專利名稱：：一種用于潮間帶海綿實驗室人工養殖方法
技術領域：
：本發明涉及海洋生物
技術領域：
，是在實驗室內采用海綿外植體培養方法生產海綿生物量的技術，具體地說是建立一種在實驗室內人工培養潮間帶海綿的方法。
背景技術：
：目前已知的海洋生物中，海綿是活性天然產物的最大來源，如抗腫瘤、抗真菌、甚至抗HIV的活性天然產物，并且發現從海綿中獲得的活性化合物的幾率高于海洋中的其它動植物，因此海綿藥物開發成為近年來海洋藥輛開發的熱點。但是海綿體內活性物質含量極少，一般只有濕重的10—8，"藥源供給不足問題"即無足夠的海綿量來進行提取一定數量的活性物質可供藥物深入的研究，使得一些藥物僅停留在臨床實驗階段無法繼續下去，因而"藥源供給不足問題"就成了海綿藥物開發明顯滯后的限制性因素。多種方式被嘗試去解決這一問題但都有難解決的關鍵技術，例如海綿細胞培養技術，目前還沒有建立可以連續傳代的細胞系；化學合成價格昂貴、歩驟復雜、實際可行性太低；目前普遍認為海綿工廠化人工養殖被認為是可解決"藥源供給不足問題"的較有希望的方式之一。國外有關海綿養殖方面的報道大都涉及深海的海綿，他們對于海綿外植體的養殖大多集屮在海水中的大田養殖，在水深5—10m的水體建造金屬網架、水泥盤或架設繩索，將海綿采集切塊后固定其上，但是由于受到不確定的風暴等天氣的影響，海綿死亡、被風暴帶走時常發生，致使大田養殖成功率較低，不確定性扣對較大。Stone1970年曾報道繁茂膜海綿野外自然生長狀態下以其生長而積作為指標，5個月間增長約2倍，平均每個月增長約40%，此5個月也是一年中唯一的兒個海綿生物量上升的月份。工廠化養殖山于條件可控可以避免自然氣候變化對海綿生長的影響的缺點。文獻也曾有報道在實驗室水族缸養殖海綿的資料，但其目的是研究不同種類和地域海綿的生長規律，考察外界環境條件對海綿生長影響，例如培養的溫度、鹽度、氨氮等。不同生長環境和種類的海綿，對生長環境的要求不同，體內所含有的活性物質的種類不同，所以實驗室條件下的海綿人工培養可以根據自然環境進行調控。本發明是針對潮間帶海綿的養殖方法，在實驗室內人工可控條件下培養潮間帶海綿獲得生物量以供做其相關方面研究的科研工作者使用。
發明內容-本發明的目的是提供一套有效且操作簡單，可對潮間帶海綿進行室內可控培養從而生產海綿生物量的方法。方法原理潮間帶海綿是營固生長無選擇性濾食的低等動物，再生能力較強，在合適外界環境下，從海綿上切取一塊外植休貼附于其他載體上可繼續生長。生長在溫帶的繁茂膜海綿其生長發育受到季節溫度的影響較大，呈現出春夏季節生長旺盛、秋冬季節衰退的生長規律，為海綿室內控制培養調件提供了理論基礎。為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為一種用于潮間帶海綿實驗室人工養殖方法，實驗室人工制造適宜生長環境培養潮間帶固著生長的低等動物一海綿；以實驗室人工模擬潮間帶固著生長的海綿自然生長環境來生產海綿生物量；具體步驟，將生長在潮間帶礁石上的海綿采集后，立即放入盛海水的小桶里，帶回實驗室清除海綿表面雜質及臟物，然后將海綿切割成大小適宜的小塊，放入玻璃缸中暫養，然后固定在載體上，置于培養器內，控溫、避光培養，投喂餌料藻類作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態變化及生物量變化情況作為評價指標，培養10-20天可達到原代海綿生長的生物量最大值。本發明克服了海綿實驗室養殖生長相對緩慢、周期長的問題。具體操作過程為1)海邊潮間帶礁石上采集海綿時，選擇顏色鮮艷，表面相對平坦，突起短而粗壯，表面干凈(雜質臟物較少)海綿，采集后立即將海綿置于盛海水的小桶里；2)海綿帶回實驗室后，用鑷子和注射針頭小心清理海綿體表雜質臟物時，如果碰到海綿組織內有較多泥沙石粒，則放棄選擇其他海綿，若組織內石粒較少且相對較大，則用鑷子小心取出；.3)無菌手術刀切割海綿，適宜大小為面積約3-9cm2，放入玻璃缸中暫養2—7天，至其切割和采集時形成的傷口初步愈合，完成初步愈傷過程，暫養溫度與海邊采集時溫度相適應，然后再逐漸調節到培養溫度；4)海綿用細線固定在載體上置于反應器內培養，載體大小約為海綿大小的4一8倍；5)控制海綿培養密度2-15^。(m/v),;K溫15-25r，溶氧濃度5-9mg/L;6)玻璃缸外面遮蓋一層牛皮紙或直接將反應器放置在無陽光直射的地方避免陽光直射海綿；7)培養期內，保持培養水體內的NH4+濃度低于lmg/L;8)投喂濃度為2X104—2X105的單胞藻類作為食物；靜培養每天換水，海綿以投喂餌料藻類等為主體食物；流加培養方式是根據每日流水量計算培養器內應投喂的藻類濃度；8)培養過程中，海綿貼附鋪展、形態變化用數碼相機拍照并記錄，生物量用濕重(濕海綿質量)衡量，稱量后換算成濕重增長百分比，公式如下S-(Mn-Mo)/M^100n/。，MQ,Mt分別為海綿在培養第0天和第n天的濕重；9)視海綿采集季節狀態不同培養10-20天，即可達到原代海綿生長的生物量最大值，冬春季節培養15—20天，夏秋季節培養10—15天。本發明與現有技術相比具有如下優點1.技術相對完整，首次對繁茂膜海綿給出一套完整方法用于實驗室人工養殖。2.簡單易操作，海綿載體制作、固定方法、溫度控制、光照控制、溶解氧濃度控制等均非常簡單，容易達到要求。3.應用廣泛，此方法可用于短期內生產繁茂膜海綿原代生物量；可以培養質量優良海綿提供海綿研究國際難點一細胞培養的優良材料；可以進行海綿組織塊傳代培養研究及目標活性物質調控的比較。總之，本發明可提供繁茂膜海綿在實驗室可控條件下進行有效的培養生產海綿原代生物量，技術相對較完整、操作簡便，在室內可控培養生產海綿生物量，為海綿工廠化養殖提供技術支撐，從而為解決海綿生物藥物的"藥源供給不足問題"提出一種新途徑，具有廣泛應用前景。圖1為5L凈水培養體系圖；其中1海綿培養玻璃缸，2海綿貼附載體及橙色海綿，3通氣管，4氣石，5氣泵；6水域缸，7溫度控制機，8桌子，9水域水儲槽，10淺水泵，11水浴管；圖2為5L流水培養體系圖；其中12空氣，13臭氧發生器，14攪拌漿，15餌料藻液，16混料桶，17空氣濾膜，18海綿培養器，19廢液收集槽，20熱交換器，21海水，22海水處理槽，23除蛋白器；圖3為繁茂膜海綿培養過程中外觀生長狀態圖；其屮a為培養初始海綿狀態；b為培養結束吋海綿狀態；圖4為繁茂膜海綿在靜水培養過程中生物量變化曲線圖5為繁茂膜海綿在流加培養過程中生物量變化曲線圖6為海綿提取物中5a-Cholestan-30-ol的GC-MS譜圖7為5a-Cholestan-3P-ol標準曲線。具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法與結果進行說明，本發明使用購買深海水作為養殖海水，用于海綿養殖和餌料藻類的培養；濕重采用分析天平稱取質量，通過減重法得海綿生長質量，水銀溫度計測量培養水體內實際水溫便于調節；便攜式溶氧儀測量水體內溶解氧濃度便于調節氣泵供給的空氣流量，餌料藻的培養采用過濾滅菌海水錐形瓶培養，營養鹽采用藻類培養通用的康維坊營養鹽。5L靜水體系培養。潮間帶繁茂膜海綿(//，e"/^^o"pe/'/we)，2005年7月份采集于屮國大連凌水橋潮間帶，海綿表面雜質及臟物較少，采集吋選取面積約2X2em2的小塊，帶回實驗室后置于盛海水的12L玻璃缸內暫養2天，暫養溫度控制在20士rC左右。培養體系如圖l所示。培養起始，將海綿用線固定在4X4cm的毛玻璃載體上，共15塊放入盛有海水的5L玻璃缸內，然后將玻璃缸置于溫度約為20士2'C的水域內，氣泵和氣體分布器通入空氣，溶氧儀測水體內溶氧，調節通入空氣流量的大小使水中的溶解氧氣濃度在7士0.5mg/L范圍內，玻璃缸外面用牛皮紙遮住防止陽光直接照射到海綿體上，每天換水100%，換水前先將儲備海水在水域內調節到海綿培養相同的溫度，換水后投喂新月菱形藻和球等邊金藻作為食物，濃度各為？Xl()S/ml。培養期內，每隔2天稱量海綿與載體的濕重，培養到海綿濕重相對處于平臺期停止實驗。以5a-Cholestan-3P-ol作為繁茂膜海綿體內的目標活性物質，培養結束后，用GC-MS連用方法檢測海綿體內在實驗初始和結束吋目標活性物質的含量，海綿提取物中5a-Cholestan-3P-ol的GC-MS譜圖如圖6所示，根據峰面積和標準曲線(圖7)計算樣品中5a-Chdestan-3{3-ol含量。結果，培養過程中，海綿顏色變得比初始時更加鮮艷，海綿在載體上具有較大的貼附鋪展，形態發生了改變，從原來的平坦的表面變成了具有很多飽滿的長突起(芽體)狀(如圖3所示)，此芽體內原細胞含量較海綿其他部位豐富，是海綿細胞培養的良好材料，培養過程中水體內的NH/濃度始終低于lmg/(如表1所示)，實驗到第ll天結束，存活率達到100%，海綿生物量增長到原始濕重的140%(如圖4所示)，平均每天增長超過4%。海綿體內的5a-Cholestan-3P-ol含量也由實驗前的6.244mg/g干重海綿增長到了10.478mg/g干重海綿(如表3)，約為實驗初始時的1.5倍。表1為靜水培養下不同培養時間水體內NH/濃度表；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2為流水培養下不同培養時間水體內NH/濃度表;<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3為靜水培養下海綿體內5a-Cholestan-3P-ol含量變化表；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例25L流加體系培養。繁茂膜海綿(/^we"/"c/ob"pw/eve)于.2005年7月份采集于中國大連凌水橋潮間帶，帶回實驗室后置于盛海水的12L玻璃缸內暫養2天，溫度控制在18-2(TC。培養體系如圖2所示。培養起始，將海綿用線固定在直徑約5cm的圓形毛玻璃載體上，共15塊放入盛有海水的5L液升培養器內，水流量為20L/day，培養器外面包裹冷卻管控制培養水體溫度在2o士rc，氣泵和氣體分散器提供海綿所需氧氣，整個體系置于室內無陽光照射的地方，投喂新月菱形藻、球等邊金藻作為食物，濃度各為2X105/ml，培養過程中控制培養水體內的NH/濃度不超過1mg/L。培養期內，每隔2天測量海綿生物量，海綿外觀狀態出現衰退現象吋停止實驗。以5(x-Cholestan-3P-ol作為繁茂膜海綿體內的目標活性物質，培養結束后川GC-MS連用的方法檢測海綿體內在實驗初始和結束吋目標活性物質的含量，結果，培養過程中，海綿顏色變得比初始吋更加鮮艷，海綿在載休上具有較大的貼附鋪展，形態發生了改變，從原來的平坦的表面變成了具有很多飽滿的長突起狀，培養過程中水體內的NH/濃度始終低于0.6mg/L(如表2所示)，實驗到第16天結束，海綿存活率為87%。海綿生物量增長到原始濕重的140%(如圖5所示)，平均每天的增長量都超過了4%，海綿體內的5a-Cholestan-3P-ol含量也由實驗前的6.721mg/g干重海綿增長到了10.733mg/g干重海綿(如表4)，約為實驗初始吋的1.5倍。表4為流水培養下海綿體內5a-Cholestan-3P-ol含量編化表;<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1.一種用于潮間帶海綿實驗室人工養殖方法，實驗室人工制造適宜生長環境培養潮間帶固著生長的低等動物-海綿；其特征在于將海綿在潮間帶采集后，帶回實驗室后首先清除海綿表面雜質及臟物，然后切割成小塊，放入培養器中暫養，然后固定在載體上，放入培養器控溫、避光培養，投喂餌料藻類作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態變化及生物量變化情況作為評價指標，培養10-20天可達到原代海綿生長的生物量最大值。2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于潮間帶礁石上采集海綿時，選擇顏色鮮艷，表面相對平坦、突起短而粗壯，表而千凈的海綿，采集后立即將海綿置于盛海水的小桶里備用。3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于采用無菌手術刀切割海綿，適宜面積大小為約3-9cm2;載體大小為海綿面積的4-8倍；海綿載體可選擇玻璃或塑料材質，海綿選擇細線固定。4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于海綿帶回實驗室后要暫養2-7天，至其切割和采集時形成的傷口初步愈合，暫養溫度與海邊采集吋溫度相適應，然后再逐漸調節到培養溫度，海綿培養溫度15-25°C。5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于海綿培養密度2-15%。(m/v)，培養水體溶氧濃度5-9mg/L，保持培養水體內的NH/濃度低于lmg/L;投喂餌料藻類食物時濃度2X104—2X105cells/ml;培養過程屮避免陽光直射海綿。'全文摘要本發明涉及一種潮間帶海綿在實驗室條件下人工養殖獲得生物量的方法，將海綿在潮間帶采集后，帶回實驗室后首先清除海綿表面雜質及臟物，然后切割成小塊，放入培養器中暫養，然后固定在載體上，放入培養器控溫、避光培養，投喂餌料藻類作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態變化及生物量變化情況作為評價指標，培養10-20天可達到原代海綿生長的生物量最大值。本發明是首次在實驗室中對潮間帶海綿進行人工養殖，方法簡單而有效，可將海洋中野生的潮間帶海綿在實驗室的規模下養殖生長并獲得一定的海綿生物量。本發明的潮間帶海綿的室內養殖方法為海綿工廠化養殖提供技術支撐，從而為解決海綿生物藥物的“藥源供給不足問題”提出一種新途徑，具有廣泛應用前景。文檔編號C12N5/06GK101099452SQ20061004712公開日2008年1月9日申請日期2006年7月5日優先權日2006年7月5日發明者付晚濤,衛張,張喜昌,曹旭鵬,薛凌云,艷靳申請人:中國科學院大連化學物理研究所