專利名稱：生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法
技術領域：
本發明屬于一種與基因檢測相關的領域，適用于核酸分子上特定位點的核苷酸鑒別，具體涉及一種生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法。
背景技術：
2001年單核苷酸多態性協作組(The SNP Consortium)構建了含1.42×106個SNP、密度達每1.9kb片段內含有一個單核苷酸多態性位點的人類遺傳圖譜，這對開展致病基因和人類起源與進化的研究非常重要。據估計，大約有10萬個SNP分子標記將被用于基因功能及與疾病相關的研究。如此龐大的分析需求，對檢測技術提出了極高的要求。
目前，對于等位基因的單核苷酸多態性的常見檢測方法主要有以下幾種等位基因特異擴增法，是在聚合酶鏈式反應體系中使所設計的引物1的3′端與一條待測等位P基因的序列互補，而與另一條等位基因(Q基因)的序列不互補；在聚合酶鏈式反應擴增時，擴增出P基因。依此，設計引物2與Q基因的序列互補，再分別將擴增產物進行電泳。該方法雖然可檢測出單核苷酸多態性，但操作步驟繁瑣，對引物設計要求較高，因此，操作難度和工作量較大。
雙向特定等位基因PCR擴增法，與等位基因特異擴增法原理相同，不同之處在于所設計的引物為4條，即引物F1與待測等位X基因的5′端序列互補；引物R2與待測等位Y基因的3′端序列互補；引物R1位于X基因序列的中下游，其3′末端為X；引物F2位于5′基因序列的中上游，其3′末端為Y。X、Y分別代表多態位點。在聚合酶鏈式反應擴增時，可同時擴增出兩條包含有單核苷酸多態性位點的寡核苷酸序列。經過一次聚合酶鏈式反應即可鑒定目標基因。該方法操作雖簡單、經濟，但由于是在液相中進行，多重平行反應數量有限，故難以實現單核苷酸多態性的高通量檢測。
引物延伸法(Primer extension)，是依賴DNA聚合酶來分辨堿基多態性位點的一類方法，其特異性比建立在等位特異性雜交的方法要高。這類方法有多種名稱，如微測序(Minisequencing)、單核苷酸引物延伸(single nucleotide Primer extension，縮寫為SnuPE)、引物指導的核苷酸合成(Primer-guided nucleotide incorpration)、基于模板指導末端熒光摻入技術(template directed dye terminator incorpration，縮寫為TDI)等。其中，微測序(Minisequencing)最為常用。微測序反應首先擴增出含有單核苷酸多態性位點的一段DNA，然后進行微測序反應，加入一檢測引物，其3′末端堿基緊挨于多態性堿基，在DNA聚合酶及標記的ddNTP的存在下進行一個堿基的延伸反應，延伸的這個堿基就是多態性堿基。因為聚合酶鏈式反應引物會和延伸引物競爭，產生多個擴增片段，而多余的dNTP會使延伸反應延伸多個堿基。所以，微測序反應前必須對聚合酶鏈式反應產物進行純化，以去除其中含有的聚合酶鏈式反應引物及dNTP。引物延伸產物的檢測有放射性同位素標記法、發光檢測法、凝膠為基礎的熒光檢測法及質譜分析法、變性高壓液相色譜法等多種方法。但這些方法均不同程度的存在成本高、操作繁瑣的缺陷或不足。如放射性同位素標記法，發光檢測法的自動化程度較高，且較方便，但所需設備的成本較高；凝膠為基礎的熒光檢測法制作過程繁瑣費力。
基于等位基因特異核苷酸片段(Allele specific oligonucleotide，縮寫為ASO)雜交基礎上對單核苷酸多態性進行分析的方法，是最簡單的基于雜交原理的檢測方法。其根據短的核苷酸探針和互補的目的片段進行雜交時，在完全匹配和有錯配兩種情況下雜交復合體穩定性的不同，將單核苷酸多態性位點檢測出來。這種方法首先要設計一段短的核苷酸探針，一般為15-20bp，其中包括了單核苷酸多態性位點；當其與樣品DNA雜交時，由于在20bp中一個堿基的差異會導致Tm值下降5-7.5度，所以，通過嚴格控制雜交條件，就可以鑒定出樣品DNA中是否存在單核苷酸多態性。缺點是雜交的嚴格性不易控制，不能更準確地區分出單核苷酸多態性位點。
為了提高雜交的嚴格性，以更好的區分出單核苷酸多態性位點，則需采用修飾過的核苷酸探針和樣品DNA雜交，例如利用肽核酸(Peptide nucleic acids，縮寫為PNA)探針。但由于肽核酸作探針可溶性差，所以反應不易進行。而且，探針的長度至少應是7個堿基，才能確保在室溫下較好的雜交。對富含鳥嘌呤羅丹明標記的探針，還存在本底熒光(FP)信號高的問題等。有報道在探針內人為地插入錯配堿基(3′-nitropyrrole)，用這種含有錯配堿基的探針雜交時，探針和目的片段之間一個堿基的差異導致Tm值的下降是傳統雜交的2倍，可以提高雜交的特異性。但該方法需要嚴格控制雜交條件，而且檢測的精確性不高。
TagMan技術，是基于雜交原理、按常規聚合酶鏈式反應方式進行體外基因擴增的方法。該方法是在聚合酶鏈式反應體系中加入針對單核苷酸多態性位點及側翼序列設計的探針，探針只有一個堿基的差異，分別對應于不同的等位基因，并用熒光標記探針，探針末端被磷酸化，以防止探針在擴增過程中被延伸該探針能與目標序列進行特異性結合。探針完整時，由于淬滅基團的存在，通過熒光共振能量轉移(FRET)技術作用，可使熒光標記不發熒光；當進行聚合酶鏈式反應擴增時，利用TagMan DNA聚合酶5′--3′端的外切酶活性，將探針5′端熒光標記從探針上切下來，釋放出熒光信號。由于是在聚合酶鏈式反應過程中進行的，無需分離或洗脫過程，減少了聚合酶鏈式反應污染的可能性，且擴增產物分析簡便、快捷、準確，無需電泳，實驗速度高。但，由于所設計的探針僅有一個堿基的差異。檢測結果存在假陽性，所以，操作方法復雜，檢測成本高，不適于推廣應用。
現有技術還存在如下缺點1.檢測的工作量大和時間長。采用普通聚合酶鏈式反應、熒光定量聚合酶鏈式反應等單核苷酸多態性檢測方法，一次只能針對一種或幾種單核苷酸多態性位點進行檢測，很難進行大量、多種單核苷酸多態性位點的同時檢測。
2.傳統生物芯片上固定的探針都是物種特異的探針，因此芯片所能檢測的物種是固定的，若想更改或添加檢測對象只能重新制作芯片。
發明內容
本發明的目的在于提供一種生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其解決了背景技術中難以實現高通量檢測、檢測成本高的技術問題。
本發明的技術解決方案是一種生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于該方法的實現步驟如下1)對核酸樣本進行擴增取核酸樣本，進行擴增反應，將少數含多態性位點的核酸片斷擴增成大量含有同樣多態性位點的核酸片斷，得到擴增產物；2)進行液相雜交和連接酶反應(1)進行液相雜交加入區別探針和通用探針，與擴增產物進行液相雜交，得經液相雜交的擴增產物；(2)進行連接酶反應進行連接酶反應，使液相雜交中的完全匹配探針和通用探針連接，以檢測單核苷酸的多態性；3)進行固相雜交將5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針與生物芯片進行雜交，溫度25℃-75℃，時間0.5h-36h，檢測基團被分配到生物芯片的不同位置；4)進行單核苷酸多態性檢測檢測生物芯片不同位置上檢測基團的熒光種類、亮度及分布，得檢測結果。
上述連接酶反應可采用高溫連接酶反應，實現步驟如下1)對經液相雜交的擴增產物進行純化，除去擴增產物中多余的酶與引物；2)進行連接酶反應采用耐高溫連接酶，在PCR儀中進行變性、連接循環過程，完全匹配探針與通用探針進行連接，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。采用耐高溫連接酶，反應速度快，連接效率高。
上述純化采用PCR產物純化試劑盒、酚氯仿抽提法、磁球分離法或堿性磷酸酶和外切酶I處理法等對擴增產物進行純化均可，以采用PCR產物純化試劑盒純化擴增產物的方法操作簡單，且純化效率高。
上述連接酶反應可采用普通連接酶反應，實現步驟如下采用普通連接酶，0℃-25℃溫度下，完全匹配探針與通用探針進行連接，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。采用普通連接酶，擴增產物不需要純化，可直接連接。
上述區別探針是具備下列條件1)根據每一個多態性位點的堿基變化，采用與之相應的二至四條區別探針；2)每條區別探針的5′端均是帶有不同堿基序列的標簽探針，可與固定在生物芯片上對應的標簽互補探針發生特異性雜交；3)其中一條區別探針是完全匹配探針，其3′末端的堿基可與擴增產物中多態性位點雜交；4)其余區別探針是不完全匹配探針，其3′末端的堿基不與擴增產物中多態性位點雜交；5)每條區別探針的中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補。
上述通用探針是具備下列條件1)每個多態性位點采用一條與之對應的通用探針；2)通用探針5′端帶有磷酸基團；5′端的第一個堿基與多態性位點后的第一個堿基互補；3)通用探針3′端帶有可被檢測系統識別的檢測基團。
4)通用探針中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補。
上述檢測基團可以是熒光素、若丹明、綠色熒光蛋白、量子點、膠體金、磁球或生物素。檢測基團優選Cy3，其操作方便，可直接檢測，且靈敏度高。
上述對核酸樣本進行擴增采用聚合酶鏈式反應或恒溫擴增等均可。恒溫擴增無需溫度變化的循環過程，所需儀器簡化，反應時間短。
上述生物芯片可采用原位合成法、針點法或噴墨法等方式制成，所述生物芯片的固相載體可以是微球、尼龍膜、醋酸纖維膜或玻璃片等。能確保標簽互補探針高效固定與其上的固相載體均可。采用針點法制成的生物芯片，生物芯片制作過程操作較簡單。玻璃片作為固相載體，操作簡單，標簽互補探針固定效率高，成本低。
上述進行單核苷酸多態性檢測采用直接檢測或間接檢測均可。
上述固相雜交以溫度60℃、時間1h為佳。該溫度下不僅固相雜交的時間短，且效率高。
發明具有以下優點1.雜交效率高，非特異性結合率低。
本發明將核酸擴增、連接酶反應(LDR)和生物芯片有機結合，特異性強，雜交效率高，交叉雜交，非特異性結合率低。
2.準確率高，假陽性率低。
采用生物芯片檢測，準確率高，假陽性率低。
3.低成本，操作簡便。
本發明通過聚合酶鏈式反應對原始核酸樣本進行擴增，通過連接酶反應檢測擴增后DNA核酸樣本中單個核苷酸的差別，通過與生物芯片雜交來檢測雜交信號，得到檢測結果，在降低成本的同時，簡化了操作步驟。
4.可檢測多種單核苷酸多態性位點。
本發明在生物芯片表面固定大量的標簽互補探針(antitag)，不同的標簽互補探針對應不同的單核苷酸多態性位點，因此，可以同時檢測上千種不同的單核苷酸多態性位點。
5.在檢測多種單核苷酸多態性位點時兼具高通量的特點。
高通量可大大減少單核苷酸多態性位點檢測的工作量和時間，在對多種單核苷酸多態性位點進行檢測的時候，優勢顯著。例如，檢測20種不同的病原微生物的單核苷酸多態性位點，大約只需16小時，其中8小時的雜交時間無需工作人員操作，不僅節約了一半時間，也大大減少了工作量。若要檢測上千種單核苷酸多態性位點，優勢更為顯著。
6.檢測準確性高。
本發明采用連接酶反應技術檢測核酸樣本并進行標記，能充分保證最終結果的準確性。連接酶反應技術采用兩類探針來檢測一個位點，其中一類探針連接檢測基團，另一類連接標簽探針(tag)。在兩條探針和核酸樣本的擴增產物雜交時，當且僅當兩條探針和核酸樣本的擴增產物完全匹配時，在連接酶的作用下，兩條探針之間的5′磷酸基團和3′羥基基團發生連接，最終使檢測產物帶上檢測基團。由于連接酶反應技術使用了兩條探針，好比“雙保險鎖”，在連接酶反應中是兩條探針必須都和核酸樣本的擴增產物完全匹配，接下來的連接反應才能正常進行。即，由兩條探針確定一個核酸序列，檢測一種多態性位點，因此，精確性大大提高，避免了假陽性結果。
生物芯片上發生的雜交反應是在標簽探針和標簽互補探針之間進行的。交叉雜交(cross hybrization)是生物芯片雜交過程中的瓶頸問題。由于生物本身基因組的限制，無法設計出特異性高且雜交效率相同的探針，但本發明的生物芯片卻能解決這一問題。因為最終雜交的標簽互補探針是一種隨機序列，是通過軟件篩選出來的，只和與它堿基互補的標簽探針發生雜交，而和任何的其他探針都不雜交。由于這些標簽互補探針的序列都是高通量篩選出來的，在設計過程中可保證其具有非常接近的熔點(Tm)，即可以采用同樣的雜交溫度，因此保證了探針在統一的溫度下，都具有一樣的雜交效率。為提高特異性，探針在設計時通常都具有較高的退火溫度，可達65℃，以保證在較高的溫度進行雜交，可大大降低非特異性雜交的可能，進一步提高檢測的準確性。
7.檢測靈敏度高。
本發明采用液相雜交和固相雜交結合的雜交方法，可充分保障雜交的準確性。在雜交反應的第一步是帶有標簽探針的區別探針和通用探針與核酸樣本的擴增產物雜交，反應在液相里進行。液相雜交的優點是探針可以和核酸樣本的擴增產物最大空間地接觸，空間位阻減小，探針捕獲核酸樣本的擴增產物的能力大大提高，因此雜交效率提高。也就是說相同數量的探針可以捕捉到更多的核酸樣本的擴增產物，靈敏度得以提高。
液相雜交反應液和生物芯片進行雜交，實質是生物芯片上固定的標簽互補探針與液相雜交反應液的標簽探針進行雜交，這兩段探針可以避免和其他探針錯配，雜交的靈敏度較傳統的生物芯片探針高很多，加上其退火溫度較高，雜交的效率大大提高，因此，本發明的檢測靈敏度也得到進一步提高。
8.檢測速度快。
由于本發明生物芯片上固定的標簽互補探針的熔點值較高，并且標簽互補探針和標簽探針之間的雜交特異性非常高，所以固相雜交的時間只需1小時，大大縮減了檢測時間。
9.具有系統的開放性。
本發明中固定在生物芯片上的探針是和檢測對象無關的標簽互補探針，改變檢測對象只需更換液相雜交體系中的探針即可，而固定在生物芯片上的探針則無需更換，所以制成的生物芯片可用于不同的單核苷酸多態性的檢測。
10.成本低。
生物芯片最大的成本來自探針，而本發明中的生物芯片由于其本身的特性，避免了重復點制芯片，可節約探針的成本。
一般，雜交時探針越長，雜交的準確度、可信度越高。本發明在確保標簽探針和標簽互補探針特異性雜交的效率很高的情況下，芯片上固定的探針長度大約是20個堿基，節省了探針合成的成本。
另外，由于生物芯片本身的高通量性，可同時用于上千種不同單核苷酸多態性位點的檢測，大大降低了檢測成本。
11.本發明具有簡便、快速、靈敏、特異性高等特點，應用范圍廣泛。本發明可對微量核酸樣本進行檢測，可以在成千上萬個高度平行方式的多態性型中獲取基因型，還可應用于病原微生物的診斷、疾病診斷、尋找致病基因座、數量性狀位點分析、診斷癌癥基因雜合性的丟失以及相關研究等等。
圖1為本發明的檢測機理示意圖；圖2為本發明實驗結果的生物芯片雜交圖譜。
具體實施例方式
核酸擴增技術是一種快速的經濟的合成大量DNA片段拷貝的技術。常用于遺傳病的產前診斷，癌基因的檢測和診斷，致病病原體的檢測，DNA指紋、個體識別、親子關系鑒別及法醫物證，動、植物檢疫，快速診斷檢測，基因拼接、測序等分子生物學領域。
連接酶反應是將兩條核酸片斷連接起來的技術，常用于分子克隆等分子生物學領域。
生物芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監測細胞中幾個至幾千個mRNA拷貝的轉錄情況，所以在基因表達分析方面如分析基因表達時空特征、基因差異表達檢測、發現新基因、大規模DNA測序等方面都有很多的應用。而正因為生物芯片的高通量性和靈敏性，可以分析出多個相似基因之間的微弱差別，也廣泛應用于基因型、基因突變和大規模多態性分析。另外生物芯片也是疾病診斷和治療的強有力的工具如遺傳病相關基因的定位、感染性疾病的診斷、耐藥菌株和藥敏檢測。
本發明將核酸擴增技術、連接酶反應(ligase detection reaction，縮寫為LDR)和生物芯片有機地結合起來，主要用于檢測核酸序列中的多態性位點。可同時檢測不同樣本中單個基因的多態性位點或一種樣本中多個基因的多態性位點。
參見圖1，本發明檢測步驟如下1.對核酸樣本進行擴增。
為得到大量含有單核苷酸多態性位點的核酸片斷，需要對核酸樣本進行擴增。采用能將少數含多態性位點的核酸片斷擴增成大量含有同樣多態性位點的核酸片斷的方法均可。例如，聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)、恒溫擴增等。聚合酶鏈式反應是將核酸樣本進行聚合酶鏈式反應，得到擴增產物。恒溫擴增最主要的特點是反應均在同一溫度下進行。如核酸序列的擴增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)，可通過逆轉錄酶、RNA酶H、RNA聚合酶三種酶協同作用，同時合成單鏈DNA，雙鏈DNA和單鏈RNA。
取核酸樣本，進行擴增反應，將少數含多態性位點的核酸片斷擴增成大量含有多態性位點的核酸片斷，得到擴增產物。對核酸樣本進行擴增可采用聚合酶鏈式反應或恒溫擴增等。恒溫擴增無需溫度變化的循環過程，所需儀器簡化，反應時間短。
2.液相雜交和連接酶反應。
為引入可識別單核苷酸多態性位點的檢測基團，便于檢測系統檢測。具體實施方案如下1)液相雜交加入區別探針(discriminating oligo)、通用探針(common probe)與擴增產物進行液相雜交，使擴增產物變性，得經液相雜交的擴增產物。
液相雜交中加入的區別探針須滿足下列條件(1)根據每一個多態性位點的堿基變化，采用與之相應的二至四條區別探針。
(2)每條區別探針的5′端均是帶有不同堿基序列的標簽探針，可與固定在生物芯片上對應的標簽互補探針發生特異性雜交。
(3)其中一條區別探針是完全匹配探針(perfect match probe)，其3′末端的堿基可與擴增產物中多態性位點雜交；(4)其余區別探針是不完全匹配探針(mismatch probe)，其3′末端的堿基不與擴增產物中多態性位點雜交；(5)每條區別探針的中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補。
液相雜交中加入的通用探針須具備下列條件(1)每個多態性位點采用一條與之對應的通用探針(2)通用探針5′端帶有磷酸基團；5′端的第一個堿基與多態性位點后的第一個堿基互補。
(3)通用探針3′端帶有可被檢測系統識別的檢測基團。檢測基團可以是熒光素，若丹明，綠色熒光蛋白、磁球、生物素以及用試驗室檢測系統可以識別的任何物質。本發明中檢測基團選擇Cy3，因為操作方便，可直接檢測，并且靈敏度高。
(4)通用探針中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補。
2)連接酶反應在連接酶的作用下，使液相雜交中的完全匹配探針和通用探針連接，以檢測單核苷酸的多態性。在連接酶反應中，因連接酶性質的不同，可分為高溫連接酶反應和普通連接酶反應。對經液相雜交的擴增產物進行純化，可除去擴增產物中多余的酶與引物。
采用耐高溫連接酶，如耐高溫的DNA連接酶(Taq DNA ligase)，在PCR儀中進行變性、連接循環過程，完全匹配探針與通用探針進行連接，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。采用耐高溫連接酶，反應速度快，連接效率高，但擴增產物須先經過純化。
純化方法用PCR產物純化試劑盒、酚氯仿抽提法、磁球分離法或堿性磷酸酶和外切酶I處理法等對擴增產物進行純化。以采用PCR產物純化試劑盒純化擴增產物的方法操作簡單，且純化效率高。
采用普通連接酶，如T4連接酶，0℃-25℃溫度下，完全匹配探針與通用探針進行連接，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。采用普通連接酶，擴增產物不需要純化，可直接連接，但反應速度慢，連接效率低。
3.固相雜交。
兩種不同的核酸分子通過堿基互補結合，堿基通過氫鍵結合。雜交實際發生在5′末端的標簽探針和固定在生物芯片上的標簽互補探針之間。將5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針與生物芯片雜交，雜交溫度為25℃-75℃，雜交時間為0.5h-36h，檢測基團被分配到生物芯片的不同位置。檢測基團可被檢測系統識別。雜交溫度為60℃時，雜交時間短，僅為1h；且雜交效率高。
在固相雜交中使用的生物芯片根據制作方式和固相載體的不同分為原位合成法、針點法、噴墨法等方式制成的、能確保標簽互補探針高效固定與其上的生物芯片。采用針點法制成的生物芯片，生物芯片制作過程比較簡單。微球、尼龍膜、醋酸纖維膜、玻璃片等能穩定固定標簽互補探針的固相載體。玻璃片作為固相載體，操作簡單，標簽互補探針固定效率高，成本低。
4.檢測單核苷酸多態性。
對雜交結果進行檢測分析，根據生物芯片不同位置上檢測基團的熒光種類、亮度及分布，可得到檢測結果。檢測方法采用直接檢測或間接檢測均可。
直接檢測檢測基團直接被檢測設備識別，如檢測基團是Cy3、Cy5、以及各種熒光基團、量子點等。采用直接檢測的方法，操作簡單，靈敏度高。
間接檢測檢測基團須與其他物質進一步發生反應后才可被檢測設備識別的方法。如檢測基團是生物素，磁球等。
實驗同時鑒定金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸炎沙門氏菌、小腸結腸耶爾森氏菌、單核增生李氏菌、福氏志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、A型產氣莢膜菌等八種食源性致病菌。
操作步驟1.取金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌0157:H7、腸炎沙門氏菌、小腸結腸耶爾森氏菌、單核增生李氏菌、福氏志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、A型產氣莢膜菌八種菌的核酸樣本，即基因組DNA。
2.用聚合酶鏈式反應對核酸樣本進行擴增。
3.進行液相雜交和連接酶反應。
4.進行固相雜交5.用Axon公司生產的Axon Genepix 4000B型芯片掃描儀對固相雜交后的產物進行檢測，在532nm通道的激光“PMT voltage”設為600，“Power”均設為100％對生物芯片進行掃描，得到生物芯片雜交圖譜，參見圖2。
6.對雜交圖譜進行分析證明本實驗最低可檢測到20ng的擴增產物，最低可檢測到的菌落總數為110cfu/mL。
本發明的核酸樣本，其核酸或核酸分子指的是單鏈或雙鏈形式存在的脫氧核(糖核)苷酸或核(糖核)苷酸多聚體，如沒有其他限制，還包括與天然核酸有著類似性質的物質。
1)可用于本試驗的核酸包括研究者感興趣的多態性位點及從根據多態性位點來的核酸。這里根據多態性位點來的核酸指的是最終用于模版的基因組DNA，其中包含有多態性位點。
(1)從基因組擴增而來的DNA，從擴增DNA而來的RNA，從基因組DNA轉錄而來的mRNA，或從mRNA反轉錄而來的cDNA等，都是根據多態性位點而來。
(2)在沒有特別說明時，能應用于本試驗的核酸樣本應該包括從基因組擴增而來的DNA，從擴增DNA而來的RNA，從基因組DNA轉錄而來的RNA，從mRNA反轉錄而來的cDNA，從cDNA而來的cDNA，從基因中擴增出的DNA，從擴增DNA中轉錄的RNA及類似的樣本。
(3)如果樣本不是DNA樣本，在擴增前首先需要將其轉化為雙鏈DNA，可以用反轉錄酶和(或)DNA聚合酶。
2)核酸樣本可以從單一的有機體而來，如人，動物，植物或微生物，也可以從多種微生物而來，這時檢測結果可以揭示核酸樣本等位基因出現的頻率。
3)核酸樣本應該是細胞、組織或其他生物性樣本的均勻混合物。
(1)生物樣本適合以總DNA為模版，有時也可以是總RNA，總RNA包括帶有Poly-A的已經成熟的mRNA和正在合成中的mRNA。
(2)生物性樣本指的是從任何有機體而來的生物組織、體液或細胞。
通常這些樣本都是臨床樣本，臨床樣本可以提供各種等位基因與其相關疾病的豐富信息。
此發明具體可以檢測基因突變及鑒別突變表型。所以此發明在臨床診斷和臨床研究上有著廣泛的應用價值。
臨床樣本包括體液、血漿、血細胞(如白細胞)、組織、骨髓等等。
生物樣本還包括另一些組織，如凍存或以福爾馬林液浸泡的樣本。
此外，細胞培養物也是一類典型的生物樣本，它可以是臨床樣本，最初的細胞培養物，次培養物，任何一種有機物細胞系，都可以作為DNA和RNA樣本的來源。
本發明主要試劑的說明Taq DNA聚合酶可采用寶生物工程(大連)有限公司的產品。
Taq DNA連接酶可采用美國NEB公司生產的產品。
Tris-HCl緩沖液可實驗室配制。
脫氧核酸三磷酸混合物dNTPs可采用美國Invitrogen公司生產的產品。
特異性PCR引物可采用北京三博遠志生物技術有限責任公司合成的產品。
區別探針可采用北京三博遠志生物技術有限責任公司合成的產品。
通用探針可采用北京三博遠志生物技術有限責任公司合成的產品。
tag探針可采用北京三博遠志生物技術有限責任公司合成的產品。
antitag探針可采用北京三博遠志生物技術有限責任公司合成的產品。
PCR產物純化試劑盒可采用美國QIAGEN公司生產的產品。
權利要求
1.一種生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)對核酸樣本進行擴增取核酸樣本，進行擴增反應，將少數含多態性位點的核酸片斷擴增成大量含有同樣多態性位點的核酸片斷，得到擴增產物；2)進行液相雜交和連接酶反應(1)進行液相雜交加入區別探針和通用探針，與擴增產物進行液相雜交，得經液相雜交的擴增產物；(2)進行連接酶反應進行連接酶反應，使液相雜交中的完全匹配探針和通用探針連接；3)進行固相雜交將5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針與生物芯片進行雜交，溫度25℃-75℃，時間0.5h-36h，檢測基團被分配到生物芯片的不同位置；4)進行單核苷酸多態性檢測檢測生物芯片不同位置上檢測基團的熒光種類、亮度及分布，得檢測結果。
2.根據權利要求1所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的連接酶反應為高溫連接酶反應，實現步驟如下1)對經液相雜交的擴增產物進行純化；2)進行連接酶反應采用耐高溫連接酶，在PCR儀中進行變性、連接循環過程，完全匹配探針與通用探針進行連接，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。
3.根據權利要求2所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的純化是用PCR產物純化試劑盒、酚氯仿抽提法、磁球分離法或堿性磷酸酶和外切酶I處理法對擴增產物進行純化。
4.根據權利要求1所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的連接酶反應為普通連接酶反應，實現步驟如下采用普通連接酶，0℃-25℃溫度下，成為一條5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針。
5.根據權利要求1或2或4所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的區別探針具備下列條件1)根據每一個多態性位點的堿基變化，采用與之相應的二至四條區別探針；2)每條區別探針的5′端均是帶有不同堿基序列的標簽探針，可與固定在生物芯片上對應的標簽互補探針發生特異性雜交；3)其中一條區別探針是完全匹配探針，其3′末端的堿基可與擴增產物中多態性位點雜交；4)其余區別探針是不完全匹配探針，其3′末端的堿基不與擴增產物中多態性位點雜交；5)每條區別探針的中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補；所述的通用探針具備下列條件1)每個多態性位點采用一條與之對應的通用探針；2)通用探針5′端帶有磷酸基團，5′端的第一個堿基與多態性位點后的第一個堿基互補；3)通用探針3′端帶有可被檢測系統識別的檢測基團；4)通用探針中間部分與擴增產物的序列堿基部分互補。
6.根據權利要求5所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的檢測基團是熒光素、若丹明、綠色熒光蛋白、量子點、膠體金、磁球或生物素。
7.根據權利要求5所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的對核酸樣本進行擴增是采用聚合酶鏈式反應或恒溫擴增。
8.根據權利要求7所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的生物芯片是采用原位合成法、針點法或噴墨法方式制成的，所述生物芯片的固相載體為微球、尼龍膜、醋酸纖維膜或玻璃片。
9.根據權利要求8所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的進行單核苷酸多態性檢測是采用直接檢測或間接檢測。
10.根據權利要求9所述的生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其特征在于所述的固相雜交溫度為60℃，固相雜交時間為1h。
全文摘要
一種生物芯片檢測單核苷酸多態性的方法，其首先對核酸樣本進行擴增，得到擴增產物；再進行液相雜交和連接酶反應，使液相雜交中的完全匹配探針和通用探針連接，以檢測單核苷酸的多態性；然后進行固相雜交，將5′端帶有標簽探針、3′端帶有檢測基團的探針與生物芯片進行雜交，溫度25℃－75℃，時間0.5h－36h，檢測基團被分配到生物芯片的不同位置；進行單核苷酸多態性檢測，得檢測結果。本發明解決了背景技術中難以實現高通量檢測、檢測成本高的技術問題。本發明具有簡便、快速、靈敏、特異性高等特點，應用范圍廣泛，可檢測多種單核苷酸多態性位點。
文檔編號C12Q1/68GK101034061SQ200610041898
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月9日 優先權日2006年3月9日
發明者陳超, 聶萌, 杜蓬, 李錚 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司