專利名稱：一種含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法，屬于家畜胚胎工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代繁殖生物技術(shù)的發(fā)展及胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的逐步完善，利用體外受精技術(shù)生產(chǎn)體外胚胎呈現(xiàn)出潛在的廣闊應(yīng)用前景。家畜胚胎體外生產(chǎn)尤其是體細(xì)胞核移植是快速擴(kuò)大優(yōu)秀種群數(shù)量的有效途徑。雖然通過體外受精技術(shù)已經(jīng)獲得了活的后代，但體外受精后的早期胚胎體外發(fā)育率較低，限制了胚胎體外生產(chǎn)在實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。
由于生殖道內(nèi)氧的濃度為7％左右，但胚胎的體外培養(yǎng)在約含20％氧氣的培養(yǎng)箱中完成，因此產(chǎn)生了比體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)更高的自由基濃度。自由基是細(xì)胞內(nèi)正常代謝中產(chǎn)生的，在體內(nèi)正常環(huán)境下，自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)。當(dāng)自由基過量或持續(xù)產(chǎn)生時(shí)，平衡遭到破壞，過量的自由基會損害細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、核酸以及蛋白質(zhì)，使有關(guān)早期胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)沒有得到表達(dá)或蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞，因而早期胚胎體外發(fā)育率較低，嚴(yán)重影響了胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)在家畜育種中的應(yīng)用。體內(nèi)，維持自由基平衡的抗氧化劑主要是一系列的酶類如抗氧化物歧化酶、過氧化氫酶等。但常規(guī)的胚胎體外培養(yǎng)液(SOF培養(yǎng)液)中，這些抗氧化的物質(zhì)是缺乏的，因而不能有效的去除過多的自由基，導(dǎo)致胚胎早期發(fā)育率較低。
茶是世界上最流行的飲料之一。茶多酚是茶葉中主要的多羥基酚類物質(zhì)，約占茶葉干重的20～30％，主要包括兒茶素、黃酮甙類、花青甙類、酚酸類等三十多種多酚成分，它們具有較強(qiáng)的抗氧化和抗自由基的活性，是自由基如過氧化物陰離子、過氧化氫、羥基自由基的清除劑。對于茶多酚的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。CN1142481A、CN1071660A、CN1194966A、CN1094706A、CN1104621A、CN1386731A、CN1546484A等多種專利申請公開了茶多酚的提取方法。CN1153019A、CN1284275A、CN1365633A等多種專利公開了茶多酚用作保健品的用途。而CN1314148A、CN1314149A、CN1640393A等多種專利公開了茶多酚用作藥物的用途。但到目前為止，尚未見有關(guān)茶多酚用于家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于胚胎體外培養(yǎng)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中牛胚胎體外培養(yǎng)液中自由基過多、導(dǎo)致胚胎早期發(fā)育率較低的不足，提供了一種具有及時(shí)清除胚胎胞體內(nèi)及培養(yǎng)環(huán)境中過量自由基、提高早期胚胎體外發(fā)育率功能的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有20～80μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素及5～10mg/mL的血清白蛋白。
茶多酚(Green Tea Polyphenols，簡稱GTP)是茶葉溶劑浸提物中與亞鐵離子產(chǎn)生綜合反應(yīng)的酚類化合物的總稱，包括兒茶素、黃酮類化合物、花青素、酚酸等四大類物質(zhì)，有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)廠家有浙大茶葉科技有限公司、浙江紹興佳利保健制品有限公司、江西綠源生物有限公司、安徽茶多酚廠等。本發(fā)明中所用茶多酚由浙大茶葉科技有限公司提供，純度為99％。
具體的，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液每1000mL組成如下茶多酚20～80mg，青霉素100000IU，鏈霉素100000μg，血清白蛋白5～10g，常規(guī)培養(yǎng)液補(bǔ)足至1000mL。
所述常規(guī)培養(yǎng)液為常用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液，本發(fā)明中選用人工合成輸卵管液(synthetic oviduct fluid，SOF)。
所述牛胚胎來自為奶牛或者黃牛。所述的血清為小牛血清、胎牛血清或者新生牛血清中一種。
優(yōu)選的，所述茶多酚含量為20～80μg/mL，所述牛血清白蛋白含量為8mg/mL。
一種應(yīng)用所述含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，所述的方法是將受精后的早期牛胚胎用人合成輸卵管液反復(fù)沖洗后，放入所述含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中，于38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。
所述早期牛胚胎由牛卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法如下從屠宰場獲取的卵巢中用注射器抽取的牛卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20～24小時(shí)，獲得成熟的牛卵母細(xì)胞。所述成熟培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有100IU/mL的青鏈霉素及體積百分含量8％～20％的血清，所述常規(guī)培養(yǎng)液為M199、DMEM、F12、MEM培養(yǎng)液中的一種或兩種或兩種以上的混合物。
牛卵母細(xì)胞體外受精方法如下將成熟的牛卵母細(xì)胞與精子一同放入受精培養(yǎng)液中，在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)15～18小時(shí)，進(jìn)行受精，獲得早期牛胚胎。所述受精培養(yǎng)液為含5～10mg/mL肝素的BO液或Tyrode’s改良液。
本發(fā)明胚胎體外培養(yǎng)液，是根據(jù)胚胎體外培養(yǎng)時(shí)抗氧化、抗自由基的需要，結(jié)合茶多酚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能研制而成。茶多酚結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，可提供活潑氫使自由基滅活，本身被氧化形成含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的自由基而具有較高穩(wěn)定性，是優(yōu)良的提供氫的自由基清除劑。茶多酚不僅可清除鏈引發(fā)階段的羥基自由基、過氧化物陰離子自由基，而且還是斷鏈型抗氧化劑，可清除鏈反應(yīng)中間產(chǎn)物脂過氧化自由基和烷氧自由基，從而阻止脂自由基的傳播擴(kuò)增。此外茶多酚能調(diào)動和激活細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等)的生理活性，在抗氧化作用上與以上物質(zhì)具有協(xié)同作用，能夠更好地發(fā)揮防御體統(tǒng)的作用，維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡。因此茶多酚應(yīng)用于牛胚胎體外培養(yǎng)，可以有效地去除培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的多余自由基，解決了目前牛早期胚胎體外發(fā)育率低的問題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1制備含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液準(zhǔn)確稱取茶多酚5mg，先用20mL的SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)液溶解，然后向培養(yǎng)液中加入800mg牛血清白蛋白和1萬國際單位的青霉素，1萬微克的鏈霉素，輕微攪拌均勻，再加入SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)液至100毫升，再次攪拌混勻。用0.22μM的微濾膜(MilliporeCorporation，Bedford.Mass.USA)抽濾消毒后，在4℃下貯存，備用。
實(shí)施例2含茶多酚的培養(yǎng)液用于奶牛胚胎體外培養(yǎng)奶牛卵母細(xì)胞在含有100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素和體積百分含量為8％～20％血清的M199培養(yǎng)液(購自美國GIBCO公司)中成熟培養(yǎng)，然后進(jìn)行體外受精。受精后的早期胚胎分別在不含茶多酚的SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)液(對照組)及實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)8天。培養(yǎng)的第2天，對照組中的早期胚胎分裂率為69.1％，在實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎分裂率為78.7％，比對照組提高9.6％。培養(yǎng)的第8天，對照組中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為19.1％，在實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為32.3％，比對照組提高13.2％。結(jié)果證實(shí)，含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液體外培養(yǎng)奶牛胚胎可有效提高受精后的早期胚胎發(fā)育率。
實(shí)施例3含茶多酚的培養(yǎng)液用于黃牛胚胎體外培養(yǎng)黃牛卵母細(xì)胞在含有100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素和體積百分含量為8％～20％血清的M199培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)，然后進(jìn)行體外受精。受精后的早期胚胎分別在不含茶多酚的SOF基礎(chǔ)培養(yǎng)液(對照組)及實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)8天。培養(yǎng)的第2天，對照組中的早期胚胎分裂率為72.4％，在實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎分裂率為81.3％，比對照組提高8.9％。培養(yǎng)的第8天，對照組中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為21.7％，在實(shí)施例1制備的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中的早期胚胎囊胚期發(fā)育率為33.1％，比對照組提高11.4％。結(jié)果證實(shí)，含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液體外培養(yǎng)黃牛胚胎可有效提高受精后的早期胚胎發(fā)育率。
權(quán)利要求
1.一種含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述牛胚胎體外培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有20～80μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素及5～10mg/mL的血清白蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述牛胚胎體外培養(yǎng)液每1000mL組成如下茶多酚20～80mg青霉素100000IU鏈霉素100000μg血清白蛋白5～10g常規(guī)培養(yǎng)液補(bǔ)足至1000mL。
3.如權(quán)利要求1或2所述的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述常規(guī)培養(yǎng)液為人工合成輸卵管液。
4.如權(quán)利要求1或2所述的含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，其特征在于所述茶多酚含量為20～80μg/mL，所述牛血清白蛋白含量為8mg/mL。
5.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述的方法是將受精后的早期牛胚胎用人合成輸卵管液反復(fù)沖洗后，放入所述含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液中，于38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)，進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述早期牛胎由牛卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法如下從屠宰場獲取的卵巢中用注射器抽取的牛卵母細(xì)胞，用成熟培養(yǎng)液在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)20～24小時(shí)，獲得成熟的牛卵母細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6所述的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述成熟培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素及體積百分含量8％～20％的血清，所述常規(guī)培養(yǎng)液為M199、DMEM、F12、MEM培養(yǎng)液中的一種或兩種或兩種以上的混合物。
9.如權(quán)利要求6所述的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述牛卵母細(xì)胞體外受精方法如下將成熟的牛卵母細(xì)胞與精子一同放入受精培養(yǎng)液中，在38～39℃、5％CO2的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)15～18小時(shí)，進(jìn)行受精，獲得早期牛胚胎。
10.如權(quán)利要求9所述的牛胚胎體外培養(yǎng)方法，其特征在于所述受精培養(yǎng)液為含5～10mg/mL肝素的BO液或Tyrode’s改良液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含茶多酚的牛胚胎體外培養(yǎng)液，所述牛胚胎體外培養(yǎng)液以常規(guī)培養(yǎng)液為基質(zhì)，所述基質(zhì)中還含有20～80μg/mL的茶多酚、100IU/mL的青霉素、100μg/mL的鏈霉素及5～10mg/mL的血清白蛋白。本發(fā)明將茶多酚應(yīng)用到牛胚胎體外培養(yǎng)領(lǐng)域，提高了牛體外受精胚胎的早期體外發(fā)育率。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N5/073GK1904039SQ20061005270
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者王爭光, 俞頌東, 陳阿琴 申請人:浙江大學(xué)