規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法

專利名稱：規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法
專利說明規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法 本發明涉及一種規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，屬生物技術領域。熒光素酶是ATP生物發光檢測體系中一個關鍵成份，近年來主要有兩種生產方式，一是通過螢火蟲來提取純化，其原材料要依靠人工捕捉或通過農場或實驗室大量養殖；另一方法是通過基因工程的方法生產。早在1884年，Dubols就已開始收集螢火蟲發光尾部，研究其發光的化學本質。1887年明確螢火蟲發光涉及熒光素、蟲光素酶和氧。1958年Green和McElory首次得到結晶的熒光素酶。1974年McElory指出高能磷酸化合物ATP在生物發光中起重要作用。此后，歐、美、日等在研究生物發光同時，依據熒光素酶和ATP之間的關系開始在生物、醫學、環衛等方面付諸實用。另一方面，1985年De WET，J.R.等首次克隆了螢火蟲(Photinus pyralis)的螢光素酶(簡稱FL)基因，1986年，De WET，J.R.測定了FL基因的cDNA序列，隨后各種發光甲蟲的FL基因相繼克隆成功，并在原核和真核基因中表達。迄今，該領域國際發展動向可歸納為以下幾點1)美、德等通過農場或實驗室大量養殖螢火蟲以制備螢光素酶，從而使應用日益擴大，并取得可觀的經濟效益(2004年價格，美國Sigma公司為196.10美元/mg)。2)美、法、日等大力研究蟲光素酶的固定化技術及光纖感應元件制作技術，從而使檢測連續化、穩定化、精確化。3)批量生產高靈敏、便攜式，適用于不同應用目的發光檢測儀器。4)拓展熒光素酶應用范圍，提高檢測精度，降低使用成本。5)克隆螢光素酶基因及對螢光素酶基因進行定點突變以期消除螢光素酶的溫度敏感性。
螢光素酶的兩種生產方式各有優缺點，從自然界或養殖的螢火蟲中提取熒光素的方法，可以用較少的成本獲得產品，并且不用擔心基因變異丟失等不穩定因素，但來源受季節性限制。而基因工程方法，雖可以不受季節和地域的限制，并可以對螢光素酶基因進行一些改造，使生產的螢光素酶降低對溫度的敏感性，但工程菌的構建比較麻煩，花費大，且構建好的工程菌也存在不穩定的因素。
螢光素酶商業制劑主要有三種不同純度的商品1)粗的螢光素酶提取物，2)部分純化的螢光素酶，3)純度較高的結晶螢光素酶。不同的用途對螢光素酶制劑的要求不同，對靈敏度要求不高的可用部分純化的產品，對靈敏度要求高的樣品，必須使用高靈敏度的螢光素酶制劑。ATP生物發光檢測法的檢測靈敏度由試劑的質量、儀器的性能和樣品處理方式等三個方面的因素決定，其中發光試劑的質量主要由熒光素酶的質量決定，在ATP生物發光法中提高生物發光試劑中熒光素酶的純度和比活力對提高檢測靈敏度極其重要。但由于天然螢火蟲中熒光素酶蛋白含量不高，對溫度又很敏感，而且螢火蟲中除含有大量的脂肪外，還含有大量的各種雜酶和熒光素，因此一般的純化方法很難達到在去除本底的同時又保持螢光素酶的活力。本發明針對一般的純化方法存在的問題，創建起一套從天然螢火蟲中制備高活力低成本的熒光素酶的提取和純化方法，以用于規模化生產熒光素酶。
本發明包括三部分內容，一是天然熒光素酶的提取，在低溫條件下從天然螢火蟲蟲尾，通過添加提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到含熒光素的粗酶制劑；二是粗酶制劑的純化，通過復溶、透析、超濾、離心和陽離子交換法去除99％的本底，提高熒光素酶的發光比活力50倍以上；進一步的熒光素酶的精制包括進行一次分子排阻、親和層析和二次分子排阻層析，其活力和本底之比可提高到5690倍。
本發明的具體操作方法如下1.天然熒光素酶的提取(1)天然熒光素酶的粗提純剪取天然螢火蟲的蟲尾，在4℃低溫條件下按l∶2～5體積比加入酶提取B液研磨后，按l∶5～8體積比加入酶提取A液，在4℃條件下以5000～12000r/min離心10～20min，去除上層脂肪和下層沉淀，得到澄清的酶液。
酶提取B液含25mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-Na2，2mmol/L PMSF(苯磺酰氟)，10％飽和硫酸銨，pH7.8；酶提取A液B液組份中不加PMSF。
(2)天然熒光素酶的硫酸銨分級沉淀在低溫條件下于上述澄清酶中加硫酸銨至30～40％飽和度，放置2～12h，5000～12000r/min離心10～20min去除沉淀，得到上清酶液，繼續加硫酸銨至70～90％飽和度，4℃條件下放置12～24h，以5000～12000r/min離心10～20min，得到熒光素酶的粗酶沉淀，冷凍干燥后可得含熒光素的粗酶制品。
2.天然熒光素酶粗酶的純化(1)復溶與透析熒光素酶的粗酶沉淀加8～10倍酶復溶液(50mmol/L NTE，pH7.8緩沖液)，低溫條件下在酶透析液(含0.1mol/L NaCl，10～100mmol/L PBS，10％乙二醇(V/V)，pH7.5)中透析24～50h，加入3～5倍酶液體積的pH5.8～7.8的50mmol/L PBS緩沖液，采用5000～12000r/min離心10～20min，去除沉淀，得到澄清的酶液。50mmol/L NTE，pH7.8緩沖液即為含50mmol/L NaHCO3，10mmol/L Tris，1.0mmol/L EDTA，pH7.8的緩沖液。
(2)超濾濃縮并更換緩沖液在低溫條件下通過超濾濃縮使酶液體積減少至超濾前的1/8～1/10體積，采用pH5.8～7.2的50mmol/L PBS洗濾后，將濃縮酶液轉至pH5.8～7.8的50mmol/L PBS緩沖液中。超濾條件依需要濃縮的體積和要求的時間決定，一般情況下，在低溫下超濾時間不要超過2h，超濾膜選用10K道爾頓，轉速依儀器的性能而定。
(3)陽離子柱純化陽離子交換柱的交換介質為SP SEPHAROSE FF，柱直徑和長度比為16mm/10cm或26mm/10cm或35mm/32cm；洗脫緩沖液A液50mmol/L PBS，pH5.8～7.8；洗脫緩沖液B液A液+2mol/L NaCl，調pH5.8～7.8。
上樣量不超過柱的容量，上樣速度1～4ml/min，洗脫速度6～10ml/min；洗脫方式線性梯度洗脫或步級梯度洗脫，根據酶活力測試收集酶峰，合并，超濾法去鹽加酶保護劑凍干即可。
熒光素酶保護劑取100～1000mg海藻糖、50～1000mg PEG6000及10～200mg BSA，溶解于10mL無菌蒸餾水中，進行無菌過濾除菌即可。
使用量酶保護劑與酶液按1∶1比例混合即可。
3.天然熒光素酶的精制(1)一次分子排阻層析經陽離子交換純化的熒光素酶液，緩慢加硫酸銨至70～90％飽和度，于4℃條件下保存一定時間(3～10天)，5000～12000r/min離心10～20min，酶泥用適量pH7.8濃度50mmol/L的NTE緩沖液復溶，得到液體酶后上分子排阻層析柱S-200，流速0.8～1.7mL/min，洗脫液為pH7.8，50mmol/L的NTE緩沖液、經ATP發光檢測后收集活力組份，合并得到一次分子排阻層析的純化酶。
(5)親和層析將上述分子排阻層析純化酶導入經50mmol/L NTE pH7.8緩沖液平衡好的HiTrap Blue親和層析柱中，平衡洗脫收集蛋白峰，經ATP發光檢測后收集活力組份，檢測純化后的酶發光活力與本底的CP6S值。
親和層析柱選用HitrapTM1mL Blue HP或HitrapTM5mL Blue HP；洗脫液A液為50mmol/L NTE pH7.8緩沖液，B液為A液+2mol/L NaCl；
上樣速度1～4ml/min，洗脫速度6～10ml/min；洗脫方式線性梯度洗脫或步級梯度洗脫。
(6)二次分子排阻層析經親和層析柱的純化酶液，在4℃條件下，置于透析袋中放PEG1000～PEG60000上濃縮5～10倍后，再次用分子排阻層析G-75柱純化，流速0.8～1.7ml/min，洗脫液為50mmol/LNTE pH7.8緩沖液，經ATP發光檢測后收集活力組份得到二次分子排阻層析純化酶，合并酶液，檢測其發光活力和本底值，加上酶保護劑冷凍干燥即成為高純度的熒光素酶。熒光素酶保護劑取100～1000mg海藻糖、50～1000mg PEG6000及10～200mg BSA，溶解于10mL無菌餾水中，進行無菌過濾除菌即可。使用量酶保護劑與液體酶按1∶1比例混合即可。實施例1天然熒光素酶的提取(1)溶劑的配制A液配制3.0285g Tris +372.24mgEDTA-Na2+56g(NH4)2SO4溶于800ml水中，用HCL或NaOH調節pH為7.8，定容至1000ml，0.45μm濾膜過濾除菌；B液配制先取0.3484g PMSF溶于95％乙醇中，PMSF的濃度即為200mmol/L。用時再加至A液中使PMSF濃度為2mmol/L，即為B液。
酶透析液0.1mol/L NaCl，10～100mmol/L PBS，10％乙二醇(V/V)，pH7.5。須先配10～100mmol/L的PBS緩沖液，配制方法見見植物生理學實驗手冊，p604，加上NaCl后調整pH值，再按體積比10％的量加乙二醇。
(2)粗酶液制備剪下3.0g湖南螢火蟲的蟲尾，約1.3～1.5g，在4～10℃下加5ml酶提取緩沖液B液研磨，再加提取緩沖A液10ml洗滌，合并提取液在轉速10000r/min，離心10mim，去除上層脂肪棄沉淀，得上清液約15ml即為粗熒光素酶液。
(3)粗酶液的硫酸銨分段鹽析往上述15ml粗熒光素酶液中緩慢加入1.8g硫酸銨鹽至飽和度30％，采用12000r/min，離心20分鐘，去除上層脂肪后的上清液繼續加硫酸銨5.3g至80％飽和度，放置48h后，經12000r/min離心20min，棄離心上清液，收集酶沉淀，凍干即為含熒光素的熒光素酶粗制劑。
(4)粗熒光素酶透析除本底上述酶的離心沉淀加3.0ml酶提取B液復溶，然后采用透析液透析10h，得到3.8mL透析酶液。取0.2ml酶液加上ATP(或無菌水)和或加上D-熒光素后在1mL檢測系統中檢測1min的發光脈值，天然螢火蟲熒光素酶的提取結果見表1。
表1天然螢火蟲熒光素酶的提取結果
檢測系統CPM1為0.2mL FL+0.8mL GB，代表酶的本底發光值；CPM2為0.2mL FL+0.1mL 4×10-4mol/L ATP+0.7mL GB，代表不加熒光素的發光值；CPM3為0.2mL FL+0.1mL 4×10-4mol/L ATP+25μL Ln(1mg/mL D-luciferin)+0.675mL GB，代表加熒光素的發光值。FL為熒光素酶液；GB為檢測緩沖液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.8。
實施例2天然熒光素酶的純化1.純化用溶劑的配制酶復溶液(50mmol/L NTE緩沖液)含50mmol/L NaHCO3，10mmol/L Tris，1.0mmol/LEDTA，pH7.8。稱取4.2g NaHCO3，1.21g Tris，372.24mg EDTA溶于800mL蒸餾水，調節至pH7.8后，定溶至1000ml，過濾除菌。
酶透析液含0.1mol/L NaCl，10～100mmol/L PBS，10％乙二醇(V/V)，pH7.5。須先配10～100mmol/L的PBS緩沖液，加上NaCl后調整pH值至7.5之后再加乙二醇，按體積比10％的量加入。
2.鹽析酶的復溶與透析從10g取廣東螢火蟲剪取蟲尾約3.0g，按上述實施1的方法提取得粗酶泥，用30ml酶復溶液(50mmol/L NTE，pH7.8)復溶。上述復溶酶液在酶透析液中透析40h后，得透析酶液約25ml。
3.超濾濃縮并更換緩沖液在上述25ml透析酶液中加入100mL pH6.0，50mmoL/L的PBS，以5000r/min離心10min，取上清酶液上超濾機以150r/min轉速在45min內濃縮至約25～30ml，再加30ml pH6.0，50mmoL/L的PBS洗濾一次，得50ml左右酶液，以5000r/min離心10min，即用于下一步陽離子交換法純化。
3.陽離子交換柱純化熒光素酶將上述50ml超濾濃縮酶導入已經用pH6.0，50mmoL/L PBS緩沖液平衡過的陽離子柱SP SEPHAROSE FF 2.6/20，選用柱型為26mm/20cm，洗脫緩沖液A液50mmol/L PBS，pH6.0；洗脫緩沖液B液A液+2mol/L NaCl，pH6.0。上樣量50mL，上樣速度1ml/min，洗脫速度10ml/min；洗脫方式步級梯度洗脫。用ATP生物發光法檢測酶活力，收集線性峰洗脫液液共25ml，其1×10-7mol/L ATP發光活力與本底的CP6S值分別為8104和117。天然螢火蟲熒光素酶的純化結果見表2。
表2天然螢火蟲熒光素酶純化結果
注CP6SCK為加無菌水的檢測結果，屬本底發光值；CP6SATP為加0.1mL 1×10-7mol/L ATP的檢測結果，代表發光活力。
實施例3規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶1.粗酶制備稱取75g螢火蟲，按上述實施1的方法提取得粗酶泥，分成三等份待用。
2.酶泥的復溶與透析取上述粗酶泥一份約25g，加100ml酶復溶液(50mmol/L NTE，pH7.8緩沖液)溶解，然后在4℃低溫條件下、酶透析液(含0.1mol/L NaCl，10～100mmol/L PBS，10％乙二醇(V/V)，pH7.5)中透析處理40h，獲得透析酶液86ml。
3.超濾濃縮并更換緩沖液在上述透析酶液中加入250mL pH6.0，50mmol/L PBS，在4℃條件下以5000r/min，離心10min，取上清酶液上超濾機，以150r/min轉速在2h內濃縮至約50ml。超濾系統為德國Sartorius分司的VIVASCIENCE系列產品VIVAFLOW200(10K)超濾膜包和保定蘭格恒流泵YZ1515 BT-600。然后再加入80ml pH6.0，50mmoL/L PBS洗濾一次，得120ml左右酶液，即可用于下一步精制純化。
4.熒光素酶粗酶液的精制純化(1)陽離子交換柱純化熒光素酶取上述120ml左右超濾濃縮酶上已經用pH6.0，50mmoL/L PBS緩沖液平衡好的陽離子柱SP SEPHAROSE FF 3.5/32，洗脫緩沖液A液50mmol/L PBS，pH6.0；洗脫緩沖液B液A液+2mol/L NaCl，調pH6.0。上樣量120mL，上樣速度4ml/min，洗脫速度10ml/min；洗脫方式步級梯度洗脫。用ATP生物發光法檢測酶活力，收集線性峰洗脫液。其它兩份同樣操作，得到初步純化酶液共220ml。經ATP發光測定三批次純化酶的1×10-7mol/L ATP發光活力及本底的CP6S值，結果分別為8723，166；7886，119；11451，176。
(2)一次分子排阻層析合并上述三份經陽離子交換純化的熒光素酶，緩慢加硫酸銨至80％飽和度，于4℃條件下保存5天。分成相等的兩份，12000r/min離心20min，酶泥用10mL 50mmol/L NTEpH7.8緩沖液復溶，得兩份15ml左右的液體酶，分兩次上分子排阻層析柱S-200(直徑長度＝2.6cm.60cm)，流速1.0mL/min，洗脫液為50mmol/L NTE pH7.8緩沖液。用ATP生物發光法檢測酶活力，收集線性峰洗脫液，共得到100ml左右純化酶。
(3)親和層析上述100ml分子排阻層析酶分三次上經50mmol/L NTE pH7.8緩沖液平衡好的親和層析柱，親和層析柱選用HitrapTM5mL Blue HP；洗脫液A液50mmol/L NTE pH7.8緩沖液，B液A液+2mol/L NaCl，上樣速度1～4ml/min，洗脫速度6～10ml/min；洗脫方式線性梯度洗脫。用ATP生物發光法檢測酶活力，收集線性峰洗脫液，得純化后的酶液25ml。用ATP生物發光法檢測酶活力，其1×10-7mol/L ATP發光活力與本底的CP6S值分別為97394，24。
(4)二次分子排阻層析純化經親和層析純化后的純化酶，在4℃條件下，用透析袋扎緊放置于PEG1000～60000上濃縮5～10倍后，再次上分子排阻層析G-75柱(直徑長度＝1.6cm60cm)，流速1ml/min，洗脫液為50mmol/L NTE pH7.8緩沖液，用ATP生物發光法檢測酶活力，收集線性峰洗脫液，得純化后的酶液5ml。用ATP生物發光法檢測酶活力，其1×10-7mol/L ATP發光活力與本底的CP6S值分別為28452，5。上述純化過程的酶活結果見表3。
表3擴大規模的螢火蟲熒光素酶純化結果
注*為25g螢火蟲中熒光素酶的發光值。CP6SCK為加無菌水的檢測結果，屬本底發光值；CP6SATP為加0.1mL 1×10-7mol/L ATP的檢測結果，代表發光活力。文中代號的含義說明1、透析液中PBS含義為磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的緩沖鹽；2、檢測緩沖液(簡稱GB)25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.8；3、CP6S為在6秒內的發光值；CPM為在1min內的發光值；4、分子排阻層析G-75柱HiLoadTM16/60 SuperdexTMG-75；5、分子排阻層析柱S-200HiPrepTM26/60 sephacrylTMS-200HR；6、PEG聚乙二醇(分子量4000～6000)；7、Ln(1mg/mL D-luciferin)用50mmol/L GB配D-熒光素。
權利要求
1.一種規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，包括(1)天然熒光素酶的提取取天然螢火蟲蟲尾，在低溫條件下添加酶提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到粗酶制劑；(2)粗酶制劑的純化通過復溶、透析、超濾、離心和陽離子交換柱層析等過程純化；(3)熒光素酶的精制采用一次分子排阻層析、親和層析和二次分子排阻層析進一步精制。
2.權利要求1所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中天然熒光素酶的提取過程為(1)天然熒光素酶的粗提純取天然螢火蟲的蟲尾，在4～10℃低溫條件下按1∶2～5體積比加入酶提取A液研磨后，按1∶5～8體積比加入酶提取B液，在4℃下以5000～12000r/min離心10～20min，去除上層脂肪和下層沉淀，得到澄清的酶液；(2)天然熒光素酶的硫酸銨分級沉淀在低溫條件下于上述澄清酶液中加硫酸銨至30～40％飽和度，放置2～12h，5000～12000r/min離心10～20min，去除沉淀得到上清酶液。繼續加硫酸銨至70～90％飽和度，4℃下放置12～24h，以5000～12000r/min離心10～20min，得到熒光素酶的粗酶沉淀。
3.權利要求2所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中天然熒光素酶的提取過程所加的酶提取A液含25mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-Na2，2mmol/L PMSF，10％飽和硫酸銨，pH7.8；酶提取B液為A液組份中不加PMSF。
4.權利要求1所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中粗酶制劑的純化過程為(1)復溶與透析熒光素酶的粗酶沉淀加8～10倍酶復溶液，低溫條件下在酶透析液中透析24～50h，加入3～5倍酶液體積的pH5.8～7.8的50mmol/L PBS，采用5000～12000r/min離心10～20min，去除沉淀得到澄清的酶液；(2)超濾濃縮并更換緩沖液在低溫條件下通過超濾濃縮使酶液體積減少至超濾前的1/8～1/10體積，采用pH5.8～7.8的50mmol/L PBS洗濾；超濾條件依需要濃縮的體積和要求的時間決定，一般情況下，在低溫下超濾時間不超過2h，超濾膜包選用10K，轉速依儀器的性能選定。(3)陽離子柱純化陽離子交換柱的交換介質為SP SEPHAROSE FF，采用線性梯度洗脫或步級梯度洗脫，根據酶活力測試收集酶峰，合并酶液，超濾法去鹽。
5.權利要求1所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中熒光素酶的精制過程為(1)一次分子排阻層析經陽離子交換純化的熒光素酶液，緩慢加硫酸銨至70～90％飽和度，于4℃條件下保存3～10天，5000～12000r/min離心10～20min；酶泥用適量酶復溶液復溶，得到液體酶后上分子排阻層析柱S-200，流速0.8～1.7mL/min，洗脫液為酶復溶液，經酶活檢測后收集活力組份，得一次分子排阻層析的純化酶；(2)親和層析將上述分子排阻層析純化酶液導入經酶復溶液平衡好的親和層析柱HitrapTM1mL Blue HP或HitrapTM5mL Blue HP；洗脫液A液為酶復溶液，洗脫液B液為A液+2mol/L NaCl；上樣速度1～4ml/min，洗脫速度6～10ml/min，采用線性梯度洗脫或步級梯度洗脫，經酶活檢測后收集活力組份；(3)二次分子排阻層析經親和層析柱的純化酶液，用PEG濃縮后，再次上分子排阻層析G-75柱，流速0.8～1.7mL/min，洗脫液為酶復溶液，經酶活檢測后收集活力組份得到二次分子排阻層析純化酶，合并酶液，按體積比1∶1加上酶保護劑，冷凍干燥，即得高純度的熒光素酶。
6.權利要求4或5所述提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中所用的酶復溶液含50mmol/L NaHCO3、10mmol/L Tris、1.0mmol/L EDTA、pH7.8。
7.權利要求4所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中所用的酶透析液含0.1mol/LNaCl、10～100mmol/L PBS、10％乙二醇(V/V)、pH7.5。
8.權利要求4所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，其中陽離子柱層析選用直徑和長度比為16mm/10cm或26mm/10cm或35mm/32cm；洗脫緩沖液A液為50mmol/L PBS，pH5.8～7.8；洗脫緩沖液B液洗脫緩沖液A液+2mol/L NaCl，pH5.8～7.8；上樣量不超過柱的容量；上樣速度1～4mL/min，洗脫速度6～10ml/min。
9.權利要求4所述的提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，熒光素酶保護劑的配制方法取100～1000mg海藻糖、50～1000mg PEG6000及10～200mg BSA，溶解于10mL無菌餾水中，進行無菌過濾除菌即可。
全文摘要
本發明涉及一種規模化提取和純化天然螢火蟲熒光素酶的方法，屬生物技術領域。本發明在低溫條件下取天然螢火蟲蟲尾，通過添加酶提取液研磨、離心和硫酸銨沉淀得到粗酶制劑；再通過復溶、透析、超濾、離心和陽離子交換法，可以去除99％的本底，提高熒光素酶的發光比活力50倍以上；進一步經一次分子排阻層析、親和層析和二次分子排阻層析，即可得到高純度的熒光素酶，其活力和本底之比可提高到5690倍。本發明解決了一般純化方法很難達到在去除本底的同時又保持螢光素酶活力的缺陷，提供了一種從天然螢火蟲中制備高活力低成本的熒光素酶的方法，適用于規模化生產高活力熒光素酶。
文檔編號C12N9/02GK1982442SQ20061003438
公開日2007年6月20日 申請日期2006年3月17日 優先權日2006年3月17日
發明者吳慧清, 吳清平, 張菊梅, 李程思 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環凱微生物科技有限公司