專利名稱：一種檢測土壤中羥胺還原酶活性的分析方法
技術領域：
本發明涉及土壤中羥胺還原酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中羥胺還原酶活性的分析方法。
背景技術：
土壤中的羥胺還原酶能將在土壤中氮代謝(亞硝酸鹽的還原或者氨的氧化)過程中形成的中間產物羥胺還原成氨，土壤中的還原態化合物可作為氫的供體。
因此，土壤中羥胺還原酶活性的強弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氨揮發損失，間接影響氮肥的利用效率。土壤中羥胺還原酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質地的強烈影響，同時也受到農田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中羥胺還原酶活性的檢驗有很重要的意義。而到目前為止，有關羥胺還原酶活性的測定基本都是參照Φ.X.哈茲耶夫[蘇]著，鄭洪元、周禮愷、張德生譯的《土壤酶活性》一書中的方法。該種方法步驟比較繁瑣，需用專用的試劑瓶和抽濾裝置進行抽真空培養，且試驗的厭氧培養程度隨裝置的不同、培養批次的不同具有差異性和不確定性，使其難以適應土壤中羥胺還原酶活性的定性比較和定量研究；同時，該種方法顯色劑涉及到乙酸酐(冰毒前體)的應用，購買乙酸酐需要公安部門的毒品證明，無形中降低了分析的時效性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檢驗土壤中羥胺還原酶活性的分析方法。該方法是在借鑒前人測定方法的原理基礎上，對羥胺還原酶活性的測定步驟和顯色方法進行了部分改進(對其通過保持一定真空度而實現厭氧培養和使用乙酸酐作為顯色劑進行了改進)，從而減少培養時厭氧程度的不確定性和試驗步驟的復雜性，并通過應用較乙酸酐-三氯化鐵更靈敏的顯色劑，使分析結果更加精確可靠，分析重現性更好。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種檢測土壤中羥胺還原酶活性的分析方法1)分別稱取0.5-1g土壤風干樣品n(≥2)份于試管中，向其中n-1只試管中加入0.5-2ml0.5％-1.0％的鹽酸羥胺，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；用弱堿調解pH至7-8.5，然后向試管中分別加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10ml，用惰性氣流排除試管中的空氣，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻后置于30±0.5℃恒溫箱中培養5±0.1h；同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)；2)培養結束后，用10-40ml蒸餾水將試管內的土水混合物完全轉移至三角瓶中，再用蒸餾水補充至50-100ml；3)加入鋁鉀礬飽和溶液1-2ml；振蕩、過濾；4)取濾液1ml于50ml容量瓶中，加緩沖液、相對鹽酸羥胺過量的顯色劑，然后用蒸餾水定容至刻度，在510nm下用分光光度計比色測定吸光值為A；5)在510nm下比色測定一系列(二組或二組以上)已知濃度的羥胺溶液(0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μgNH2OH·ml-1)的吸光值A’，以羥胺溶液的濃度和測定的吸光值A’制作標準曲線，得到斜率b；6)根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中羥胺的濃度S，S＝A*b；7)計算樣品中羥胺濃度；8)計算羥胺還原酶活性，計算公式為[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，單位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1為試劑空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2為樣品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3為樣品對照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50為定容后的溶液體積，V為步驟2中補充蒸餾水后的溶液體積，1000為單位轉換系數，W為稱土樣重。
對于酸性土壤，調解pH為7-8.5，采用加入碳酸鈣(CaCO3)的方法(對于石灰性土壤而言，碳酸鈣無需加入，因為土壤本身的pH值既可以滿足微生物的最適pH)。
厭氧培養所使用的蒸餾水，需加熱至沸騰驅除水中的溶解O2，然后封閉冷卻至室溫。所使用的惰性氣流既可以是氮氣流也可以是二氧化碳氣流。
所述緩沖液既可以是醋酸鈉和鹽酸的混合液，也可以是醋酸鈉和醋酸等物質量的混合液。所述顯色劑為硫酸鐵銨水溶液和鄰菲羅啉乙醇溶液。
本發明方法改進的依據土壤羥胺還原酶與土壤硝酸還原酶和亞硝酸還原酶一樣，都是參與土壤中氮素代謝的還原酶類。三者測定過程中均需要厭氧培養條件。硝酸還原酶活性測定是以硝酸鉀(KNO3)為底物，通過加入2，4-二硝基酚抑制亞硝酸還原酶的活性，來檢測單位時間內NO2--N的生成量；亞硝酸還原酶活性的測定方法則是以亞硝酸鈉(NaNO2)為底物，經過24小時厭氧培養，通過單位時間內NO2-N的減少量來表征。與此相同，本方法中羥胺還原酶活性的測定則是以羥胺(NH2OH)為底物，經過5小時厭氧培養，通過單位時間內羥胺的減少量來衡量羥胺還原酶的活性。加入5-10ml排除溶解氧的液封和用惰性氣流排除培養試管中的空氣，目的都是為培養試驗創造良好的厭氧環境。
本發明所使用的顯色反應原理為硫酸鐵銨溶液中的Fe(III)將溶液中的羥胺氧化為氮氣，而自身被還原為Fe(II)，Fe(II)與加入的鄰菲羅啉(Phen)發生絡合反應生成的三鄰菲羅啉合亞鐵離子(Fe(Phen)32+)顯棕色(低濃度時為桔黃色)，而過量的鄰菲羅啉與剩余Fe(III)絡合生成無色的三鄰菲羅啉合鐵離子(Fe(Phen)33+)，因而可以通過比色測定Fe(Phen)32+的生成量衡量溶液中羥胺的量。
Fe3++NH2OH+3Phen----→Fe(Phen)32+(棕色)+1/2N2+H2OFe3++3Phen----→Fe(Phen)33+(無色)已有研究指出，在pH為2-9的范圍內Fe(Phen)32+的吸光度不隨pH值而變化，故本發明采取醋酸鈉和鹽酸的混合液或醋酸鈉和醋酸等物質量的混合液作為緩沖溶液，使顯色反應體系pH值保持在2-9范圍內。
與過去的分析方法相比較，本發明的優點主要有1)所需設備簡單、降低了試驗成本。本發明中的培養試驗是在直徑10-15mm、長為100-150mm的普通玻璃試管中進行，不需用原來方法中提及的用來實現抽真空的帶磨口塞的專用真空瓶及真空泵。
2)所使用的顯色方法靈敏度更高，將分析精確度提高了一個數量級。由于羥胺質量濃度在0.4-15μg·ml-1的范圍內與吸光度呈良好的線性關系，故本發明所涉及到的顯色方法可將結果精確至0.1μg·ml-1，而原來方法的精確度為1.0μg·ml-1，新方法將分析精度提高了一個數量級。
3)操作簡單，分析結果穩定可靠，重現性好。原來方法需要設置滅菌土壤作為對照，本方法只需用一個不加底物的溶液作為對照；同時，由于本發明所涉及到的培養方法減少了厭氧培養過程的復雜性和不確定性，故分析結果重現性非常良好。
4)簡化了操作步驟，減少了厭氧培養過程的復雜性和不確定性。
具體實施例方式
試劑配制1.0.5-1.0％的鹽酸羥胺溶液準確稱取0.50-1.00g鹽酸羥胺，用蒸餾水定容至100ml。
2.0.5-1.0％的葡萄糖溶液準確稱取0.50-1.00g葡萄糖，用蒸餾水定容至100ml。
3.碳酸鈣分析純試劑。
4.鋁鉀礬飽和溶液將過量的硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中，上層清液既為鋁鉀礬飽和溶液。
5.緩沖液一82g乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至1000ml，加入36％鹽酸1ml。
緩沖液二80g乙酸鈉與90.0g冰乙酸溶于蒸餾水中，定容至1000ml。
6.顯色劑的配制
1)硫酸鐵銨(NH4Fe(SO4)2)稱取≥0.2g十二水合硫酸鐵銨溶于100ml蒸餾水中，加兩滴濃硫酸作穩定劑。
2)鄰菲羅啉稱取≥0.1g鄰菲羅啉溶于100ml95％乙醇中。
7.標準貯備液的配制2.1046g鹽酸羥胺溶于1L水中，則得到1mg·ml-1的貯備液。此貯備液需放入4℃的冰箱中保存，保存時間不宜超過數周。
8.標準曲線的制備吸取上述標準貯備液1ml，定容至100ml，得到0.01mg·ml-1的溶液。再分別吸取該溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加入1ml緩沖溶液、1ml硫酸鐵銨溶液和1ml鄰菲羅啉乙醇溶液，用蒸餾水定容。則此標準系列含羥胺量分別為0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μgNH2OH·ml-1。在510nm下比色測定此系列羥胺溶液的吸光值A’，以羥胺的濃度和測定的吸光值A’制備標準曲線，得到斜率b。
操作步驟1.稱取1g過1mm篩的土壤風干樣品4份于4只試管中，向其中3只試管中加入0.5-2ml0.5％-1.0％的鹽酸羥胺，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；向4只試管中分別加入20mg碳酸鈣，混合均勻后向4只試管中分別加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10ml，用氮氣流或二氧化碳氣流排除試管中的空氣，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻后置于30℃恒溫箱中培養5h；同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)。
2.培養結束后，用25ml蒸餾水將試管內的土水混合物完全轉移至三角瓶中，再用蒸餾水補充至50ml。
3.加入鋁鉀礬飽和溶液2ml；振蕩10min、用致密濾紙過濾。
4.取濾液1ml于50ml容量瓶中，分別加緩沖液1ml、硫酸鐵銨溶液1ml、鄰菲羅啉乙醇溶液1ml，然后用蒸餾水定容至刻度，顯色10min，在510nm下用分光光度計比色測定吸光值為A。
5.根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中羥胺的濃度S，S＝A*b。
6.計算樣品中羥胺的含量。
7.計算羥胺還原酶活性，計算公式為[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，單位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1為試劑空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2為樣品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3為樣品對照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50為定容后的溶液體積，V為步驟2中補充蒸餾水后的溶液體積，1000為單位轉換系數，W為稱土樣重。
實施例1本實施例所使用的三種土壤分別為1號為對照，即不經過任何處理和不添加任何土壤添加劑在25℃培養24h以上的普通土壤；2號為添加硝化抑制劑3，5-二甲基吡唑磷酸鹽且在25℃培養24h以上的土壤；3號為添加硝化抑制劑1-羥甲基-3，5-二甲基吡唑且在25℃培養24h以上的土壤，土壤含水量均為20％。2號和3號添加硝化抑制劑的土壤，其中兩種抑制劑的添加量都是1.15mg·kg-1土。用上述的方法檢測三種土壤羥胺還原酶活性。
每種土壤的具體分析步驟如下1.稱取1g過1mm篩的土壤風干樣品4份于4只試管中，向其中3只試管中加入1ml0.5％的鹽酸羥胺，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；分別向4只試管中加入20mg碳酸鈣，混合均勻后向4只試管中分別加入1ml1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5ml，用氮氣流排除試管中的空氣，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻后置于30℃恒溫箱中培養5h；同時作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)。
2.培養結束后，用25ml蒸餾水將試管內的土水混合物完全轉移至三角瓶中，再用蒸餾水補充至50ml。
3.加入鋁鉀礬飽和溶液2ml；振蕩10min、用致密濾紙過濾。
4.取濾液1ml于50ml容量瓶中，分別加緩沖液一1ml、硫酸鐵銨溶液1ml、鄰菲羅啉乙醇溶液1ml，然后用蒸餾水定容至刻度，顯色10min，在510nm下用分光光度計比色測定吸光值為A。
5.根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中羥胺的濃度S，S＝A*b。
6.計算樣品中羥胺的含量。
試驗結果如下
由表中數據可以看出，各處理之間結果差異達到顯著水平，較小的標準差值表明該分析方法結果之間的偏差較小，精確度較高，重現性好。
實施例2本實施例所使用的三種土壤均采自中國科學院沈陽生態實驗站其中4號土壤前茬作物為水稻，5號土壤前茬作物為玉米，6號土壤前茬作物為大豆。三種不同耕作制度的土壤均在含水量為20％，溫度為25℃條件下培養24h以上，測定其羥胺還原酶活性，具體分析步驟如下底物鹽酸羥胺濃度為1％，加入0.5ml，葡萄糖濃度為1％，加入1ml，然后加入3.5ml蒸餾水，二氧化碳氣流排空氣厭氧培養。顯色前加入緩沖液二，其余步驟同實施例1。試驗結果如下
表中數據同樣顯示了分析結果的穩定性及較高的精密度。
權利要求
1.一種檢測土壤中羥胺還原酶活性的分析方法，其特征在于1)分別稱取0.5-1g土壤風干樣品n份于試管中，n≥2，向其中n-1只試管中加入0.5-2ml 0.5％-1.0％的鹽酸羥胺，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；用弱堿調解pH至7-8.5，然后向試管中分別加入1-2ml0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，再用蒸餾水補充至5-10ml，用惰性氣流排除試管中的空氣，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻后置于29.5-30.5℃恒溫箱中培養4.9-5.1h；同時作試劑不放土壤風干樣品的空白對照；2)培養結束后，用10-40ml蒸餾水將試管內的土水混合物完全轉移至三角瓶中，再用蒸餾水補充至50-100ml；3)加入鋁鉀礬飽和溶液1-2ml；振蕩、過濾；4)取濾液1ml于50ml容量瓶中，加緩沖液、相對鹽酸羥胺過量的顯色劑，然后用蒸餾水定容至刻度，在510nm下用分光光度計比色測定吸光值為A；5)在510nm下比色測定二組或二組以上已知濃度的羥胺溶液的吸光值A’，以羥胺溶液的濃度和測定的吸光值A’制作標準曲線，得到斜率b；6)根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中羥胺的濃度S，S＝A*b；7)計算樣品中羥胺濃度；8)計算羥胺還原酶活性，計算公式為[(S1-(S2-S3))*50*V/1000]/W，單位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1為試劑空白中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S2為樣品中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，S3為樣品對照中的NH2OH含量(mg·L-1或μg·ml-1)，50為定容后的溶液體積，V為步驟2中補充蒸餾水后的溶液體積，1000為單位轉換系數，W為稱土樣重。
2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于對于酸性土，采用加入碳酸鈣的方法調解pH為7-8.5。
3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于厭氧培養所使用的蒸餾水，使用前，需將其加熱至沸騰驅除水中的溶解O2，然后封閉冷卻至室溫。
4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述惰性氣流既為氮氣流或二氧化碳氣流。
5.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述緩沖液既為醋酸鈉和鹽酸的混合液，或醋酸鈉和醋酸的混合液。
6.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述顯色劑為硫酸鐵銨水溶液和鄰菲羅啉乙醇溶液，而它們的加入量相對鹽酸羥胺均為過量的。
全文摘要
本發明涉及一種檢測土壤中羥胺還原酶活性的分析方法，1)稱取0.5－1g土壤風干樣品n份于試管中，向其中n－1只試管中加入鹽酸羥胺，另1只試管中加入蒸餾水作樣本對照；調pH為7－8.5，向試管中加入葡萄糖溶液，用蒸餾水補充至5－10ml，排除試管中的空氣，塞上橡膠塞，搖勻后恒溫培養；2)用蒸餾水補充至50－100ml；3)加入鋁鉀礬飽和溶液；振蕩、過濾；4)取濾液加緩沖液、顯色劑，在510nm下測定吸光值為A；5)計算樣品中羥胺含量。本發明的優點主要有1)簡化了操作步驟，減少了厭氧培養過程的復雜性和不確定性；2)顯色靈敏度更高，將分析精確度提高了一個數量級；3)分析結果穩定可靠，重現性好。
文檔編號C12Q1/26GK101082567SQ20061004680
公開日2007年12月5日 申請日期2006年6月2日 優先權日2006年6月2日
發明者武志杰, 史云峰, 陳利軍, 王殳屹 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所