專利名稱：一種治療斑禿的藥物及其在臨床中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療斑禿的藥物，特別是涉及一種治療斑禿的藥物的臨床應用。
背景技術：
斑禿是皮膚科臨床常見疾病之一，占皮膚科門診量的10～15％，由于生活節(jié)奏的加快，這一數字還有進一步升高的趨勢，斑禿進一步發(fā)展可演變?yōu)槠斩d和全禿，這給患者身心帶來嚴重的負擔。在斑禿的的治療中，多以全身或局部應用激素，但長期使用激素會產生一系列明顯的副作用如庫欣氏征、皮膚變薄等。鑒于激素治療斑禿帶來的副作用，如何減少或不用激素治療斑禿是目前亟待需要解決的問題。
發(fā)明內容
一般認為，人毛乳頭細胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的發(fā)育及周期性生長調控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細胞對調節(jié)毛囊生長和發(fā)育的機制，必須從人毛乳頭細胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今后毛囊研究的重要內容之一。我們在建立人毛乳頭細胞體外培養(yǎng)模型基礎上，應用低傳代人毛乳頭細胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細胞生長狀態(tài)的影響，發(fā)現人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細胞有效誘導為凝集性生長狀態(tài)，并促進細胞增殖。為進一步分析人毛乳頭細胞生長活性蛋白的體內生物學活性，我們將人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，初步應用于斑禿患者，發(fā)現其有確切的治療效果。
鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種治療斑禿的藥物。
本發(fā)明的另一目的在于治療斑禿的藥物在臨床中的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下方案來實現的一種治療斑禿的藥物，是用含人AB型血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。
(1)上述人AB型血清制備的步驟為a)采集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，e)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小于0.5℃；f)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
(2)上述人AB型血清制備的步驟也可為a)采集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
(3)上述的基礎培養(yǎng)基的制備方法基礎培養(yǎng)基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
上述的低糖培養(yǎng)基(DMEM)購自Sigma公司。Hepes購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院輸血科提供。醋酸曲安奈德注射液(丙酮去炎松)上海通用藥業(yè)股份有限公司。
(4)人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液的收集過程為
a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭；b)培養(yǎng)時在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎培養(yǎng)基，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎培養(yǎng)基，3天換一次基礎培養(yǎng)基；c)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代人毛乳頭細胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機中離心；d)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標記，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br>
(5)人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為a)凍干室紫外線消毒4小時；b)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；c)將凍干瓶放入凍干機中；d)連續(xù)凍干過程I -40℃4小時II -20℃3小時III -5℃ 10小時IV 5℃ 4小時V15℃3小時VI 25℃5小時e)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標簽，注明標識和日期，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
(6)臨床使用時，凍干粉的溶解過程每瓶用3ml生理鹽水溶解，溶解后的橙紅色溶液即為治療斑禿的藥物。
(7)治療斑禿的藥物的臨床應用及觀察過程選擇直徑在5厘米以下的斑禿患部，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點注射，每周1次，每個患部每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察2月。藥物的臨床應用(1)藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復凍干前原始濃度)。
治療斑禿的藥物的理化特性為顏色白色；形態(tài)粉末狀；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
(2)藥物治療組(DPCCM治療組)選擇50例年齡在12～64歲的斑禿患者，選擇直徑在5厘米以下的斑禿患部，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點注射，每周1次，每個患部每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察2月。
(3)去炎松治療組選擇藥物治療組中多發(fā)性斑禿患者26例，選擇與藥物治療患部距離在2cm以上的患部作為去炎松治療患部；用3mL生理鹽水溶解1mL去炎松懸液，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點注射，每周1次，共4次，治療完成后觀察2月。
(4)空白對照組選擇藥物治療組中多發(fā)性斑禿患者10例，選擇與藥物治療部位距離在5cm以上的患部作為空白自身對照患部，用3mL生理鹽水，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點注射，每周1次，共4次，治療完成后觀察2月。
(5)治療效判斷標準病損部皮膚新生終毛大于20根/cm2為治愈，少于20根/cm2為有效，治療后無改變?yōu)闊o效。
(6)藥物治療斑禿的治愈率和有效率比較(見表1)表1 各組斑禿治療2月后情況(％)
*與空白對照組比較，P＜0.01，*與去炎松組比較，P＜0.01
本發(fā)明的優(yōu)點和產生的有益效果是人毛乳頭細胞為分泌性細胞，在體外培養(yǎng)時可分泌許多蛋白質，這些蛋白質可促進毛囊的生長和發(fā)育，在體外實驗我們已證明其有確切的生物學活性，但其應用于臨床還未見報道，我們在原有培養(yǎng)人毛乳頭細胞的基礎上，改進其培養(yǎng)基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養(yǎng)出人毛乳頭細胞，我們收集培養(yǎng)過低傳代人毛乳頭細胞的基礎培養(yǎng)基，用于臨床治療斑禿，觀察其治療效果，發(fā)現有確切的治療作用，取得了良性的經濟效益和社會效益。
應用本發(fā)明制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優(yōu)于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細胞和培養(yǎng)血清均對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應，本發(fā)明用含人AB型血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)人毛乳頭細胞，較以前用小牛血清培養(yǎng)人毛乳頭細胞在技術上取得了突破，這就為本藥物應用于臨床奠定了基礎，同時，這也是本發(fā)明關鍵技術的核心所在。
圖1單發(fā)斑禿藥物治療前照片圖2單發(fā)斑禿藥物治療后照片圖3多發(fā)斑禿藥物治療前照片圖4多發(fā)斑禿藥物治療后照片圖5大面積斑禿藥物治療前照片圖6大面積斑禿藥物治療后照片具體實施方式
藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復凍干前原始濃度)。
(1)藥物的生物安全性實施例①小鼠急性毒性試驗我們選用7～9周齡、體重為18～22g的昆明種小鼠。按預試驗公比0.8設立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后立即觀察、記錄動物的中毒反應、死亡情況及時間，連續(xù)觀察14天。
②家兔熱原試驗選3只體重為1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔1小時測量體溫1次，共3次。
③細菌培養(yǎng)隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種于普通血平板上，培養(yǎng)48小時后觀察結果。
④真菌培養(yǎng)隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10日后觀察結果。
結果小鼠急性毒性試驗顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各組動物未發(fā)現明確的中毒癥狀，在整個試驗期限內無動物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各動物的體溫變化均符合熱原試驗的要求。細菌和真菌培養(yǎng)均未見細菌和真菌生長。
(2)典型病例介紹①患者XX，男性，18歲，頭部出現斑塊狀禿發(fā)1月來我院診治，圖1為治療前，圖2為藥物治療后1月照片，可以看見有大約30根/cm2終毛長出。
②患者XX，男性，27歲，頭部出現斑塊狀禿發(fā)2月來我院診治，圖3為治療前，圖4為治療后2月照片，可以看出藥物治療部位頭發(fā)已長好，去炎松治療部位還有少量斑禿區(qū)未長頭發(fā)③患者XX，男性，14歲，頭部出現斑塊狀禿發(fā)12月來我院診治，圖5為治療前，治療區(qū)域呈矢狀橢圓，圖6為治療后2月照片，可以看出藥物治療部位頭發(fā)已長好，去炎松治療部位還有少量斑禿區(qū)頭發(fā)生長較少，空白對照部位未長頭發(fā)。
從臨床應用中，我們認識到毛乳頭在毛囊的生長發(fā)育、周期調控及維持毛發(fā)生長中起主導作用。毛乳頭的功能障礙是導致毛囊周期失衡和脫發(fā)的主要原因。目前對毛乳頭細胞的研究已發(fā)現一些活性蛋白對毛囊的生長有調節(jié)作用。在前期的研究中，我們證實了毛乳頭細胞在體外凝集性生長狀態(tài)下較非凝集性生長狀態(tài)下其生物學功能及誘導毛囊形成的能力均顯著增強，并在裸鼠體內用人頭皮凝集性生長狀態(tài)的毛乳頭細胞與毛囊上皮細胞共同移植成功地誘導了分化成熟的毛囊結構，提示毛乳頭細胞在凝集性生長狀態(tài)下可以表達某種具有誘導毛囊生長的蛋白，而在非凝集性生長狀態(tài)這種特性則減弱甚至消失。也就是說，毛乳頭細胞的凝集性生長狀態(tài)可能與其調控毛囊生長功能緊密關聯(lián)，我們在體外試驗也證實藥物可使非凝集性生長狀態(tài)的毛乳頭細胞向凝集性生長狀態(tài)轉化。我們收集毛乳頭細胞在凝集性生長狀態(tài)下的培養(yǎng)液并制成凍干粉，在確定其生物安全性得到保證且符合倫理的前提下，用于治療斑禿患者，進一步揭示藥物是否有促進毛囊生長的作用。
藥物在通過生物安全鑒定后，我們在患者知情同意的情況下應用于患部。50例藥物治療的斑禿患者中，除2例無效外其余均有一定療效，這與去炎松治療組比較取得了肯定的療效。在藥物治療組中有29例為復發(fā)性斑禿患者且多次臨床治療無效，這29例患者經藥物治療后除1例無效外其余均有一定療效，說明藥物在治療復發(fā)性斑禿上同樣療效確切。在藥物治療的50例斑禿患者中，我們選擇26例多發(fā)性斑禿患者，在同一患者頭部不同的斑禿區(qū)分別應用藥物和去炎松，發(fā)現藥物在治療斑禿時，其促進頭發(fā)生長的速度明顯快于去炎松治療組，而且新生毛發(fā)在光澤度上也明顯優(yōu)于去炎松治療組。藥物治療斑禿患者時新生毛發(fā)的生長先是呈島狀生長的，而去炎松則是呈現平原狀生長，說明毛發(fā)的生長是有一定的相互促進作用，也可能與一定的毛乳頭生長活性蛋白濃度依賴有關。我們用生理鹽水作空白對照，發(fā)現有3例新發(fā)斑禿患者有一定療效，而復發(fā)性斑禿無一例有效，說明對于新發(fā)的斑禿，用一定的刺激是有一定的療效的，而復發(fā)性斑禿用普通刺激則效果較差，這也與過去臨床上用生姜、辣椒膏、石碳酸等外用治療斑禿結果相一致。
權利要求
1.一種治療斑禿的藥物，其特征在于用含人AB型血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。
2.一種治療斑禿藥物在臨床中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物，特別是涉及一種治療斑禿藥物的臨床應用。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎培養(yǎng)基，該基礎培養(yǎng)基按15ml人AB型血清、85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03g L－谷氨酰胺配比構成。用基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養(yǎng)上清為人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液，將所收集的人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液制備成凍干粉。將凍干粉用生理鹽水溶解后應用于臨床，治療斑禿患者，發(fā)現其有確切的治療作用。本發(fā)明所制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優(yōu)于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細胞和培養(yǎng)血清對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應，克服激素治療斑禿給人體帶來的副作用。
文檔編號C12N5/08GK1850272SQ20061004184
公開日2006年10月25日 申請日期2006年2月23日 優(yōu)先權日2006年2月23日
發(fā)明者羅洋 申請人:羅洋