專利名稱：小麥籽粒總rna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種小麥籽粒總RNA的提取方法。
背景技術：
植物組織總RNA提取是進行cDNA文庫構建、Northern雜交、RNA差異顯示等試驗的基本技術。相對于動物、微生物而言，高等植物的總RNA提取難度是比較大的，主要原因是不同植物種類、同種植物的不同器官所含蛋白質、脂類、多糖及次生物質的組成、含量均不相同，而這些物質在植物細胞破碎之后對RNA的純度和得率將造成不同程度的影響。因此，高等植物總RNA的提取技術路線因植物種類、提取部位的不同而異。
淀粉是小麥籽粒的主要貯藏物質，占籽粒總重量的70％以上。在小麥籽粒總RNA提取的過程中，淀粉與RNA結合而共沉淀，造成RNA提取失敗。目前國內對于小麥籽粒RNA提取技術尚未見報導，以小麥籽粒為材料的分子生物學研究亦較難開展，造成該領域研究的局限。
在已報導的植物總RNA提取方法中，基本是在經典“一步法”的基礎上采用各種不同方法去除雜質，以使所提取的RNA達到純度要求。涉及到多糖類物質的去除方法有以下幾種①KAC(醋酸鉀)沉淀法報導植物為葡萄。經試驗，該方法對于去除少量多糖類物質比較有效，但對于淀粉類材料只能起到輔助作用，不能滿足提取純度的要求；②CTAB(溴代十六烷基三甲銨)法報導植物為紫丁香和糖槭。該方法將CTAB加入提取后的RNA溶液中。經試驗，類似技術路線對小麥籽粒的RNA純化無任何效果；③反復凍融法報導植物為非洲菊花瓣。將提取后的RNA成品反復凍融容易造成RNA的降解，不適合在大量制備時使用。以上各植物含有的多糖雜質以小分子量雜糖為主，淀粉僅占非常微小的比例，所以以上各方法僅能提供部分參考作用，對小麥籽粒總RNA的提取需專用方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便、快速、低成本的小麥籽粒總RNA的提取方法。
實現上述發明目的的技術方案是小麥籽粒總RNA的提取方法，具體實施步驟如下1)在提取緩沖液(50mM Tris-Hcl pH8.0，10mM EDTA、1％SDS、100mM NaCl)中加入CTAB至濃度為1％(w/v)；2)稱取新鮮小麥籽粒或干籽粒，置于已滅菌的研缽中，加入相當于籽粒重量2倍的硅藻土和相當于籽粒重量10倍體積的步驟1)制備的提取緩沖液，充分研磨成勻漿，將勻漿液轉入離心管，用旋渦混合器振蕩1min，然后在室溫下靜置浸提5min；3)在4℃、13,000×g條件下離心15min；4)吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(v/v/v＝24∶24∶1)混合液振蕩萃取后，在4℃、13,000×g條件下離心15min；5)再吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的氯仿/異戊醇(v/v＝24∶1)混合液振蕩萃取后，在4℃、13,000×g條件下離心15min；6)離心后的上清液用冰醋酸調pH至5.0(V1)，再加入相當于1/3 V1體積的5mol·L-1KAc溶液，計算并加入無水乙醇，使總溶液的乙醇濃度為70％，充分混勻后，-20℃沉淀30min；7)在4℃、13,000×g條件下離心15min，去除上清液，沉淀即為RNA產物。用預冷的無水乙醇洗滌沉淀3次，用DEPC水重新懸浮沉淀，于-20℃貯存。若長期貯存可置于無水乙醇中，-80℃保存。
注意事項操作時皮膚表面、唾液不能接觸樣品，否則易造成RNA的降解，可使用口罩、一次性PE手套。
該方法首先應保證將籽粒中的淀粉與RNA有效分離，使提取出的總RNA純度達到要求；其次，該方法應簡便、快速、低成本，能夠實現標準化。
圖1小麥籽粒總RNA的瓊脂糖電泳圖。
以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步詳細說明。
具體實施方案實施例11)在2mL提取緩沖液中加CTAB 0.02g，搖勻；2)稱取0.1g小麥籽粒，置于已滅菌的研缽中。加入200mg硅藻土、1mL含CTAB的提取緩沖液，研磨成勻漿，轉入1.5ml離心管中，用漩渦混合器振蕩1min，置室溫下靜置浸提5min；3)在4℃、13,000×g條件下離心15min；4)離心后，吸取上清液700μL，加入700μL的酚/氯仿/異戊醇混合液振蕩萃取，再離心，操作方法與步驟3)相同；5)離心后，吸取上清液600μL，加入600μL氯仿/異戊醇混合液振蕩萃取，再離心，操作方法與步驟3)相同；6)離心后的上清液分裝2個離心管，每管200μL，各加入冰醋酸約2.5μL調pH至5.0，再分別加入5mol·L-1的KAc溶液67μL和預冷的無水乙醇614μL，混勻，-20℃沉淀30min；7)離心后棄上清液，沉淀即為RNA產物。用預冷的無水乙醇洗沉淀3次，然后每管用50μL DEPC水重懸浮沉淀，得到RNA待測液。
8)快速電泳檢測使用1％含EB的瓊脂糖凝膠，負極點樣，上樣量為5μL，在100V電壓下電泳10～15min。電泳后凝膠成像儀檢測。結果顯示電泳條帶有5S、18S、28S三條RNA條帶。5S的亮度較淺，28S∶18S的寬度比或亮度比接近2∶1(見附圖1)，并且DNA帶不明顯，這說明所提取的RNA達到純度要求。以常規一步提取法為對照，對照樣品的RNA有明顯的降解現象，DNA殘留較多。
9)紫外法檢測將石英比色杯用鹽酸∶甲醇(1∶1，v/v)浸泡至少30min，然后用去離子水洗凈。步驟6)重懸浮的RNA待測液用pH8.0的TE緩沖液稀釋100倍，用紫外分光光度計分別測定OD260、OD280、OD230。
計算得率OD260＝1時，RNA的濃度為40ug/ml。
RNA得率(ug/gFW)＝0.04ug/uL×OD260×稀釋倍數×RNA總溶解體積(uL)/樣品鮮重(g)＝800×OD260/樣品鮮重(g)。
檢測結果
OD260/OD280的比值越接近于2.0，說明所提取的RNA純度越高。
當OD260/OD230＞2.0時，說明所提取的RNA樣品中沒有鹽類污染。使用本發明方法提取的RNA得率較高，純度符合要求。
權利要求
1.一種小麥籽粒總RNA的提取方法，其特征在于，包括下列步驟1)在提取緩沖液(50mM Tris-Hcl pH8.0，10mM EDTA、1％SDS、100mM NaCl)中加入CTAB至濃度為1％(w/v)；2)稱取新鮮小麥籽粒或干籽粒，置于已滅菌的研缽中，加入相當于籽粒重量2倍的硅藻土和相當于籽粒重量10倍體積的步驟1)制備的提取緩沖液，充分研磨成勻漿，將勻漿液轉入離心管，用旋渦混合器振蕩1min，然后在室溫下靜置浸提5min；3)在4℃、13,000×g條件下離心15min；4)吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(v/v/v＝24∶24∶1)混合液振蕩萃取后，在4℃、13,000×g條件下離心15min；5)再吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的氯仿/異戊醇(v/v＝24∶1)混合液振蕩萃取后，在4℃、13,000×g條件下離心15min；6)離心后的上清液用冰醋酸調pH至5.0(V1)，再加入相當于1/3V1體積的5mol·L-1KAc溶液，計算并加入無水乙醇，使總溶液的乙醇濃度為70％，充分混勻后，-20℃沉淀30min；7)在4℃、13,000×g條件下離心15min，去除上清液，沉淀即為RNA產物。
全文摘要
本發明公開了小麥籽粒總RNA的提取方法，將小麥籽粒置于研缽中，加入相當于籽粒重量2倍硅藻土和相當于籽粒重量10倍的提取緩沖液，研磨成勻漿，勻漿液轉入離心管，吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液振蕩萃取后，離心；再吸取上清液，量取上清液體積，并加入等體積的氯仿/異戊醇混合液振蕩萃取后，離心；離心后的上清液用冰醋酸調pH至5.0(V1)，再加入相當于1/3V1體積的5mol·L
文檔編號C12N15/29GK1900278SQ20061004308
公開日2007年1月24日 申請日期2006年6月30日 優先權日2006年6月30日
發明者高梅, 張國權, 趙亞蘭, 魏益民, 張繼澍, 歐陽韶輝 申請人:西北農林科技大學