一種淡水養殖魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒及檢測方法

專利名稱：一種淡水養殖魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本技術屬于生物技術應用領域，具體涉及一種淡水養殖魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
1.淡水養殖中毒物的來源淡水水體富營養化導致有害藍藻水華頻頻發生，并可能產生嚴重危害國民身體健康的藍藻毒素。其中銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa水華是世界各國淡水湖泊、池塘中分布廣、持續時間長的一種可能產毒的藻類水華，其產生的毒素稱為微囊藻毒素(microcystin，MC)。微囊藻毒素的主體結構為環七肽，共有60多種異構體，毒性較大的是LR、YR、RR型，L、Y、R分別代表亮氨酸、酪氨酸、精氨酸。這些毒素具有相似的生物學功能，會造成肝細胞的損傷，嚴重者還會引起肝內出血，致使動物死亡，其中微囊藻毒素-LR是一種環狀七肽肝毒素，最常見且毒性高。由于微囊藻毒素通過簡單擴散的跨膜滲透能力很低，必須通過中間載體即肝細胞膜上的膽汁酸轉運系統轉運至肝實質細胞，所以肝臟成為藻毒素的致毒靶器官。該毒素在肝臟特異聚積，并抑制蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性，導致細胞內多種蛋白質的過磷酸化，打破細胞內蛋白磷酸化/脫磷酸化的平衡，并通過細胞信號系統進一步放大這種生化效應，造成細胞內一系列生理生化反應的紊亂，最終導致肝細胞損傷，甚至發生急性死亡事件。微囊藻毒素的促腫瘤作用也是通過這種方式實現的。長期飲用或食用含微囊藻毒素的水或水產品可能引發肝癌，特別是在存在肝炎病毒與黃曲霉毒素的情況下，這種引發肝癌的可能性更高。因此，解決水體微囊藻毒素的污染對我國國民身體健康尤為重要。
微囊藻毒素主要通過以下幾個途徑在水生生物體內積聚(1)生物體通過體表接觸藻毒素，如水生植物及魚卵；(2)生物體直接飲用藻毒素污染的水或以藍藻水華為食料，這種途徑也被稱為生物濃縮(bioconcentration)，如浮游動物、貝類及某些藻食性魚類；(3)生物體位于食物鏈的上游，以浮游動物、貝類及某些藻食性魚類等一級消費者為食，這些水生生物通過食物鏈積累藻毒素，這種途徑也被稱為生物放大(biomagnification)，如某些肉食性魚類等。當水生生物從環境中通過各種途徑吸收毒素時，毒素在生物體體內的積累就隨之而發生。研究表明，不同水生生物對微囊藻毒素的聚集能力及凈化所需時間不同。水生植物是水生生態系統中的初級生產者，直接與環境中的微囊藻毒素接觸，不同水生植物對藻毒素的聚集能力有所差異，與其表面積以及對毒素的吸收能力有關。另外，毒素吸收后在水生植物體內清除所需的時間也不盡相同。有些藻類，例如細長聚球藻具有較強凈化毒素的能力，毒素處理一天后，培養基中的藻毒素含量只有初始濃度的21.7％；處理6天后，培養基中的毒素僅剩8.18％。但總體上，與水生動物相比，水生植物對毒素的聚集較少，凈化也較慢。
貝類及螯蝦等有殼類無脊椎動物對藻毒素的清除較魚類等脊椎動物緩慢，有富集毒素的作用。與貝類相比，魚類對微囊藻毒素的積聚量較低且清除速度較快。實驗條件下用微囊藻填喂虹鱒(Oncorhynchus mykiss)，一小時后毒素在其肝臟內迅速聚集，并且在隨后的24小時內大部分被排出體外。由于淡水魚類具備快速吸收并清除微囊藻毒素的能力，說明其體內存在發達的微囊藻毒素去毒系統，目前觀點認為淡水魚類肝臟sGST，即淡水魚類微囊藻毒素去毒酶在此去毒過程中起關鍵作用，但有關淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的研究至今鮮見報道。
另外，由于相關農藥的使用，使農藥等毒物在淡水養殖魚體內積聚。長期食用含有這些藥物的水產品可致畸、致癌，對人類健康造成嚴重威脅。各類毒素對人類健康所造成的威脅己引起世界各國公共衛生系統的廣泛關注，長期食用含毒素的水產品可引發肝癌等多種疾病。研究發現，羅非魚、鰱、鳙等池塘主養淡水魚對微囊藻等藍藻均有很強攝食作用，加上不同的污染源，所以應盡快對羅非魚等淡水水產品中毒物含量進行安全檢測。
2.去毒酶基因——谷胱甘肽S-轉移酶基因谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST，EC2.5.1.18)普遍存在于各種生物體內，是一組由多個基因編碼的、代謝多種內源或外源毒性物質之解毒酶系統的重要組成部分，屬于II相代謝酶系。該酶有胞液和膜結合兩種形式，以胞液GST(sGST)為主。脊椎動物各組織中均含有不同種類的sGST，其含量和活性亦各不相同，其中以肝臟中含量最高。sGST以同或異二聚體形式存在，主要催化多種化學物質包括藥物、化療劑、致癌物以及氧化應激產生的各種毒性代謝物等，與還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的巰基(-SH)結合，使這些親電子的疏水化合物變成親水性的物質，易于從膽汁或尿液中排泄。某些sGST還具有過氧化物酶和異構酶的活性，能清除脂類自由基及抗脂質過氧化的作用，從而減輕DNA的損傷程度。因此，sGST在機體有毒化合物的代謝、保護細胞免受急性毒性化學物質攻擊以及抑制細胞癌變中起重要作用。
淡水魚類sGST基因在天然狀態下主要用于微囊藻毒素等天然毒物的去毒，而在養殖污染狀態下，則主要用于農藥等人造毒物的去毒。sGST基因控制所有毒物在前期(第1時相)之氧化、水解去毒過程后(第2時相)所共有的加合排毒過程，也因此被稱為第2時相去毒酶。由于在微囊藻毒素去毒代謝過程中，第2時相的加合排毒過程具有獨一無二的關鍵作用，因此淡水魚類sGST基因又被稱為微囊藻毒素去毒酶基因。
根據基因結構、氨基酸序列、底物特異性、化學親和力及動力學行為等不同標準，哺乳動物sGST可分為8類a(alpha)、μ(mu)、P(pi)、s(sigma)、θ(theta)、ω(omega)、κ(kappa)和ζ(zeta)。在同一類中，不同sGST的氨基酸序列同源性至少達到40％，而不同類的sGST之間，氨基酸序列同源性不到30％。各類sGST按序列相似性和免疫交叉反應分為不同的亞類，不同亞類的表達水平具有組織特異性。sGST對GSH的結合有很高的特異性，但對第二個親電子底物的特異性在不同類之間及同一類中差別顯著。a、μ、p和θ類sGST基因在其大小、內含子/外顯子結構上明顯不同，研究表明θ類同工酶谷胱甘肽結合中心的氨基酸不同于a、μ、p和s類。此外，θ類酶的進化先于其他酶類。同類基因有成簇的趨向，如人類sGST基因存在型特異性簇。到目前為止，4種sGST基因，即GSTM1、GSTM3、GSTP1和GSTT1已證實具有多態性。基因的多態性可引起sGST酶活性的改變，并導致個體間對潛在致癌物代謝能力的差異。
3.水產品中毒物殘留檢測分析方法殘留檢測分析方法首先是將有害物質從水產品中提取、分離出來，然后利用儀器設備進行定性和定量分析。目前水產品中毒物殘留檢測分析方法主要有液相色譜法和免疫法等。
高效液相色譜法(HPLC)是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法，此法重復性好、速度快，可使許多極難分離的待測物得以分析，目前大多數水產品藥物殘留分析都采用HPLC法。但HPLC法檢出限較高，為5～10μg/kg，不能達到國際上對水產品殘留要求的最低限量，如水產品中氯霉素的含量，歐盟要求小于0.1μg/kg。此外，因動物體內成分復雜，一些雜質干擾測定，應用HPLC法檢測時，對于樣品預處理必須仔細謹慎，以提高測定準確性和靈敏度。
免疫分析技術免疫分析法是近幾年發展起來以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的新型分析技術。免疫反應具有很高的選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術無論作為獸藥殘留分析的檢測手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。作為相對獨立的檢測方法，即基于競爭結合分析原理的免疫測定法，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、固相免疫傳感器等。目前使用最普遍的是酶聯免疫法(ELISA)，具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優點，是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。目前幾乎所有重要的水產品藥物殘留都已建立或試圖建立ELISA檢測法，如氯霉素、四環素、鏈霉素、己烯雌酚等。酶聯免疫法的缺點在于影響因素較多，易出現假陽性結果。
綜上所述，由于違禁漁藥種類繁多，每一種漁藥均要用專門方法進行檢測，檢測所有漁藥費用十分昂貴，而淡水魚一般價格不高，故一般只能進行部分漁藥的常規檢測。雖然國家每年也花費巨資使用化學手段對部分漁藥進行常規檢測，但往往由于漏檢某種漁藥而產生嚴重后果。2005年7月我國出口日本的鰻魚由于孔雀石綠不屬于常規檢測項目而漏檢，導致鰻魚出口與內銷停產，不僅對鰻魚產業造成毀滅性打擊，而且波及整個淡水魚養殖業，以至于出現一時香港居民不敢食用中國大陸淡水養殖魚的恐慌現象。因此，提供一種能夠簡便、準確的對養殖魚類體內毒物含量進行定性定量的檢測方法對我國淡水魚類養殖事業的發展和監督是十分必要的。

發明內容
本發明的目的在于克服現有我國淡水魚類體內毒物含量檢測技術上存在的缺陷，提供一種能夠快速、準確地對多種魚類不同品系、組織內的毒物含量進行定性、定量檢測的試劑盒。
本發明的另一目的是提供利用上述試劑盒檢測魚類體內毒物含量的方法。
本發明通過測定魚體去毒酶基因表達狀態來確定魚體內是否含有微囊藻毒素等毒物及其食用安全問題。本發明不必采用不同藥物專門檢測方法盲目抽檢是否含有某種藥物，而是基于不同毒物最終均將導致魚體肝臟去毒酶一可溶性谷胱甘肽-S-轉移酶(sGST)基因表達，通過固定方法檢測sGST基因表達水平這一個指標即可反映生物體受不同毒物的污染情況，并由此簡便而可靠地確定淡水養殖魚食用安全問題。本發明雖然不能確定污染毒物等的具體種類，但絕對能保證受檢合格魚不處于被污染狀態并可安全食用。如有必要，對于受檢不合格魚則可有目的地采用常規化學手段，對可能的毒物進一步逐個檢測以確定污染毒物的種類。
本發明所說的魚類是淡水魚類，優選的是羅非魚、鰱魚、鳙魚、鱖魚、草魚、鯽魚、鯪魚等池塘主養的淡水魚類。并且首次公開了鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthys nobilis)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、鯪魚(Cirrhina molitorella)、鯽魚(Carassius auratu)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、鱖魚(Siniperca chuatsi)等淡水魚類肝臟去毒酶——可溶性谷胱甘肽-S-轉移酶(sGST)基因的cDNA序列及5’側翼調控序列，并以此設計了本發明所述試劑盒中的檢測引物。
以下對本發明公開的技術進行進一步的說明1.對鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚等池塘主養的淡水魚類去毒酶基因的克隆。
克隆魚類去毒酶基因是通常使用的功能基因克隆方法首先，根據已知的脊椎動物某一特定基因的氨基酸序列的保守區域設計簡并引物，利用RT-PCR技術獲得該基因的核心片斷，將該片斷分離純化后與T載體連接，轉化大腸桿菌，挑取白色菌落，經PCR反應鑒定得到陽性克隆，送陽性克隆的菌液去測序，從而獲得目的基因的cDNA核心片斷的序列；其次利用3’-RACE和5’-RACE技術擴增cDNA的3’末端和5’末端，將cDNA核心片斷、3’末端和5’末端進行序列拼接，從而獲得全長cDNA序列；最后通過基因組PCR獲得內含子DNA序列，通過基因組步移技術進一步克隆該基因的5’側翼序列(含啟動子及其它順式調控元件)和3’側翼序列，從而獲得該基因的基因組DNA全序列。
如上所說的功能基因克隆方法，涉及的常規分子克隆技術包括DNA、RNA的提取，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA片段的連接，限制性內切酶反應均參考文獻《分子克隆實驗手冊》(Msniatis等，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，美國，1989)。DNA聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄PCR反應和巢式PCR反應均參考文獻《PCR技術實驗指南》(Carl W.Dieffenbach等，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，美國，1995)。DNA測序、DNA擴增和反轉錄PCR所需要的寡聚核苷酸引物如oligo(dT)18等可以交由專門的機構合成。本發明所用的大腸桿菌為JM109購自美國GIBCO公司，pMD 18-T載體購自日本TaKaRa公司。另外，質粒DNA的提取和純化、DNA片段的回收、RNA的提取和純化等也可以采用專門機構生產的試劑盒并參照提供的操作程序進行操作。
在本發明給出的實施例中，首先分別從鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚分離肝臟組織，進行總RNA的提取與純化；再分別以鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚肝臟總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉錄引物，合成cDNA第一鏈。
根據已知脊椎動物sGST氨基酸序列的保守區域設計簡并引物，克隆得到的鰱魚、鳙魚、羅非魚sGST cDNA核心片斷，再設計5’RACE反轉錄引物。5’RACE的原理見附圖1，操作方法如下首先以反轉錄引物合成cDNA模板，接著用RNA酶進行消化以產生單鏈cDNA，再以T4連接酶進行連接產生PCR模板。分別以嵌套PCR引物進行兩輪PCR反應。
3’RACE的原理見附圖2，操作方法如下以目的mRNA為模板，使用OligodT-3’接頭引物(3sites Adaptor Primer)進行反轉錄反應，合成cDNA模板。使用含有酶切位點如附圖所示的KpnI、XbaI、BamH I的上游特異性引物和3’接頭引物進行PCR反應。選用適當載體克隆PCR產物并進行DNA測序。
PCR產物經2％瓊脂糖電泳，純化回收后克隆至pMD 18-T載體，轉化感受態E.coli JM109，利用M13正反向引物，通過PCR反應檢測得到陽性克隆，陽性克隆由專門公司進行測序。用DNA分析軟件vector NTI suite 6.0進行序列分析。
2.以β-肌動蛋白為外參照，對去毒酶基因mRNA相對水平進行檢測。
本技術在率先成功克隆羅非魚、鰱魚、鳙魚、鱖魚、草魚、鯽魚、鯪魚等淡水魚類肝臟微囊藻毒素去毒酶基因cDNA新序列工作的基礎上，進一步在池塘養殖生產條件下，以淡水魚類的β-肌動蛋白為外參照，用RT-PCR方法比較不同品種、品系池塘養殖羅非魚肝臟與肌肉sGST去毒酶基因的mRNA相對水平。
檢測方法包括小心分離出檢測魚的肝臟，肌肉組織從背部取材，迅速稱重后用于提取總RNA。總RNA提取和cDNA合成同前所述。sGST和β-肌動蛋白的PCR反應體系和反應條件相同，其PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像系統及相關軟件(AlphaImaget，Alpha Inotech，USA)進行分析，結果以sGST與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
采用統計分析軟件SPSS 10.0對不同種魚類肝臟sGSTmRNA相對表達水平平均值差異進行統計分析。若P＜0.05，平均值的差異即認為是顯著的。
3.養殖魚類終點檢測試劑盒的制備本檢測試劑盒是依據如下的檢測技術制備而成淡水養殖魚類體內所含毒物含量高，則sGST mRNA的相對表達水平就高，所以以淡水魚類的β-肌動蛋白mRNA的表達作為外參照，對sGST mRNA的表達水平進行檢測，與對照進行比較，就可以知道魚類體內所含毒物是否符合標準。
根據如上所述的檢測技術，檢測步驟包括(1)提取與純化淡水養殖魚類的肝臟總RNA，以oligo(dT)18作為反轉錄引物，采用反轉錄方法合成cDNA；(2)以(1)合成的cDNA為模板，取與該模板相應魚種的sGST去毒酶基因表達檢測引物、DNA多聚酶、PCR反應緩沖液、dNTP、滅菌蒸餾水等適量混合，進行PCR反應，反應條件為首先94℃預變性3～6min，然后94℃ 30sec～1min，55～65℃ 30sec～1min，72℃ 30sec～1min，共25～32個循環，最后72℃延伸5～10min；(3)以(1)合成的cDNA為模板，β-肌動蛋白mRNA表達檢測引物、DNA多聚酶、PCR反應緩沖液，dNTP，滅菌蒸餾水，混合，進行PCR反應，反應體系和反應條件同(2)；(4)PCR反應完成后，取等量的(2)和(3)的PCR產物經1～2％含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，對產物亮度進行檢測比對，確定sGST去毒酶基因的基因表達情況。
根據如上所述的檢測步驟，檢測試劑盒應當含有如下組分用于PCR擴增反應時采用的DNA多聚酶如常用的rTaq，與該酶配套使用的含有Mg2+的反應緩沖液(PCR Buffer)，以及dNTP緩沖液(2.5mM)，關鍵的是用于檢測淡水魚類sGSTmRNA的相對表達水平的上下游檢測引物；另外，還需要淡水魚類的β-肌動蛋白mRNA表達檢測的上下游引物作為檢測時的外參照，以及用于Control cDNA淡水魚類的sGST cDNA作為陽性對照品。
這里所說的淡水養殖魚類sGST mRNA的相對表達水平檢測引物，是指鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鱖魚、草魚、鯽魚的檢測引物，根據不同的需要，可以是這幾種魚類的任一種、或任兩種、或任兩種以上隨機組合、甚至包含這些魚類的全部檢測引物；另外，這些引物都是根據本發明所公開的這些魚類sGST的cDNA序列所設計的，共7種cDNA，其cDNA序列分別如SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13所示。
另外，由于鰱魚、鳙魚、草魚的sGST的cDNA序列較高的同源性，因此，這三種魚類的sGST檢測引物可以根據cDNA序列的同源區設計通用引物。鰱魚、鳙魚、草魚、鱖魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚的sGST的cDNA序列同源性比較見附圖3。通用引物的設計和應用詳見具體實施例。
另外，本發明公開的檢測試劑盒中所選用的用于PCR擴增反應的DNA多聚酶，可以是任一公司的DNA多聚酶，PCR反應緩沖液為該任一公司與該酶配套的反應緩沖液。目前常用的DNA多聚酶有許多種如rTaq、Pfu、Taq Plus、HotStartTaq、Taq Platinum或Pyrobest等，在本發明的具體實施例中，選用的是rTaq。
另外，本發明公開的檢測試劑盒中所用的用于PCR擴增反應的dNTP溶液，可以是任一公司的dNTP溶液，含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種組分，在本發明給出的具體實施例中，dNTP溶液的濃度為2.5mM。
另外，本試劑盒提供的淡水養殖魚類的β-肌動蛋白mRNA表達檢測的上下游引物作為檢測時的外參照，主要是為了用于從魚類肝細胞提取的靶RNA的定量，以避免模板的定量誤差，加樣誤差以及各反應體系中的擴增效率不均一，各孔間的溫度差等造成的誤差，還可以檢測模板的完整性，尤其在RT-PCR中，還可以檢測模板是否陰性表達等。由于淡水魚類的β-肌動蛋白具有較高的保守性，所以本發明所提供的β-肌動蛋白mRNA檢測引物可以是不同魚類特異的，也可以是多種魚類通用的。在本發明所提供的具體實施例中，鰱魚、鱖魚、羅非魚、鯪魚為通用的β-肌動蛋白檢測引物。
另外，本發明所提供的檢測試劑盒還提供了淡水魚類的sGST cDNA作為陽性對照模板。取該模板和相應的檢測引物，在一定的PCR反應體系下，可以擴增出相應的陽性PCR產物，與待測樣品的RT-PCR擴增產物一起進行瓊脂糖凝膠電泳，可以通過比較陽性PCR產物的位置，快速找到目的條帶的位置，達到定性的目的。
另外，本發明所提供的檢測試劑盒還可以包含用于cDNA合成的oligo(dT)18通用引物和反轉錄酶、反應緩沖液。其反轉錄酶為目前可以采用的任一公司的反轉錄酶，反應緩沖液為該任一公司與反轉錄酶配套的反應緩沖液，oligo(dT)18通用引物可以交由相關專業公司進行合成。目前常用的反轉錄酶有來源于禽成髓細胞瘤病毒提取物的AMV如Takara和Promega等公司生產的AMV和來源于鼠白血病病毒的Mo-MLV如Stratagene公司的Stratascript，Life Technologies公司的Suprscript和Suprscript II、invitrogen公司的SuperScriptIII以及Promega的MLV系列。
采用本發明所公開的試劑盒，建議的反應體系為

PCR擴增反應條件94℃預變性3～6min，然后94℃ 30sec～1min，55～65℃ 30sec～1min，72℃ 30sec～1min，共25～32個循環，最后72℃延伸5～10min；PCR產物經在1～2％瓊脂糖凝膠上電泳(方法與試驗二相同)后用凝膠成像系統及相關軟件進行分析，結果以待測基因與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明通過測定魚體去毒酶基因表達水平來確定魚體內是否含有微囊藻毒素等毒物及其食用安全問題。本發明不必采用不同藥物專門檢測方法盲目抽檢是否含有某種藥物，而是基于不同毒物最終均將導致魚體肝臟去毒酶——可溶性谷胱甘肽-S-轉移酶(sGST)基因表達，通過固定方法檢測sGST基因表達水平，從而對淡水養殖魚類體內的毒素含量進行定性定量，為淡水養殖魚食用安全提供安全、簡便、可靠的指標。本發明雖然不能確定污染毒物等的具體種類，但絕對能保證受檢合格的魚不處于被污染狀態并可安全食用。如有必要，對于受檢不合格魚則可有目的地采用常規化學手段，對可能的毒物進一步逐個檢測以確定污染毒物的種類。


圖1為5’-RACE法原理示意圖；圖2為3’-RACE法原理示意圖；
圖3為淡水魚類sGST氨基酸同源性比較圖；圖4為不同魚類sGST的表達情況；圖5不同魚類sGST(a)和β-肌動蛋白(b)mRNA表達的RT-PCR分析M，marker；1，鰱魚；2，鳙魚；3，草魚；4，鯽魚；5，鯪魚；6，羅非魚；圖6羅非魚分別進行腹腔注射PBS、LPS、MC-LR、MC-LR+LPS，24h后肝臟組織特異性表達GST(谷光甘肽-S-轉移酶)與beta-actin表達量百分比；PBS、LPS、MC-LR+LPS處理組均與MC-LR處理組有顯著性差異；但PBS、LPS、MC-LR+LPS處理組之間無顯著差異；圖7羅非魚不同毒素處理sGST(A)和β-肌動蛋白(B)mRNA表達的RT-PCR分析M，marker；1，對照組；2，腹腔注射LPS；3，腹腔注射MC-LR；4，腹腔注射MC-LR+LPS。
具體實施例方式
實施例1 鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚等肝臟微囊藻毒素去毒酶基因cDNA新序列的成功克隆鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚于博羅縣顯崗水庫及其附近水域捕得，鱖魚于廣州市石牌市場購得。
(1)總RNA提取和cDNA第一鏈的合成分別從鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚分離肝臟組織，總RNA的提取與純化按Promega公司的SV Total RNA Isolation System試劑盒推薦方法進行。cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa公司的RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1試劑盒，分別以鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚肝臟總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉錄引物，操作按試劑盒推薦方法進行。
(2)鰱魚、鳙魚等淡水養殖魚類微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心片斷的克隆根據已知脊椎動物sGST氨基酸序列的保守區域設計3個簡并引物，sGST01F、sGST02F、sGST03R，引物序列見表1。sGST01F和sGST03R用于克隆鰱魚、鯽魚sGST cDNA核心片段；sGST02F和sGST03R用于克隆鳙魚、草魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚sGST cDNA核心片段。PCR擴增條件均為94℃預變性3min，94℃ 1min，40℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環，最后72℃延伸5min。
(3)鰱魚、鳙魚、羅非魚等的去毒酶基因5’端cDNA擴增根據克隆得到的鰱魚、鳙魚、羅非魚sGST cDNA核心片斷，設計5’RACE反轉錄引物SCRT(鰱魚)、BCRT(鳙魚)、TRT(羅非魚)和嵌套PCR引物SCS1/SCA1和SCS2/SCA2(鰱魚)、BCS1/BCA1和BCS2/BCA2(鳙魚)、TS1/TA1和TS2/TA2(羅非魚)，引物序列見表1。
5’RACE的操作按試劑盒推薦方法進行。首先以反轉錄引物(SCRT、BCRT、TRT或TSRT)合成cDNA模板，接著用RNA酶進行消化以產生單鏈cDNA，再以T4連接酶進行連接產生PCR模板。分別以嵌套PCR引物SCS1/SCA1(鰱魚)、BCS1/BCA1(鳙魚)、TS1/TA1(羅非魚)與SCS2/SCA2(鰱魚)、BCS2/BCA2(鳙魚)、TS2/TA2(羅非魚)為引物進行兩輪PCR反應。首輪PCR反應條件為94℃預變性3min，隨之94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，25個循環，最后72℃延伸5min；第二輪PCR反應條件為94℃預變性3min，隨之94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30個循環，最后72℃延伸5min。
(4)鰱魚、鳙魚、羅非魚等的去毒酶基因3’端cDNA擴增3’RACE的操作參照試劑盒推薦方法。首先以試劑盒提供的oligodT-3sites Adaptor primer為引物進行反轉錄反應，然后以試劑盒提供的3sitesAdaptor primer和5’RACE的SCS2(鰱魚)、BCS2(鳙魚)、TS2(羅非魚)(表1)為引物進行首次PCR反應。PCR反應條件與5’RACE首輪PCR相同，但循環次數為30次。巢式PCR所用引物為3sites Adaptor primer與SCS3(鰱魚)、BCS3(鳙魚)、TS3(羅非魚)，引物序列見表1，PCR反應條件與5’RACE第二輪PCR相同。
(5)PCR產物的克隆及序列分析PCR產物經2％瓊脂糖電泳純化，H.Q.& Q.Gel Extraction Kit II(U-gene)回收后克隆至pMD 18-T載體(TaKaRa)，轉化感受態E.coli JM109，利用M13正反向引物，通過PCR反應檢測得到陽性克隆，陽性克隆由博亞公司進行測序。用DNA分析軟件vector NTI suite 6.0進行序列分析。
獲得的鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGST序列請見序列表；鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的序列同源性比對請見說明書附圖3。
表1鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚sGST基因簡并引物及鰱魚、鳙魚羅非魚5’、3’RACE PCR引物


實施例2 淡水魚類食用安全的終點檢測試劑盒的制備(1)、試劑盒組成rTaq(5U/μl)10×PCR Buffer(Mg2+plus)dNTP(2.5mM)Control cDNA(鰱魚、鳙魚、草魚、鱖魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚共7種cDNA)引物(各種淡水魚引物共12個)GST01F5’-GACCTTAAAGAACGGGC-3’GST02R5’-GGAACTTGCTGATTCTTGG-3’GST03F5’-AAGGCCTCAAAGACCGTG-3’GST04R5’-CAGGAACCTGTTGATGGC-3’GST05F5’-AGGATCCCAAAGAACGAG-3’GST06R5’-CAGAAACCTGCTGATGGC-3’GST07F5’-AAGAAAGGGCTCTGATTG-3’GST08R5’-GCTGGAGGAACTTGCTGA-3’GST09R5’-GAAACTTGCTGATTGTTGG-3’ACT01F5’-CGTGACATCAAGGAGAAGC-3’
ACT02R5’-TCTGCTGGAAGGTGGACAG-3’ACT03R5’-TCTGCTGGAAGATAGACAG-3’其中GST01F與GST02R為鰱魚、鳙魚、草魚的sGST基因通用引物，擴增出的片段大小為334bp；GST03F與GST04R為鱖魚的sGST引物，擴增出的片段大小為332bp；GST05F與GST06R為羅非魚的sGST引物，擴增出的片段大小為332bp；GST07F與GST08R為鯪魚的sGST引物，擴增出的片段大小為333bp；GST01F與GST09R為鯽魚的sGST引物，擴增出的片段大小為334bp；ACT01F與ACT02R為鰱魚、鱖魚、羅非魚、鯪魚的通用β-肌動蛋白引物，擴增出的片段大小為436bp；ACT01F與ACT03R為鯽魚引物的β-肌動蛋白引物，擴增出的片段大小為436bp。
(2)試劑盒操作說明建議的PCR反應體系為表2所示表2

建議的PCR擴增反應條件
94℃預變性3min然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共進行30個循環反應；循環結束后72℃再延伸5min。
PCR產物經在2％瓊脂糖凝膠上電泳后用凝膠成像系統及配套軟件(AlphaImaget，Alpha Inotech，USA)進行分析，結果以待測基因與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
實施例3 檢測試劑盒在淡水魚類肝臟去毒酶基因mRNA表達水平測定方面的應用鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚肝臟組織的總RNA提取和cDNA合成同實施例1中所述。取實施例2所述試劑盒，用特異引物GST01F與GST02R擴增鰱魚、鳙魚、草魚sGST cDNA片段(334bp)；GST01F與GST09R擴增鯽魚sGST cDNA片段(334bp)；GST07F與GST08R擴增鯪魚sGST cDNA片段(333bp)；GST05F與GST06R擴增羅非魚sGST cDNA片段(333bp)。用特異引物ACT01F和ACT02R擴增鰱魚、鳙魚、草魚、鯪魚、羅非魚β-肌動蛋白cDNA片段(436bp)；用ACT01F和ACT03R擴增鯽魚β-肌動蛋白cDNA片段(436bp)。
PCR反應條件為94℃預變性3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環，最后72℃延伸5min。指數增長期內終止反應。PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像系統及相關軟件(AlphaImaget，Alpha Inotech，USA)進行分析，結果以sGST與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
采用統計分析軟件SPSS 10.0對不同種魚類肝臟sGST mRNA相對表達水平平均值差異進行統計分析。若P＜0.05，平均值的差異即認為是顯著的。
相關結果請見說明書附圖4和5。
實施例4 檢測試劑盒在羅非魚染毒試驗中的應用實驗室中馴養3周以上喂食經濟魚食而進行人工排毒的的羅非魚，20尾隨機分成4組，每組5尾，用于染毒試驗。經人工飼養排毒后的羅非魚染毒方式采用腹腔注射，磷酸緩沖液PBS為溶劑，將MCLR純化產物稀釋到相應的濃度。對照組注射磷酸緩沖液PBS，實驗組1注射MC-LR，實驗組2注射LPS，實驗組3注射MC-LR+LPS，毒素均經腹鰭下方注入腹腔。24h后冰凍麻醉，分離肝臟組織。總RNA提取和cDNA第一鏈的合成方法如實施例1中所述。
取實施例2中所述的檢測試劑盒，用GST05F-GST06R sGST基因特異引物擴增一個332bp的sGST cDNA片段。用ACT01F-ACT02R引物擴增一個436bp的β2肌動蛋白cDNA片段。
PCR反應條件為94℃預變性3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環，最后72℃延伸5min。指數增長期內終止反應。PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后用凝膠成像系統及相關軟件(AlphaImaget，Alpha Inotech，USA)進行分析，結果以sGST與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比(％)表示。
采用統計分析軟件SPSS 1.0。對羅非魚肝臟sGST基因誘導前后mRNA相對表達水平平均值差異進行統計分析。若P＜0.05，平均值的差異即認為是顯著的。
羅非魚分別進行腹腔注射PBS(磷酸緩沖液)、LPS(脂多糖)、MC-LR(微囊藻毒素的LR型)、MC-LR+LPS，24h后肝臟組織特異性表達GST(谷光甘肽-S-轉移酶)與β-肌動蛋白表達量百分比的結果顯示PBS、LPS、MC-LR+LPS處理組均與MC-LR處理組有顯著性差異。對羅非魚sGST基因的表達水平進行比較(圖-11，12)，發現羅非魚sGST基因的表達水平在不同處理前后發生改變，其中sGST在毒素誘導后其表達量有明顯提高(P＜0.05)，羅非魚腹腔注射MC-LR 24h后，肝臟組織特異性表達sGST量比未處理對照組sGST表達水平約升高一倍。證明毒素誘導可增加sGST表達。
相關結果請見說明書附圖6和7。
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25SEQUENCE LISTING<110>暨南大學<120>一種淡水養殖魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒及檢測方法<130>鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>920<212>DNA<213>Hypophthalmichthys molitrix(鰱魚)<220>
<221>CDS<222>(75)..(746)<400>1acacacattg catttctgca cacactgtct gctgcacagc aaagagtttt gaagtgtcgc 60attattttgt gaaa atg tcc ggg aaa gtt gtg ttg cat tac ttc aat gga 110Met Ser Gly Lys Val Val Leu His Tyr Phe Asn Gly1 5 10aga ggg aag atg gag tcg atc cga tgg ctg ttg gcc gca gct gga gtc 158Arg Gly Lys Met Glu Ser Ile Arg Trp Leu Leu Ala Ala Ala Gly Val15 20 25gag ttt gag gag gtg ttt ctg acc aaa agg gag cat tat gat aaa ctg 206Glu Phe Glu Glu Val Phe Leu Thr Lys Arg Glu His Tyr Asp Lys Leu30 35 40ctg aat gat gga gcc ctg atg ttt cag cag gtg cct ttg gtt gaa ata 254Leu Asn Asp Gly Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro Leu Val Glu Ile45 50 55 60gat ggg atg cag ctt gtg cag tca agg gct atc ttg aat tac atc gct 302Asp Gly Met Gln Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Leu Asn Tyr Ile Ala65 70 75gga aaa tac aat ctc tat gga aaa gac ctt aaa gaa cgg gct ttg att 350Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Ile80 85 90gac atg tat aca gag ggt acc att gat ata atg gat ctt atc atg cat 398Asp Met Tyr Thr Glu Gly Thr Ile Asp Ile Met Asp Leu Ile Met His95 100 105ttt cct gtt gag cca cct gag acc aag cag aaa cag ctc ggt aat att 446Phe Pro Val Glu Pro Pro Glu Thr Lys Gln Lys Gln Leu Gly Asn Ile110 115 120gag caa aag gca aaa gag cgc ttc ctg cct gtg ttt gaa aag gct ctt 494Glu Gln Lys Ala Lys Glu Arg Phe Leu Pro Val Phe Glu Lys Ala Leu125 130 135 140gca aac tct caa ttc ctg gtg gga aac cag ttg agc cgc gct gat gtt 542Ala Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser Arg Ala Asp Val145 150 155cac ctt ctg gaa gtc act ctg atg ctg cag gag tta ctc cct aca ata 590His Leu Leu Glu Val Thr Leu Met Leu Gln Glu Leu Leu Pro Thr Ile160 165 170ctg tca acc ttt ccc aaa atc cag gcg ttc cag gaa aga atg aag gcc 638Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe Gln Glu Arg Met Lys Ala175 180 185tta cca aga atc agc aag ttc ctg cag ccc ggc agt gca aga aaa cct 686Leu Pro Arg Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro Gly Ser Ala Arg Lys Pro190 195 200cct cct gat gag gag gtg atg aaa acc gtg aag gag gtg ttg agc cac 734Pro Pro Asp Glu Glu Val Met Lys Thr Val Lys Glu Val Leu Ser His205 210 215 220ctc ttt aag tag aagaaccatg gaaaaccagt tcttcagaac attttaatga 786Leu Phe Lystgctaatcac taattgattt agaagctttc ttattaaaac taaaacagat ttatttggaa846tgtaaaagat acagtttgga taaagtgata atattgtgat atgaaaaaaa aaaaaaaaaa906aaaaaaaaaa aaaa 920<210>2<211>223<212>PRT<213>Hypophthalmichthys molitrix(鰱魚)<400>2Met Ser Gly Lys Val Val Leu His Tyr Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met1 5 10 15Glu Ser Ile Arg Trp Leu Leu Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Glu Glu
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST2520 25 30Val Phe Leu Thr Lys Arg Glu His Tyr Asp Lys Leu Leu Asn Asp Gly35 40 45Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro Leu Val Glu Ile Asp Gly Met Gln50 55 60Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn65 70 75 80Leu Tyr Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Thr85 90 95Glu Gly Thr Ile Asp Ile Met Asp Leu Ile Met His Phe Pro Val Glu100 105 110Pro Pro Glu Thr Lys Gln Lys Gln Leu Gly Asn Ile Glu Gln Lys Ala115 120 125Lys Glu Arg Phe Leu Pro Val Phe Glu Lys Ala Leu Ala Asn Ser Gln130 135 140Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu145 150 155 160Val Thr Leu Met Leu Gln Glu Leu Leu Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe165 170 175Pro Lys Ile Gln Ala Phe Gln Glu Arg Met Lys Ala Leu Pro Arg Ile180 185 190Ser Lys Phe Leu Gln Pro Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro Pro Asp Glu195 200 205Glu Val Met Lys Thr Val Lys Glu Val Leu Ser His Leu Phe Lys210 215 220<210>3<211>978<212>DNA<213>Aristichthys nobilis(鳙魚)<220>
<221>CDS<222>(158)..(820)<400>3gcagaaacag ctcggtaata ttgagcaaaa ggcaaaagag cgctggtacc ctctgcacac 60acacacacac actgctgcac agcaaagagt ttcgcttcat tttgagaaca tttattttat120tttttaagtg tcgctttatt ttgtgaaaat gtctggg aaa gtt gtg ttg cat tac 175Lys Val Val Leu His Tyr1 5ttc aat gga aga ggg aaa atg gag tcg gtc cga tgg ctt ttg gcc gca 223Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met Glu Ser Val Arg Trp Leu Leu Ala Ala10 15 20gct gga gtc gag ttt gag gag gtg ttt ctg acc aaa agg gag cat ttt 271Ala Gly Val Glu Phe Glu Glu Val Phe Leu Thr Lys Arg Glu His Phe25 30 35gat aaa ctg ctg aat gat gga gcc ctg atg ttt cag cag gtg cct ttg 319Asp Lys Leu Leu Asn Asp Gly Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro Leu40 45 50gtt gaa ata gat ggg atg cag ctt gtg cag tca agg gct atc ttg aat 367Val Glu Ile Asp Gly Met Gln Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Leu Asn55 60 65 70tac atc gct gga aaa tac aat ctc tat gga aaa gac ctt aaa gaa cgg 415Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu Lys Glu Arg75 80 85gct ttg att gac atg tat gca gag ggt acc agc gat cta atg gat ctc 463Ala Leu Ile Asp Met Tyr Ala Glu Gly Thr Ser Asp Leu Met Asp Leu90 95 100atc ata atg tct gtt ttc gct cca ccc gaa aac aag cag aaa cag ctc 511Ile Ile Met Ser Val Phe Ala Pro Pro Glu Asn Lys Gln Lys Gln Leu105 110 115ggt aat att gag caa aag gca aaa gag cgc ttc ctg cct gtg ttt gaa 559Gly Asn Ile Glu Gln Lys Ala Lys Glu Arg Phe Leu Pro Val Phe Glu120 125 130aag ggt ctt gca aac tct caa ttc ctg gtg gga aac cag ttg agc cgc 607Lys Gly Leu Ala Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser Arg135 140 145 150gct gat gtt cac ctt ctg gag gtc act ctg atg ctg cag gag tta ttc 655Ala Asp Val His Leu Leu Glu Val Thr Leu Met Leu Gln Glu Leu Phe155 160 165cct aca ata ctg tca acc ttt ccc aaa atc cag gcg ttc cag gaa aga 703Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe Gln Glu Arg170 175 180atg aag gcc tta cca aga atc agc aag ttc ctg cag ccc ggc agt gca 751Met Lys Ala Leu Pro Arg Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro Gly Ser Ala
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25185 190 195aga aaa cct cct cct gat gag gtg tac gtg aaa act gtg aag gag gtg 799Arg Lys Pro Pro Pro Asp Glu Val Tyr Val Lys Thr Val Lys Glu Val200 205 210ttg agc cac ctc ttt aag tag aaggaccact taaaaacatt tagatgatgt 850Leu Ser His Leu Phe Lys215 220taatcactaa ttaatttaca agcttcctta ttaaaactga ggcactaaaa tggacagatt910tatttggaat gtacaagata ctgtctggat aaagtaataa tattgtgata tgcaaaaaaa970aaaaaaaa 978<210>4<211>220<212>PRT<213>Aristichthys nobilis(鳙魚)<400>4Lys Val Val Leu His Tyr Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met Glu Ser Val1 5 10 15Arg Trp Leu Leu Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Glu Glu Val Phe Leu20 25 30Thr Lys Arg Glu His Phe Asp Lys Leu Leu Asn Asp Gly Ala Leu Met35 40 45Phe Gln Gln Val Pro Leu Val Glu Ile Asp Gly Met Gln Leu Val Gln50 55 60Ser Arg Ala Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly65 70 75 80Lys Asp Leu Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Ala Glu Gly Thr85 90 95Ser Asp Leu Met Asp Leu Ile Ile Met Ser Val Phe Ala Pro Pro Glu100 105 110Asn Lys Gln Lys Gln Leu Gly Asn Ile Glu Gln Lys Ala Lys Glu Arg115 120 125Phe Leu Pro Val Phe Glu Lys Gly Leu Ala Asn Ser Gln Phe Leu Val130 135 140Gly Asn Gln Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu Val Thr Leu145 150 155 160Met Leu Gln Glu Leu Phe Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile165 170 175Gln Ala Phe Gln Glu Arg Met Lys Ala Leu Pro Arg Ile Ser Lys Phe180 185 190Leu Gln Pro Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro Pro Asp Glu Val Tyr Val195 200 205Lys Thr Val Lys Glu Val Leu Ser His Leu Phe Lys210 215 220<210>5<211>887<212>DNA<213>Oreochromis nilotica(羅非魚)<220>
<221>CDS<222>(25)..(720)<400>5aaaaagaaaa cagcaacaaa agcc atg tct gaa aaa cct gtg ctg tac tat51Met Ser Glu Lys Pro Val Leu Tyr Tyr1 5ttt aat ggg aga ggg aag atg gag tca atc cgc tgg ctt tta act gtt 99Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met Glu Ser Ile Arg Trp Leu Leu Thr Val10 15 20 25gct gaa gtc gag ttt gat gaa gtg ctt ctg aca act cgg gag cag tat 147Ala Glu Val Glu Phe Asp Glu Val Leu Leu Thr Thr Arg Glu Gln Tyr30 35 40gaa aaa ctc ctg aat gat ggg gcg ctc atg ttt caa cag gtc cct ttg 195Glu Lys Leu Leu Asn Asp Gly Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro Leu45 50 55gtg gaa atg gat ggc atg aag ctc att cag aca aaa gca atc ctg aat 243Val Glu Met Asp Gly Met Lys Leu Ile Gln Thr Lys Ala Ile Leu Asn60 65 70tac atc gca gag aaa tac atc ctg aac tac atc gca ggg aag tat aat 291Tyr Ile Ala Glu Lys Tyr Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn75 80 85ctg cat gca aag gat ccc aaa gaa cga gta atg atc aac atg tac tct 339Leu His Ala Lys Asp Pro Lys Glu Arg Val Met Ile Asn Met Tyr Ser
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST2590 95 100 105gag gga ttg aca gac ctc atg gaa atg atc atg ata ctt ccc ttc acc 387Glu Gly Leu Thr Asp Leu Met Glu Met Ile Met Ile Leu Pro Phe Thr110 115 120cca gat ccc aaa ccc aaa ctg gac aac att cag agc aaa gca aag gag 435Pro Asp Pro Lys Pro Lys Leu Asp Asn Ile Gln Ser Lys Ala Lys Glu125 130 135cgc tac ctt cct gtg tat gaa aag gct ctg act gga ccc gtg tac ctg 483Arg Tyr Leu Pro Val Tyr Glu Lys Ala Leu Thr Gly Pro Val Tyr Leu140 145 150gtg gga ggt aaa cta agc ctt gct gat gtg ctg ctt gtt gaa tgc acc 531Val Gly Gly Lys Leu Ser Leu Ala Asp Val Leu Leu Val Glu Cys Thr155 160 165ctg atg ctg gag gag aaa ttt cca gac att ctg aaa gac ttc ccc aat 579Leu Met Leu Glu Glu Lys Phe Pro Asp Ile Leu Lys Asp Phe Pro Asn170 175 180 185atc aag tcc ttt cag ggc agg atg aca caa atc ccc gcc atc agc agg 627Ile Lys Ser Phe Gln Gly Arg Met Thr Gln Ile Pro Ala Ile Ser Arg190 195 200ttt ctg cag ccg ggc agc aag agg aag cca gcg cca gat gaa aaa tac 675Phe Leu Gln Pro Gly Ser Lys Arg Lys Pro Ala Pro Asp Glu Lys Tyr205 210 215ttg aaa aat gtt gtg gaa gtc cta aac ctc aag ttg cca ctt taa 720Leu Lys Asn Val Val Glu Val Leu Asn Leu Lys Leu Pro Leu220 225 230gaaacactac aaaagatctg ttacattcct cattaggcaa cgtgattatg atcagttaca780tctggaggca tacgtgaaga taaacgctgc actaacacaa caacatggaa agaacttctg840taatctgctt taccaataaa cacatttgac acaaaaaaaa aaaaaaa 887<210>6<211>231<212>PRT<213>Oreochromis nilotica(羅非魚)<400>6Met Ser Glu Lys Pro Val Leu Tyr Tyr Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met1 5 10 15Glu Ser Ile Arg Trp Lou Leu Thr Val Ala Glu Val Glu Phe Asp Glu20 25 30Val Leu Leu Thr Thr Arg Glu Gln Tyr Glu Lys Leu Leu Asn Asp Gly35 40 45Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro Leu Val Glu Met Asp Gly Met Lys50 55 60Leu Ile Gln Thr Lys Ala Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Glu Lys Tyr Ile65 70 75 80Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu His Ala Lys Asp Pro Lys85 90 95Glu Arg Val Met Ile Asn Met Tyr Ser Glu Gly Leu Thr Asp Leu Met100 105 110Glu Met Ile Met Ile Leu Pro Phe Thr Pro Asp Pro Lys Pro Lys Leu115 120 125Asp Asn Ile Gln Ser Lys Ala Lys Glu Arg Tyr Leu Pro Val Tyr Glu130 135 140Lys Ala Leu Thr Gly Pro Val Tyr Leu Val Gly Gly Lys Leu Ser Leu145 150 155 160Ala Asp Val Leu Leu Val Glu Cys Thr Leu Met Leu Glu Glu Lys Phe165 170 175Pro Asp Ile Leu Lys Asp Phe Pro Asn Ile Lys Ser Phe Gln Gly Arg180 185 190Met Thr Gln Ile Pro Ala Ile Ser Arg Phe Leu Gln Pro Gly Ser Lys195 200 205Arg Lys Pro Ala Pro Asp Glu Lys Tyr Leu Lys Asn Val Val Glu Val210 215 220Leu Asn Leu Lys Leu Pro Leu225 230<210>7<211>405<212>DNA<213>Cirrhinus molitorella(鯪魚)<220>
<221>CDS<222>(1)..(405)<400>7
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25atc ctg aac tac atc gca gga aag tac aat cta tat gga aaa gac ctt 48Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu1 5 10 15aaa gaa agg gct ctg att gac atg tat aca gag ggt gcc atc gat cta 96Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Thr Glu Gly Ala Ile Asp Leu20 25 30atg gat cag att ata acg ctt cct ttt aca cca cct gsa aac aaa cag 144Met Asp Gln Ile Ile Thr Leu Pro Phe Thr Pro Pro Glu Asn Lys Gln35 40 45aaa caa ctc agt aac ata gag gaa aag gca aaa gat cgc tet tta cct 192Lys Gln Leu Ser Asn Ile Glu Glu Lys Ala Lys Asp Arg Tyr Leu Pro50 55 60gca ttt gaa aag ggt ctt aaa aac tct cag ttc ctt gtg gga aac cag 240Ala Phe Glu Lys Gly Leu Lys Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln65 70 75 80ttg agc cgt gca gac gtt cac ctt ctt gaa gtc att ctg atg ttg cag 288Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu Val Ile Leu Met Leu Gln85 90 95gag tta ttc cca aca ata ctc tca acc ttt ccc aaa atc cag gca ttt 336Glu Leu Phe Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe100 105 110caa gag aaa atg aag gcc ttg cca aca gtc agc aag ttc ctc cag cca 384Gln Glu Lys Met Lys Ala Leu Pro Thr Val Ser Lys Phe Leu Gln Pro115 120 125ggc agc gct agg aaa cct cca 405Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro130 135<210>8<211>135<212>PRT<213>Cirrhinus molitorella(鯪魚)<400>8Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu1 5 10 15Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Thr Glu Gly Ala Ile Asp Leu20 25 30Met Asp Gln Ile Ile Thr Leu Pro Phe Thr Pro Pro Glu Asn Lys Gln35 40 45Lys Gln Leu Ser Asn Ile Glu Glu Lys Ala Lys Asp Arg Tyr Leu Pro50 55 60Ala Phe Glu Lys Gly Leu Lys Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu Val Ile Leu Met Leu Gln85 90 95Glu Leu Phe Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe100 105 110Gln Glu Lys Met Lys Ala Leu Pro Thr Val Ser Lys Phe Leu Gln Pro115 120 125Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro130 135<210>9<211>591<212>DNA<213>Carassius auratu(鯽魚)<220>
<221>CDS<222>(1)..(591)<400>9tac ttc aat ggc aga ggg aag atg ggg tcg atc cga tgg ctg ctg gct 48Tyr Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met Gly Ser Ile Arg Trp Leu Leu Ala1 5 10 15gca gct gga gtc cag ttt gag gaa gtg ttt ttg acc aaa aga gag gag 96Ala Ala Gly Val Gln Phe Glu Glu Val Phe Leu Thr Lys Arg Glu Glu20 25 30tat gaa aag ctg ctc aaa gat gga gcc ctg atg ttc cag cag gtg cct 144Tyr Glu Lys Leu Leu Lys Asp Gly Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro35 40 45ttg gtg gaa atc gac ggg atg cag ctt gtg cag tcc aag gcc atc ctg 192Leu Val Glu Ile Asp Gly Met Gln Leu Val Gln Ser Lys Ala Ile Leu50 55 60aac tac atc gct gga aaa tac aat cta tat gga caa gac ctt aaa gaa 240
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Gln Asp Leu Lys Glu65 70 75 80cgg gct atg atc gac atg tat tca gag gga atc ggt gat ctc atg gac 288Arg Ala Met Ile Asp Met Tyr Ser Glu Gly Ile Gly Asp Leu Met Asp85 90 95ttg att ata atg tat cct ttc aaa ccg cct gaa aac aaa ccg gca cac 336Leu Ile Ile Met Tyr Pro Phe Lys Pro Pro Glu Asn Lys Pro Ala His100 105 110ctc aat act ata gag cag aag gcc aaa gat cgc ttt ctt cct gtg ttt 384Leu Asn Thr Ile Glu Gln Lys Ala Lys Asp Arg Phe Leu Pro Val Phe115 120 125gaa agg ggt ctt gcg aac tct cag ttc ctg gtg gga aac cag ctg agc 432Glu Arg Gly Leu Ala Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser130 135 140cgt gct gac gtt cat ctt ccc gag gtc act ctg atg ctg cag gag ctg 480Arg Ala Asp Val His Leu Pro Glu Val Thr Leu Met Leu Gln Glu Leu145 150 155 160ctc ccc acc att ctt tca acc ttt ccc aaa atc cag gcg ttt caa gat 528Leu Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe Gln Asp165 170 175aaa atg aag gcc ttg cca aca atc agc aag ttt ctc cag cca ggc agc 576Lys Met Lys Ala Leu Pro Thr Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro Gly Ser180 185 190gct agg aaa cct cca 591Ala Arg Lys Pro Pro195<210>10<211>197<212>PRT<213>Carassius auratu(鯽魚)<400>10Tyr Phe Asn Gly Arg Gly Lys Met Gly Ser Ile Arg Trp Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Ala Gly Val Gln Phe Glu Glu Val Phe Leu Thr Lys Arg Glu Glu20 25 30Tyr Glu Lys Leu Leu Lys Asp Gly Ala Leu Met Phe Gln Gln Val Pro35 40 45Leu Val Glu Ile Asp Gly Met Gln Leu Val Gln Ser Lys Ala Ile Leu50 55 60Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Gln Asp Leu Lys Glu65 70 75 80Arg Ala Met Ile Asp Met Tyr Ser Glu Gly Ile Gly Asp Leu Met Asp85 90 95Leu Ile Ile Met Tyr Pro Phe Lys Pro Pro Glu Asn Lys Pro Ala His100 105 110Leu Asn Thr Ile Glu Gln Lys Ala Lys Asp Arg Phe Leu Pro Val Phe115 120 125Glu Arg Gly Leu Ala Asn Ser Gln Phe Leu Val Gly Asn Gln Leu Ser130 135 140Arg Ala Asp Val His Leu Pro Glu Val Thr Leu Met Leu Gln Glu Leu145 150 155 160Leu Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe Gln Asp165 170 175Lys Met Lys Ala Leu Pro Thr Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro Gly Ser180 185 190Ala Arg Lys Pro Pro195<210>11<211>405<212>DNA<213>Ctenopharyngodon idella(草魚)<220>
<221>CDS<222>(1)..(405)<400>11atc ctg aac tac atc gca gga aag tac aac ctc tat gga aaa gac ctt 48Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu1 5 10 15aaa gaa cgg gct ttg att gac atg tat aca gag ggt acc ctc gat cta 96Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Thr Glu Gly Thr Leu Asp Leu20 25 30
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25atg gat att atc atg ctg tgg gct att gag aca ccc gaa aac aaa cag 144Met Asp Ile Ile Met Leu Trp Ala Ile Glu Thr Pro Glu Asn Lys Gln35 40 45aaa cag ctc agt aat ata gag caa aag gca aaa gag cgc ttc ctt cct 192Lys Gln Leu Ser Asn Ile Glu Gln Lys Ala Lys Glu Arg Phe Leu Pro50 55 60gtg ttt gaa aag ggt ctt gca aac tct gat ttc ctg gtg gga aac cag 240Val Phe Glu Lys Gly Leu Ala Asn Ser Asp Phe Leu Val Gly Asn Gln65 70 75 80ttg agc cgt gct gac gtt cac ctt ctg gaa gcc act ctg acg ctg cag 288Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu Ala Thr Leu Thr Leu Gln85 90 95gag ata tta cct aca ata ctg tca acc ttt ccc aaa atc cag gcg ttt 336Glu Ile Leu Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe100 105 110cag gaa cga atg aag gct tta cca aga atc agc aag ttc ctg cag cct 384Gln Glu Arg Met Lys Ala Leu Pro Arg Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro115 120 125ggc agc gct agg aaa cct cca 405Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro130 135<210>12<211>135<212>PRT<213>Ctenopharyngodon idella(草魚)<400>12Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu Tyr Gly Lys Asp Leu1 5 10 15Lys Glu Arg Ala Leu Ile Asp Met Tyr Thr Glu Gly Thr Leu Asp Leu20 25 30Met Asp Ile Ile Met Leu Trp Ala Ile Glu Thr Pro Glu Asn Lys Gln35 40 45Lys Gln Leu Ser Asn Ile Glu Gln Lys Ala Lys Glu Arg Phe Leu Pro50 55 60Val Phe Glu Lys Gly Leu Ala Asn Ser Asp Phe Leu Val Gly Asn Gln65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Asp Val His Leu Leu Glu Ala Thr Leu Thr Leu Gln85 90 95Glu Ile Leu Pro Thr Ile Leu Ser Thr Phe Pro Lys Ile Gln Ala Phe100 105 110Gln Glu Arg Met Lys Ala Leu Pro Arg Ile Ser Lys Phe Leu Gln Pro115 120 125Gly Ser Ala Arg Lys Pro Pro130 135<210>13<211>399<212>DNA<213>Siniperca chuatsi(鱖魚)<220>
<221>CDS<222>(1)..(399)<400>13atc ctg aac tac atc gca ggg aag tat aac ctt cat gga aaa ggc ctc 48Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu His Gly Lys Gly Leu1 5 10 15aaa gac cgt gtc atg atc aat ata tac tca gag gga gtg atg gat ctc 96Lys Asp Arg Val Met Ile Asn Ile Tyr Ser Glu Gly Val Met Asp Leu20 25 30atg gaa atg atc atg atg ttg ccc ttc agc cca gat cca aaa gaa aaa 144Met Glu Met Ile Met Met Leu Pro Phe Ser Pro Asp Pro Lys Glu Lys35 40 45ctg gat act att caa act aaa gca aaa gat cgc tac ctt cct gtg ttt 192Leu Asp Thr Ile Gln Thr Lys Ala Lys Asp Arg Tyr Leu Pro Val Phe50 55 60gaa aag gcg ctg tct ggg caa ata tac ctg gtt gga ggt aaa cta agt 240Glu Lys Ala Leu Ser Gly Gln Ile Tyr Leu Val Gly Gly Lys Leu Ser65 70 75 80tgt gca gac gtg cag ctg ctt gaa tgc acc ctg atg ttg gag gag aaa 288Cys Ala Asp Val Gln Leu Leu Glu Cys Thr Leu Met Leu Glu Glu Lys85 90 95ttt act gga atc ctc tct gag ttt ccc aac gtc aag tct ttc cag ggc 336Phe Thr Gly Ile Leu Ser Glu Phe Pro Asn Val Lys Ser Phe Gln Gly
鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGSTcDNA全序列或部分序列.ST25100 105 110agg atg atc cag att cct gcc atc aac agg ttc ctg cag cca ggc agc 384Arg Met Ile Gln Ile Pro Ala Ile Asn Arg Phe Leu Gln Pro Gly Ser115 120 125gct agg aaa cct cca 399Ala Arg Lys Pro Pro130<210>14<211>133<212>PRT<213>Siniperca chuatsi(鱖魚)<400>14Ile Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Lys Tyr Asn Leu His Gly Lys Gly Leu1 5 10 15Lys Asp Arg Val Met Ile Asn Ile Tyr Ser Glu Gly Val Met Asp Leu20 25 30Met Glu Met Ile Met Met Leu Pro Phe Ser Pro Asp Pro Lys Glu Lys35 40 45Leu Asp Thr Ile Gln Thr Lys Ala Lys Asp Arg Tyr Leu Pro Val Phe50 55 60Glu Lys Ala Leu Ser Gly Gln Ile Tyr Leu Val Gly Gly Lys Leu Ser65 70 75 80Cys Ala Asp Val Gln Leu Leu Glu Cys Thr Leu Met Leu Glu Glu Lys85 90 95Phe Thr Gly Ile Leu Ser Glu Phe Pro Asn Val Lys Ser Phe Gln Gly100 105 110Arg Met Ile Gln Ile Pro Ala Ile Asn Arg Phe Leu Gln Pro Gly Ser115 120 125Ala Arg Lys Pro Pro130
權利要求
1.一種淡水養殖魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒，包含淡水養殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引物，用于PCR擴增的DNA多聚酶，PCR反應緩沖液，dNTP溶液。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述淡水養殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引物為鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚中任一種或任兩種或任兩種以上隨機組合以至全部的去毒酶基因特異性檢測引物。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述淡水養殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引物是以鰱魚、鳙魚、羅非魚、鯪魚、鯽魚、草魚、鱖魚的sGST去毒酶基因cDNA序列為基礎設計的，其cDNA序列分別如SEQ ID NO1、SEQID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13所示。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述用于PCR擴增的DNA多聚酶為rTaq、Pfu、Taq Plus、HotStart Taq、Taq Platinum或Pyrobest；所述PCR反應緩沖液為與該DNA多聚酶配套的反應緩沖液。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述dNTP溶液的濃度為2.5mM。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包含有作為外參照的淡水養殖龜類的β-肌動蛋白mRNA表達檢測引物。
7.權利要求1或6所述的試劑盒，其特征在于還包含用于cDNA合成的oligo(dT)18通用引物和反轉錄酶、反應緩沖液。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述反轉錄酶為AMV、Stratascript，Suprscript和Suprscript II、SuperScriptIII或M-MLV，所述反應緩沖液為與該反轉錄酶配套的反應緩沖液。
9.一種權利要求7所述試劑盒的檢測方法，其步驟為(1)提取與純化淡水養殖魚類的肝臟總RNA，以oligo(dT)18作為反轉錄引物，采用反轉錄方法合成cDNA；(2)以(1)合成的cDNA為模板，取與該模板相應魚種的sGST去毒酶基因表達檢測引物、DNA多聚酶、PCR反應緩沖液、dNTP、滅菌蒸餾水等適量混合，進行PCR反應，反應條件為首先94℃預變性3～6min，然后94℃30sec～1min，55～65℃30sec～1min，72℃30sec～1min，共25～32個循環，最后72℃延伸5～10min；(3)以(1)合成的cDNA為模板，β-肌動蛋白mRNA表達檢測引物、DNA多聚酶、PCR反應緩沖液，dNTP，滅菌蒸餾水，混合，進行PCR反應，反應體系和反應條件同(2)；(4)PCR反應完成后，取等量的(2)和(3)的PCR產物經1～2％含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，對產物亮度進行檢測比對，確定sGST去毒酶基因的基因表達情況。
全文摘要
本發明公開了一種淡水魚類體內毒物含量的終點檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包含有淡水魚類包括鰱魚、鳙魚、草魚、鯽魚、鯪魚、羅非魚、鱖魚中任一種或任兩種或任兩種以上隨機組合以至全部的sGST去毒酶基因表達檢測引物、DNA多聚酶、PCR反應緩沖液、dNTP溶液等，還含有作為外參照的淡水魚類的β－肌動蛋白mRNA表達檢測引物。本發明還公開了魚類體內毒物含量的終點檢測方法，該方法基于不同毒物最終均將導致魚體肝臟可溶性谷胱甘肽－S－轉移酶(sGST)基因的表達，通過檢測該基因的表達水平即可反映生物體受不同毒物的污染情況。通過采用該檢測試劑盒和檢測方法可以簡便而可靠檢測淡水魚類體內所含的毒物含量，進而確定了淡水魚類的食用安全問題。
文檔編號C12Q1/68GK1840711SQ200610033079
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月20日 優先權日2006年1月20日
發明者梁旭方, 葉衛, 陳小佳, 劉韜, 符云, 廖婉琴, 王琳, 端金霞, 馬旭 申請人:暨南大學