專利名稱：一種從蛇毒中提取單一成分降纖酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
蛇毒中含有豐富的蛋白水解酶，主要有兩類，一類是蛇毒類凝血酶，在體外引起血液的凝固，在體內卻是去纖抗凝的成分；另一類是蛇毒纖溶酶，可直接降解血纖維，大部分也能降解纖維蛋白原。蛇毒類凝血酶是研究較早、并已在臨床上廣泛應用的一類酶。
蛇毒類凝血酶作為藥物用于治療血栓性疾病已有30多年的歷史，在臨床上主要用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。
天然蛇毒中提取的類凝血酶絕大多數為酸性蛋白質，多采用陰離子交換柱進行分離，并結合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化。常用的陰離子交換劑有DEAE-葡聚糖凝膠、DEAE-纖維素、肝素-葡聚糖凝膠等。但離子交換法特異性不高，產品純度低。而親和層析具有專一性高，操作簡便，工藝周期短，收率高，純度好等特點，對分離某些不穩定的高分子物質，更具優越性。親和層析用于從天然蛇毒中分離純化類凝血酶，主要運用的是酶與競爭劑特異性相互作用的原理。國內外雖有利用胰蛋白酶的抑制劑苯甲脒作為類凝血酶的抑制劑，進行親和分離蛇毒類凝血酶的報道，但其分離柱條件、分離過程以及工藝技術參數或無具體描述，或描述較籠統，因而無法實施，從而很難達到理想的分離制備要求，取得單一成份產品，實現規模化的生產目的。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法。取得比活力較高的單一成分產品降纖酶，使降纖酶的生產實現規模化。
本發明的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，步驟包括(1)蛇毒用緩沖液浸泡、溶解過夜，離心去除沉淀，得上清液；(2)蛇毒上清液經親和柱層析，上樣結束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液I進行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液II洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；(3)降纖酶粗提液直接流經脫鹽柱，去除苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)；(4)去除苯甲脒酸鹽的降纖酶粗提液用聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮，得降纖酶粗提液的濃縮液；(5)降纖酶粗提液的濃縮液經分子篩柱層析，即得單一組份降纖酶；
上述提取分離的全過程均在3～6℃的低溫層析冷柜或冷室中進行。
上述步驟(1)中所述的緩沖液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
上述步驟(2)中所述親和柱是苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和柱；上述步驟(2)中在緩沖液II洗脫前還需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行過渡洗脫。
上述步驟(3)中所述的脫鹽柱是葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱；上述步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中是串聯在一起的。
上述步驟(4)中PEG2000包埋濃縮前的降纖酶粗提液還需用超純水透析至少三次，以進一步除去殘存的苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)。
上述步驟(5)中所述的分子篩是丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)層析用分子篩。
上述步驟(5)中層析用的緩沖液為pH6.5～7.5含0.05～0.15M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
本發明的方法是以苯甲脒為配基的瓊脂糖凝膠親和介質聯合葡聚糖凝膠G25脫鹽、丙烯葡聚糖凝膠S200或丙烯葡聚糖凝膠S100分子篩層析進行單一成份降纖酶的純化提取方法。與現有技術相比本發明的優良效果如下1.本發明工藝設計合理，親和層析介質易得，可重復使用100次以上；2.操作過程簡單，分離周期短，分離效果好，樣品純度高；3.一次處理蛇毒量大，適合規模化工業生產。
本發明降纖酶提取方法與其它親和層析提取方法的比較如下
具體實施方式
實施例1從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟
1、取白眉蝮蛇毒30g，溶于200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH8.6含2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線，改用200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH8.6含0.2M NaCL和0.12M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經PEG20000包埋、濃縮至約3ml，上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.8含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為98％，比活力為2860U/mg蛋白。
實施例2從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1、取尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線，改用200ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH9.0含0.1M NaCL和0.15M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經PEG20000包埋、濃縮至約5ml，上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.2含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為96％，比活力為2960U/mg蛋白。
實施例3從蛇毒中提取降纖酶的方法包括下述步驟1、取白眉蝮蛇毒或尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL緩沖液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，過夜，8000rpm離心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積，將上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上樣結束后柱子用200ml緩沖液平衡；3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線，改用200ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行過渡洗脫；4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接，用pH9.0含0.3M NaCL和0.15M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；5、降纖酶粗提液用超純水透析三次后，經PEG20000包埋、濃縮至約5ml，上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl 100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.4含0.1MNaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得到單一成份的降纖酶。檢測純度為97％，比活力為2910U/mg蛋白。
權利要求
1.從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，步驟包括(1)蛇毒用緩沖液浸泡、溶解過夜，離心去除沉淀，得上清液；(2)蛇毒上清液經親和柱層析，上樣結束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液I進行洗脫，至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒鹽酸鹽的Tris-HCL緩沖液II洗脫，核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰，收集得降纖酶粗提液；(3)降纖酶粗提液直接流經脫鹽柱，去除苯甲脒鹽酸鹽；(4)去除苯甲脒酸鹽的降纖酶粗提液用聚乙二醇20000包埋、濃縮，得降纖酶粗提液的濃縮液；(5)降纖酶粗提液的濃縮液經分子篩柱層析，即得單一組份降纖酶；上述提取分離的全過程均在3～6℃的低溫層析冷柜或冷室中進行。
2.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的緩沖液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
3.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中所述親和柱是苯甲脒瓊脂糖凝膠6B或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B親和柱；
4.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中在緩沖液II洗脫前還需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行過渡洗脫。
5.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(3)中所述的脫鹽柱是葡聚糖凝膠G25脫鹽柱；
6.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中是串聯在一起的。
7.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述(4)中聚乙二醇20000包埋濃縮前的降纖酶粗提液還需用超純水透析至少三次，以進一步除去殘存的苯甲脒鹽酸鹽。
8.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(5)中所述的分子篩是丙烯葡聚糖凝膠S200或丙烯葡聚糖凝膠S100層析用分子篩。
9.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份降纖酶的方法，其特征在于所述步驟(5)中層析用的緩沖液為pH6.5～7.5含0.05～0.15M NaCL的Tris-HCL緩沖液。
全文摘要
一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用的降纖酶的方法，屬于醫藥技術領域。步驟包括如下蛇毒經浸泡溶解、離心；上清液經親和柱層析；洗脫液直接流經葡聚糖凝膠G25脫鹽層析；含有效成分的洗脫液經包埋、濃縮；濃縮樣品再經分子篩層析，即可得到單一成分的降纖酶。本方法具有適合規模化生產、操作簡便、生產周期短、產品純度高等特點。
文檔編號C12N9/68GK1807613SQ20061004204
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月18日 優先權日2006年1月18日
發明者王晶翼, 劉祿娟, 張潤平, 張明會, 于萍 申請人:齊魯制藥有限公司