任何不正確的產物，參考Don等人的“在基因擴增過程中，觸減PCR以回避假性的引子起始”(Touchdown PCR to circumvent spurious priming during geneamplification)，Nucleic Acids Res(1991)194008。這個將觸減策略整合到多重PCR的發明方法，在需要大量引子對時是非常有價值的，尤其是在SNP基因型定型操作。本發明的方法被設計來改進高度要求正確度、低成本效益和高產出率的SNP基因型定型的表現。
此外，在所有傳統SNP基因型定型過程，每個SNP位置至少都需要數十毫微克(ng)的基因組DNA。因為每個個體有數以萬計的SNP位置需要檢測，所以實際上要得到足夠的基因組DNA是不可能的。相反的，利用本發明的方法進行多重SNP位置的定型，可以大量減少每個個體所需的基因組DNA的數量，因此它在臨床樣品收集上相當具有價值，甚至，它的檢測的簡單設計也令人相當向往能在SNP基因型定型繁瑣、冗長的過程中使用這個方法。
根據本發明的方法，在一個條件化的觸減多重PCR反應的中，包括同步PCR和特異性PCR。在同步PCR中，擴增的目的是要增加各引子粘合到模版上的機會，而特異性PCR則是用來增加想要的特定序列的數量。這兩種PCR的粘合溫度都可以采用觸減策略。特別是特異性PCR的粘合溫度高于同步PCR的粘合溫度。
在本發明的一個較佳實施例當中，一個基因型定型包括采用寬松觸減策略(Loose Touchdown Strategy；LTS)的多重PCR的同步擴增步驟，加上采用嚴謹觸減策略(Stringent Touchdown Strategy；STS)的特異性PCR產物擴增步驟。另外，在使用預先調整好的引子對的多重PCR的擴增步驟的前可包含最佳化步驟，以改善其后的擴增步驟的效率。
在本發明的最佳化步驟中，例如，一個全面性的引子最佳化提供了一個用來增加后續的PCR反應的可用率的方法。這個方法是利用觸減PCR操作流程，并且縮小最佳溫度下降梯度區段到70～60℃和75～65℃。之后引子對能夠被置于這兩個溫度梯度區段。在一實際運作中，96個引子對被置入反應中，而多重PCR產物的可用率達到92.7％。在之后的基因型定型應用中，成功的比率能夠達到84.4％。
在PCR反應中，較佳者，是使用熱穩定的Taq DNA鏈聚合酶加上能夠校讀產物的pfu(商品名)DNA鏈聚合酶，以提高PCR產物的序列可信度。
同步PCR擴增反應是采用多重PCR和寬松觸減策略來進行，如此整體的目標DNA序列分子可以通過這個步驟被增加。在一同步擴增反應的實際操作中，粘合溫度梯度(例如67～57℃和72～62℃)的3℃溫度下降量已經被證實是一個適當的溫度下降量。這些數量增加的目標序列分子群在純化處理之后就可以進行接下來的特異性擴增。
特定引子的特異性擴增反應可以借著采用PCR和嚴謹觸減策略，擴增特定目標序列分子的數量。在一特異性擴增的實際操作中，粘合溫度梯度(例如73-63℃和78-68℃)的3℃的溫度增加量已經被證實是適當的溫度增加量。特異性的PCR產物需要進一步的純化處理，然后使用在其它的應用中。要判斷SNP位置的比較好的具體運用方法，是將PCR產物予以定序。在一含有96個引子對的實際操作中，SNP定型的成功率達到88.5％。
在另一模版引導的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測(FP-TDI)的實際運用過程中，根據本發明的方法，PCR的引子被設計成具有52～56℃的融解溫度(melting temperature)，用以擴增100到250個堿基對的PCR產物，而觸減程序在同步PCR時是設定在50～60℃之間，在特異性PCR時是設定在56～66℃。
因此，它展現了高產出率、具有低成本效益，而且正確進行例如SNP基因型定型和偵測的應用。臨床樣本進行多重PCR所需費用的減少對于大規模的基因型定型也有所助益。在一個PCR反應中以高度序列可信度進行96個或更多樣本的多重擴增的能力，使得這項創新方法的應用極具有價值，尤其是使用在高產出率的SNP研究上。
從本發明的觀點來看，獲得解決的問題至少包括(1)進行多重PCR的引子對數目限制；(2)多重PCR由于假性PCR產物形成和較短DNA片段擴增效果增強所造成的可用率低下；(3)使用多重PCR時，SNP基因型定型的成功率低下。
由于它的各種特性，這個方法在以PCR為基礎的基因型定型應用上占有優勢地位。
對于熟悉本技藝的人士而言，從以下所作的詳細敘述配合附圖，本發明將能夠更清楚地被了解，其上述及其它目的及優點將會變得更明顯。


圖1是本發明所采用的較好的觸減策略及其步驟；
圖2是本發明所采用的三種觸減策略的粘合溫度；圖3是本發明的基因型定型流程，其中包括有最佳化步驟、同步擴增步驟和特異性擴增步驟；圖4-圖5是圖標SNP基因型定型擴增步驟結果的凝膠分析；圖6是以fas相關死亡區域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA區域圖標示范性的序列分析的傳統PCR；圖7是以fas相關死亡區域蛋白(fas-associated death domain；FADD)基因的特定DNA區域圖標示范性的序列分析的采用結合觸減策略的多重PCR的基因型定型方法；圖8-圖9是在多重-熒光偏極化檢測中的特異性PCR結果的凝膠分析；圖10是本發明的多重-熒光偏極化檢測的分別圖標示范性的點狀圖表；圖11是傳統的單純-熒光偏極化檢測的分別圖標示范性的點狀圖表。
具體實施例方式
參閱圖1-圖3所示，根據本發明，在條件化的觸減策略多重PCR中包括用來增加粘合到模版上的引子的同步擴增步驟，接著是特異性擴增步驟，它是用來增加所要的序列的數量，如圖1所示，同步擴增PCR和特異性PCR都采用了觸減策略。特別是，寬松的觸減策略(LTS)被加入同步擴增PCR之中，目的是為了大量增加粘合到模版的引子數量，這里是以低于理想粘合溫度(To)一個溫度下降量(Td)的粘合溫度來進行。相反的，嚴謹的觸減策略(STS)是用在特異性PCR，以高于理想粘合溫度一個溫度增加量(Ti)的粘合溫度，特異性地擴增指定的DNA序列。這個結合了觸減策略的同步擴增PCR和特異性PCR的方式，達到了快速而且經濟上能夠負擔的多重目標DNA序列分子同步擴增的目的。
不過，這兩個擴增步驟的任何一個都能夠以觸減策略進行。詳細的說，有兩個不同于圖1所顯示的運用方法的變化方法。
如圖2所示，除了圖1所顯示的以第三型所設計運用的方法以外，第一型是寬松觸減策略的同步擴增PCR，而第二型是嚴謹觸減策略的特異性PCR。
關于多重基因型定型根據本發明的方法，在典型的基因型定型應用中會使用多個引子對一起擴增多個目標序列，例如使用基因組DNA分析多重SNP位置，這可以以三個步驟完成(1)對預先調整好的引子對進行最佳化步驟；(2)對多重PCR的引子對進行寬松觸減策略的同步擴增步驟；(3)以嚴謹觸減策略對數種PCR產物進行特異性擴增。
圖3為示范性的工作流程。圖3說明了一個比較好的基因型定型工作流程，其中整合了本發明的條件化觸減策略多重PCR，它包含最佳步驟10、同步擴增步驟20、以及特異性擴增步驟30。
在標準的最佳化過程(MOPCR)中，兩個基因組DNA樣本和混和的多個引子對被置入以各種觸減熱循環條件執行的擴增反應步驟中，以便調整出最佳化的多重PCR條件。接著凝膠分析40、DNA定序分析50被用來評估PCR和基因型定型的成果。
在PCR條件最佳化步驟之后，大規模的多重PCR在96孔的檢測盤上進行，每一個孔包含了一個來自特定個體的基因組DNA樣本。該結果由凝膠分析40和定序分析50進行解析。這個方法的核心技術包括了分別采用LTS和STS的同步擴增20和特定擴增30步驟。
相較于傳統的多重PCR，這個方法使用寬松觸減策略和嚴謹觸減策略，因此增加多重PCR的可用率、其后的應用的成功率、以及PCR擴增產物的序列可信度。
1、最佳化步驟使用在多重PCR中的引子，最好是以多個預先調整參數仔細設計，這些參數包括產物大小、引子寡核甘酸長度、融解溫度、GC堿基含量、以及其它參數，如表1所示。要設計數十個或數百個引子時建議使用精密的引子設計軟件。在一較佳實施例中，采用Primer3(麻省理工學院，美國麻州)。
表1

最佳化步驟是通過使用同一個基因組DNA樣本和每一個引子對進行PCR來完成觸減PCR的循環模式，也就是所謂的觸減程序包括(1)模版置于94℃4分鐘變性分離；(2)模版置于94℃變性分離40秒，接著置于粘合溫度40秒，此時粘合溫度依照設計的溫度梯度每個循環粘合溫度下降1℃，之后置于72℃進行引子延伸反應，總共要進行10個循環下降10℃；(3)模版置于94℃變性分離40秒，接著置于最終觸減點(touchdownpoint)溫度40秒，然后在72℃進行引子延伸反應3分鐘，總共要進行25次循環；(4)引子置于72℃進行延伸反應5分鐘。為了要調整到最佳的觸減策略多重PCR的反應條件，有多個粘合溫度溫度梯度下降區段被拿來測試，用以判斷出多重PCR最佳的溫度區段。在較佳實施例中，這些溫度區段包括60～50℃、65～55℃、70～60℃、以及75～65℃。在例示程序中，70～60℃涵蓋了大部分各種多重PCR的最佳區段。較佳者，在最佳化過程的某個溫度梯度中被證實有最佳表現的引子對最好混合在一起，并且使用在之后的多重PCR中。
2、同步擴增步驟在同步擴增步驟20中，借著引進多個會粘合在目標序列兩旁的引子，對到每一個單獨的PCR反應中，想要的DNA片段就能被同時擴增。在這個例子中，96個引子對被混合，并且在96孔的檢測盤中被使用來進行多重PCR，每一個孔都含有一個不同個體的基因組DNA樣本。為了要增加目標序列能同時被他們的特異性引子對粘合上，并且一起擴增的機率，在這里采用了一個寬松的條件，例如LTS。在一較佳實施例中，在溫度梯度(例如67～57℃以及72～62℃)中采用3℃的溫度下降量已經被證實是適當的溫度下降量。
借著使用寬松的觸減策略以及將試劑調整到適當的條件來進行PCR。在較佳實施例中，使用熱穩定的DNA鏈聚合酶(例如Taq DNA鏈聚合酶)加上pfu DNA鏈聚合酶(一個具校讀功能的DNA鏈聚合酶)，而且緩沖液中的氯化鉀(KCl)和氯化鎂(MgCl2)的濃度要調整到制造廠商所建議的濃度的1.5倍。
另外一種選擇是使用TPC(Taiwan Proteomics Company，臺灣蛋白體生物科技公司)的Taq DNA鏈聚合酶(最后濃度0.04U/微升(μl))、pfu DNA鏈聚合酶(最后濃度0.0005U/微升；美國加州Stratagene公司制造)、1.5倍濃度的制造商的10X PCR緩沖液(內含100毫摩爾濃度的三氫氧甲胺基甲烷-氯化氫鹽(Tris-HCl)pH9.0、15毫摩爾濃度的MgCl2、500毫摩爾濃度的KCl、1％明膠蛋白(gelatin)、以及1％Triton X-100(接口活性劑商品名))、0.25毫摩爾濃度的dNTP、0.025或0.05微摩爾濃度(μM)的每一種引子、以及25-50毫微克(ng)的基因組DNA。同步擴增所使用的熱循環模式已經在具有延長的延伸反應時間和寬松觸減程序的最佳化步驟20的部分描述過了。所有的PCR產物會被70％的酒精或是其它過濾方法來純化(clean up)。較佳者，使用多重篩選PCR96孔過濾系統(Multi-screen PCR 96-well filtration system，美國麻州的Millipore公司所制造)。在純化之后，這些PCR產物已經可以準備用在下一步的特異性擴增步驟。在每一個反應產生的PCR產物都擁有大量的目標DNA序列分子，例如想要的SNP位置的序列分子群。
3、特異性擴增步驟在特異性擴增步驟30中使用特異性的引子對，并且進一步地擴增每一個PCR反應中特定目標序列分子的數量。這里會采用一個嚴謹的條件，也就是采用較高的粘合溫度梯度的STS，以便能夠達到引子粘合到模版的的特異性。在一較佳實施例中，在溫度梯度(例如73～63℃以及78～68℃)中采用3℃的溫度升高量已經被證實是適當的溫度增量。
這里的PCR反應的細節，除了DNA模版是來自于擴增步驟20的產物，以及采用了嚴謹的觸減程序之外，就如同最佳化步驟10中所提到的一樣。此外，在每一個擴增循環中引子延伸反應的時間縮短到1分30秒，而不是同步擴增步驟20的3分鐘。
在較佳實施例中，將同步擴增反應中PCR產物的1/150置入PCR反應。如果要進行進一步的應用，純化的步驟是需要的。例如，最后的PCR產物為了要做SNP基因型定型，以美商應用生命系統公司(Applied Biosystems)的DNA分析儀3700做DNA定序。
提供下列的資料是為了要以更具體的方式描述上述的DNA基因型定型過程，不過本發明的技術范疇并不局限于這個例子。
在本發明的一個實施例中，從國立臺灣大學附設醫院收集了96個基因組DNA樣本。樣本的詳細使用經過完善的說明，并且從每個樣本捐贈者取得了同意書。所有的基因組DNA樣本都經過標準程序純化，并且在使用之前都儲存在零下20℃。為了要達到多重PCR最好的條件，先將兩個基因組DNA樣本使用在最佳化步驟10。在同步擴增步驟20中，96個引子對被混合在100微升的PCR試劑中，試劑中包括了的前所敘述的成分。操作PCR試劑的詳細過程也被敘述在相關的地方。在特異性擴增步驟30中，每一個被設計來判定特定基因座的96個引子對分別被置于檢測盤的96個不同的孔中。從同步擴增步驟20所得到的PCR產物的1/150，被當作模版使用在這每一個平行的嚴謹觸減策略PCR反應之中。這些PCR反應所產生的PCR產物利用2％凝膠以及美商應用生命系統公司的DNA分析儀3700進行解析，用以確認它們的基因型。在同步擴增和特異性擴增步驟中，所得的PCR產物被置入美商密理博生命科學公司(Millipore)的多重篩選PCR96孔過濾系統進行純化。
圖4說明了從特異性擴增步驟所得到的部分結果。96個PCR產物中的24個被圖標在圖4，此處有兩個不同的引子濃度0.05微摩爾濃度和0.025微摩爾濃度。結果從凝膠上的觀察得知這在兩個濃度之間的引子濃度所得到的結果并無不同，甚至使用0.025微摩爾濃度時所得的結果也是一樣。
另一方面，在圖5中，以50和25毫微克的基因組DNA在同步擴增步驟中當作模版證實了較低量的基因組DNA，25微毫克在多重PCR中可以達到較高的可用率。換句話說，以25微毫克的基因組DNA在同步擴增步驟中當作模版，在相同的方法的下被發現相較于50微毫克的基因組DNA，可以提高特異性擴增步驟所得的可用率。由這些資料證實了以本發明的方法進行基因型定型只需要微量的基因組DNA，25微毫克或是更少的量。
提供圖6和圖7是為了提出一個實例，證實只使用傳統PCR和使用LTS與STS的多重PCR進行SNP基因型定型所得的結果之間的一致性。定序結果的型態的一致性分別被顯示在圖6及圖7，以封閉長方形圈出的是SNP的位置。使用本發明的多基因型定型方法被發現不會有偏向判定出某個特定的基因型，在兩個基因定序結果的型態上也沒有不同之處。
除此之外，已經檢驗過了50個SNP基因座，而且使用兩種中任何一種方法都不會有偏向特定的基因型的結果出現。
模版引導的終止染料分子并入的熒光偏極化偵測法(FP-TDI)雖然FP-TDI測量是目前數種不同的自動化基因型定型方法中的一種，但是它有許多優點，例如容易使用、穩定的表現和能夠負擔的費用。它也是本發明的一種相當好的應用。
下面是一個實際的實驗，用以說明目前本發明的特點。
1、引子的設計PCR引子被設計成具有52～56℃的融解溫度，用來擴增100個堿基對到250個堿基對長的PCR產物。
2、多重PCR擴增方法與前面所敘述的方法相同，除了在同步PCR步驟的觸減程序改為60～50℃，而特異性擴增PCR步驟的觸減程序則為66～56℃。
圖8-圖9是多重熒光偏極化檢測(multiplex-FP)中的特異性PCR產物的凝膠分析，有46個引子對，而且其可用率將近89.1％。
圖10顯示的是根據本發明所做的多重熒光偏極化檢測的點狀圖，而圖11是傳統的單一熒光偏極化檢測(simplex-FP)的點狀圖。TAMRA的學名為Carboxytetramethylrhodamine，即羧基四甲基若丹明，為一熒光標記分子，此處并使用另一種若丹明熒光標記分子R110。此圖可分成四個區域，左上和右下角區域都是同型合子(homozygote)基因型，右上角為異型合子(heterozygote)基因型，左下角為陰性控制組(negtive control)。XY軸的數值代表的是測得的熒光偏極化值的千分之一(milli-polarization(mP))。
將條件化的觸減策略整合到這里所提的多重PCR是從未有過，首次出現的，而且已經被證實對于解決在基因型定型中所采用的多重PCR技術所遭遇到的，由于引子錯誤起始造成的PCR產物的困難有所助益。在多重PCR中的引子有效數目，已經不再像傳統的方法無法超過10對，而能夠達到至少96個引子對。
當本發明被運用在疾病診斷上時，至少有96個基因上的位置能夠被判斷出來，就如同例子中所描述的，而不像傳統方法只能判斷1個或多個基因。
此外，相較于其它方法用在大規模基因型定型上時，本發明的方法只需要少量的基因組DNA樣本。更有甚者，相較于其它基因型定型方法必需配備昂貴、復雜的設備和試劑，本發明的高產出率和具低成本效益的特性也不會妨礙到檢測設計上的簡單性。
關于本發明的有力的應用本發明可以運用在下面所舉列的不同方面，但不僅限于此1、從少量的基因組DNA進行大規模和高產出率的基因型定型；2、作為多重疾病或復雜疾病的篩檢套件；3、作為遺傳或感染疾病的篩檢套件；4、作為藥物效力的預測套件。
以上對于本發明的較佳實施例所作的敘述是為闡明的目的，并非限定本發明的保護范圍，凡從本發明的實施例學習而作修改或變化，都屬于本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種熒光偏極化偵測法的方法，其特征是它包括下列步驟(1)通過采用第一觸減程序的多重鏈聚合酶連鎖反應在一帶有許多引子對以及基因組DNA的混合液中，同步擴增多種核甘酸序列分子；(2)采用第二觸減程序的多重獨立鏈聚合酶連鎖反應，每一該獨立鏈聚合酶連鎖反應通過一對指定的引子擴增來自前一步驟制造的多重鏈聚合酶連鎖反應產物中的一特定的核甘酸序列分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度等于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二溫度高于該最佳化的粘合溫度，該最佳化的粘合溫度是通過兩個基因組DNA樣本和混和的多個引子對被置入以各種觸減熱循環條件，執行的擴增反應步驟中，調整出最佳化的粘合溫度。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二溫度等于該最佳化的粘合溫度，該最佳化的粘合溫度是通過兩個基因組DNA樣本和混和的多個引子對被置入以各種觸減熱循環條件，執行的擴增反應步驟中，調整出最佳化的粘合溫度。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是該第一觸減程序使用第一粘合溫度低于一最佳化的粘合溫度，并且該第二觸減程序使用第二溫度高于該最佳化的粘合溫度，該最佳化的粘合溫度是通過兩個基因組DNA樣本和混和的多個引子對被置入以各種觸減熱循環條件，執行的擴增反應步驟中，調整出最佳化的粘合溫度。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是它更包括一設計該引子的步驟，以具備一融解溫度在一范圍內，供一數量的鏈聚合酶連鎖反應產物的擴增。
全文摘要
一種熒光偏極化偵測法的方法，改良的多重鏈聚合酶連鎖反應包括一個同步鏈聚合酶連鎖反應以及一個特異性鏈聚合酶連鎖反應，而且這兩個擴增步驟皆可以觸減策略來進行，其中寬松的觸減策略是以低于最佳粘合溫度的溫度來使用，而嚴謹的觸減策略是以高于最佳粘合溫度的溫度來使用。通過整合一個兩階段的擴增反應以及采用條件化觸減策略的多重鏈聚合酶連鎖反應，達成同時以高可信度和高可用率擴增多個DNA序列，且具有高產出率以及低成本效益的方法。
文檔編號C12P19/34GK1854311SQ20061006552
公開日2006年11月1日 申請日期2003年10月15日 優先權日2003年5月29日
發明者黃渝棋, 鄭蕓蕓 申請人:賽亞基因科技股份有限公司