專利名稱：蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素提取工藝及其制劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素提取工藝及其制劑。
背景技術：
稗草是全球最難防除的雜草之一，目前主要依靠化學除草劑來防治。然而化學除草劑的長期使用使稗草的抗(耐)藥性問題及環境污染問題越來越嚴重。開發安全高效的生物除草劑符合農業可持續發展要求，雖然目前生物除草劑還不能完全替代化學除草劑，但它能有效減少化學除草劑的使用劑量，從而減少對環境的污染。
另外，水稻紋枯病是由土壤真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的一類嚴重制約水稻生產的全球性水稻病害。發病嚴重的區域水稻減產可達50％。由于缺少抗紋枯病的供體，目前世界上尚未育出真正意義上的抗紋枯病的水稻品種，因此開發高效安全的殺菌劑，尤其是天然來源的殺菌劑尤為重要。目前國內防治水稻紋枯病主要利用井岡霉素，雖然井岡霉素是一種低毒的生物農藥，但是往往需要多次用藥才能達到良好的防治效果，成本較高。國際上水稻紋枯病的生防菌主要有枯草芽孢桿菌屬和假單孢菌屬細菌及木霉菌屬真菌。利用植物病原菌，尤其是雜草生防菌蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolaris eleusines)防治水稻紋枯病可以充分利用有限的植物病原菌資源，拓寬篩選殺菌劑菌種范圍，從而獲得高效安全的天然殺菌劑。蟋蟀草平臍蠕孢菌是澳大利亞的Alcorn& R.G.Shivas首次從感病蟋蟀草時片上分離得到，并在Mycotaxon 1990年39卷第366-370頁詳細描述其形態特征，并已將模式菌株保藏于全球生物多樣性信息機構(Global Biodiversity Information Facliity，簡稱GBIF)。但對它的應用研究目前還未見報道。蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種可以直接從市場上購買得到，也可以從感病蟋蟀草葉片上重復分離得到。
因此，研制開發生產成本低、使用效果理想的生物除草劑和防菌劑為本領域技術人員目前的重要課題。
發明內容
本發明目的在于克服現有技術中存在的問題，提供一種平臍蠕孢菌培養物的提取工藝和其總提物制劑。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素提取工藝，其特征在于包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolaris eleusines)接種于PDB培養基，在溫度2g±2℃下，液體發酵培養14天，發酵培養物通過4層紗布過濾，分離菌絲體和發酵液；2)菌絲體用適量乙酸乙酯或正己烷或三氯甲烷浸提3次，合并浸提液并減壓濃縮，得到墨綠色油狀濃縮物；3)發酵液在40℃下減壓濃縮到原始體積的一半后用等體積乙酸乙酯或正己烷或三氯甲烷分3次萃取，萃取相加少量水洗滌后減壓濃縮得到棕褐色油狀物；4)將上述兩種油狀物質合并即為蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物，即蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于含有10-50％的蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于按下列組分及配比制成乳油制劑蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物10-50％，乳化劑5-15％，滲透劑8-15％，有機溶劑30-75％。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于按下列組分及配比制成懸乳制劑蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物10-50％，乳化劑5-15％，增稠劑1-3％，防凍劑1-4％，分散劑1-3％，植物油1-3％，穩定劑2-5％，余量為水。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于所述的乳化劑為農乳500號+寧乳34號，或乳化劑0204，即十二烷基苯磺酸鈣+烷基酚聚氧乙烯醚，滲透劑為二甲基亞砜或二甲基甲酰胺，有機溶劑為二甲苯或甲苯。
所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于所述的乳化劑為農乳500號+寧乳34號，或旅2101+農乳500號，增稠劑為CMC、黃原膠、海藻酸鈉、硅藻土中的一種，防凍劑為脲、乙二醇、聚乙二醇、甘油中的一種，分散劑為木質素磺酸鈉、NNO中的一種，植物油為棉籽油、菜籽油、蓖麻油酸中的一種，穩定劑為奶粉、大豆粉、褐藻酸鈉中的一種。
蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolaris eleusines)從感病蟋蟀草中分離得到，該菌種和分離方法均為已有公知技術，并可重復分離獲得，其培養方法也屬已有公知技術。
本發明的提取工藝簡單易行，其總提物制劑乳油制劑和懸乳劑，均屬于微生物除草劑和微生物殺菌劑，具有防治雜草和防治稻紋桔病的作用，其對人畜無毒，無殘留藥害發生，對環境友好，對雜草和病害防治效果好，屬發酵生產、提取和加工而成的生物農藥。
具體實施例方式
根據上述提取工藝得到的蟋蟀草平臍蠕孢菌總提物，按下列配方和工藝生產平臍蠕孢發酵產物總提物乳油制劑和懸乳劑。兩種制劑中還可以含有為了獲得特殊效果的其它有效成分。
1.蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油制劑表1蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油配方
按表1所示配方，將蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物、乳化劑、滲透劑和有機溶劑在室溫下按比例混合，攪拌至全溶，即得蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油制劑成品。
2.蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑表2蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑配方
按表2所示配方配好物料、混合，加熱至50℃，用攪拌機攪拌均勻，再加入水，然后用膠體磨(或球磨機)研磨，再用砂磨機進一步研磨至需要的細度。
蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑中還可以含有其它添加劑，如穩定劑、防腐劑、滲透劑、比重調節劑或為了獲得特殊效果的其它有效成分。
3.蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對雜草的防治效果及其對水稻的安全性評價。(1)室內生物測定結果取稗草種子和水稻種子，水稻品種為粳稻秀水11、秈稻03-133和雜交稻187，經浸種催芽后，挑選10粒預先催芽至芽長2mm左右的種子放入加有蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油水溶液的直徑7cm培養皿(皿內鋪一張濾紙)中，設不施藥空白對照，置培養箱內于27±1℃下培養2-3天，測量根長并計算根長抑制率，根據抑制率計算IC50值(提供50％抑制率的蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油水溶液濃度，單位為μg/mL)。被測物質樣品選取3個濃度梯度，分別為10，100，1000μg/mL，選用化學除草劑2，4-D作為正對照。試驗結果顯示蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對稗草種子胚根生長有強抑制作用，在濃度100μg/mL時對稗草根長的抑制率達50％。在濃度1000μg/mL時對稗草根長的抑制率達100％。
不同水稻品種的根系生長對蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑的敏感程度存在差異，但其抑制率均小于20％，且能夠在7天后恢復，以后生長正常。因此，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑對水稻安全。
(2)田間小區試驗結果供試水稻品種為雜交稻中9優288，移栽時秧齡25天(d)，株行距15cm×15cm，移栽后10-15d施氮肥75kg/hm2，田間水管理同常規種植。移栽后7d用蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油處理，試驗設4個單劑和2個復配劑處理，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑水溶液濃度分別為667g a.i./hm2、534g a.i./hm2、334g a.i./hm2、和133g a.i./hm2，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油534g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2、蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油667g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑534g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2、蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑667g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2，設化學除草劑50％二氯喹啉酸225g a.i./hm2對照，和不施藥空白對照。在用藥后14d和28d調查水稻安全性和稗草防效。
試驗結果表明蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑在田閥使用時，隨著使用劑量增加對稗草莖數和稗草植株鮮重的防效顯著提高，當劑量提高到534g a.i./hm2和667g a.i./hm2時，稗草莖數和植株鮮重防效均達到65％以上。當蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油或懸乳劑與低劑量增效劑混用，雜草防治效果顯著提高，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油534ga.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2、蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油667g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2、蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑534g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2以及蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物懸乳劑667g a.i./hm2+增效劑56.25g a.i./hm2，對雜草的防治效果均達到90％以上。
4.蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對紋枯病菌的抑制活性。(1)室內生物測定結果分別取蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑，加無菌水配制水溶液，使濃度為4mg/mL，用0.22μm微孔濾膜過濾得無菌毒素溶液。用熔化并冷卻到45～50℃的PDA培養基調節該水溶液濃度分別為200，100，50和25μg/mL。對照PDA培養基內加入2.5mL無菌水。另設井岡霉素(5％有效成分)200，100，50和25μg/mL為殺菌劑對照。從培養2d的紋枯病菌落邊緣取直徑7mm菌塊接種于上述平板中央，28℃培養24小時(h)，用十字交叉法測量菌落直徑，并按下式計算蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對紋枯病菌的抑制率。
試驗結果顯示蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對紋枯病菌菌絲生長的抑制作用顯著高于對照井岡霉素(見表3)，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑在200μg/mL濃度下可以100％抑制紋枯病菌菌絲生長，而5％井岡霉素在相同濃度時只能達到45.2％的抑制率。可見蟋蟀草平臍蠕孢菌菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對水稻紋枯病菌有較強的抑菌作用，其抑菌效果優于目前常用的井岡霉素，可以開發作為抑菌劑。
表3蟋蟀草平臍蠕孢菌菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對水稻紋枯病菌的抑制作用
所示抑制率為3次重復結果的平均值，方差分析p＜0.05；(2)田間小區試驗結果水稻紋枯病菌接種至PDA培養基上，室溫培養5d.稱取60g干燥的米糠和谷殼(1∶3)置于1L三角瓶中，加120mL去離子水潤濕，在100kPa、121℃滅菌40分鐘，冷卻后，用培養好的紋枯病菌接種，室溫(25-30℃)培養7d。
選擇易感紋枯病菌的雜交水稻品種中9優288，25d秧齡時移栽，株行距15cm×15cm，移栽后20d施尿素75kg/hm2，田間水管理同常規。水稻移栽后45d人工接種紋枯病菌至水稻根部，接種后三天用蟋蟀草平臍蠕孢菌菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑1000g a.i./hm2，800g a.i./hm2，500g a.i./hm2和200ga.i./hm2重復3次，設井岡霉素殺菌劑對照和水空白對照，處理后14d調查水稻紋枯病防效。
試驗結果見表4，在田間使用時，蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑1000g a.i./hm2對水稻紋枯病的防效均達到80％以上。在500ga.i./hm2處理對水稻紋枯病的防效接近50％，與1500g a.i./hm2劑量的井岡霉素抑菌效果相當。可見蟋蟀草平臍蠕孢菌菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對水稻紋枯病菌具有良好的防治效果。
表4蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物乳油和懸乳劑對水稻紋枯病的防治效果(％)
所示抑制率為3次重復結果的平均值，方差分析p＜0.05。
權利要求
1.蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素提取工藝，其特征在于包括以下工藝步驟1)蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolaris eleusines)接種于PDB培養基，在溫度28±2℃下，液體發酵培養14天，發酵培養物通過4層紗布過濾，分離菌絲體和發酵液；2)菌絲體用適量乙酸乙酯或正己烷或三氯甲烷浸提3次，合并浸提液并減壓濃縮，得到墨綠色油狀濃縮物；3)發酵液在40℃下減壓濃縮到原始體積的一半后用等體積乙酸乙酯或正己烷或三氯甲烷分3次萃取，萃取相加少量水洗滌后減壓濃縮得到棕褐色油狀物；4)將上述兩種油狀物質合并即為蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物，即蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素。
2.按權利要求1所得的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于含有10-50％的蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物。
3.如權利要求2所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于按下列組分及配比制成乳油制劑蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物10-50％，乳化劑5-15％，滲透劑8-15％，有機溶劑30-75％。
4.如權利要求2所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于按下列組分及配比制成懸乳制劑蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物10-50％，乳化劑5-15％，增稠劑1-3％，防凍劑1-4％，分散劑1-3％，植物油1-3％，穩定劑2-5％，余量為水。
5.如權利要求3所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于所述的乳化劑為農乳500號+寧乳34號，或乳化劑0204，即十二烷基苯磺酸鈣+烷基酚聚氧乙烯醚，滲透劑為二甲基亞砜或二甲基甲酰胺，有機溶劑為二甲苯或甲苯。
6.如權利要求4所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，其特征在于所述的乳化劑為農乳500號+寧乳34號，或旅2101+農乳500號，增稠劑為CMC、黃原膠、海藻酸鈉、硅藻土中的一種，防凍劑為脲、乙二醇、聚乙二醇、甘油中的一種，分散劑為木質素磺酸鈉、NNO中的一種，植物油為棉籽油、菜籽油、蓖麻油酸中的一種，穩定劑為奶粉、大豆粉、褐藻酸鈉中的一種。
全文摘要
蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素提取工藝及其制劑，屬于微生物技術領域。其特征在于包括以下工藝步驟蟋蟀草平臍蠕孢菌的發酵培養物，分離出菌絲體和發酵液；菌絲體浸提液減壓濃縮，得到油狀濃縮物；發酵液減壓濃縮、萃取，萃取相加少量水洗滌后減壓濃縮得到棕褐色油狀物；將上述兩種油狀物質合并即為蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物，即蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素。所述的蟋蟀草平臍蠕孢菌粗毒素制劑，含有10－50％的蟋蟀草平臍蠕孢菌發酵產物總提物。本發明的提取工藝簡單易行，其總提物制劑乳油制劑和懸乳劑，均屬于微生物除草劑和微生物殺菌劑，具有防治雜草和防治稻紋枯病的作用，其對人畜無毒，無殘留藥害發生，對環境友好。
文檔編號C12N1/14GK1884559SQ20061005183
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月6日 優先權日2006年6月6日
發明者張建萍, 余柳青, 段桂芳 申請人:中國水稻研究所