在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽、基因片段及其克隆方法

文檔序號：441349閱讀：291來源：國知局

專利名稱：在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽、基因片段及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽、基因片段及其克隆方法。
背景技術：
植物對滲透脅迫的反應是一個多基因控制的復雜過程。不同植物對滲透脅迫的反應也不盡相同，具有豐富的多樣性。但是，對滲透脅迫的細胞水平的反應則似乎在整個生物界都是保守的(Yancey等，1982)。已有相當多的例子表明，從高等植物中獲得的一些基因，往往是間接利用了從動物、低等植物、甚至是酵母、細菌中發現的該類同源基因才分離出來的。實際上，這些同源基因也經常被直接應用于轉基因作物遺傳改良中。
同樣的道理，鹽藻(Dunaliella viridis)就是一個具有這樣特性的真核單細胞綠藻(Cowan等，1992)。它的抗環境脅迫的能力異乎尋常，尤其是滲透脅迫，可以在從接近淡水(NaCl＜50mM)直到飽和鹽水(NaCl＞5M)的環境中生長。因此，鹽藻因其極強的耐受滲透脅迫和其它極端環境的能力被作為研究耐逆機制及其發掘抗逆基因的模式生物而倍受關注(Hans J.Bohnert等.2001)。
基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)技術(Velculescu，V.E.等，1995)是近年興起并應用于細胞生殖、發育、分化、癌變等生命過程有關基因的差異表達以及相關基因的分子克隆的有效的方法之一(Desai S.等.2000)。
為了更好地從分子水平上對鹽藻進行耐鹽機制的研究和發掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源，本領域迫切需要利用當前的分子生物學技術(如基因表達系列分析技術、基因芯片及生物信息學等)開發在鹽脅迫過程中受到誘導和阻遏表達的基因。

發明內容
本發明的目的在于提供低鹽和高鹽滲透脅迫相關的基因片段。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽，其特征在于它包含4個在低鹽環境下高表達的標簽和4個在高鹽條件下高表達的標簽，該8個標簽對應的序列為序列表中的SEQ ID No1-8。
上述的低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽克隆出的基因片斷，其特征在于上述的8個標簽對應的基因片斷的堿基序列為序列表中的SEQ ID No9-16。
上述的基因片斷，其特征在于SEQ ID NO9～12所代表的基因片段在低鹽滲透脅迫環境下呈現高水平表達，高鹽滲透環境下低水平表達，SEQ ID NO13～16所代表的基因片段在高鹽滲透脅迫條件下呈現高水平表達，低鹽滲透條件下低水平表達。
上述的基因片段的克隆方法，其特征在于，該方法的具體步驟為a.取在分別含有0.5M NaCl和3M Nacl的DM培養基中穩定培養的鹽藻細胞提取總RNA，利用基因表達系列分析建立SAGE文庫，通過測序和生物信學分析分別得到受低鹽誘導表達和受高鹽誘導表達的標簽；b.根據步驟a所得的標簽各設計一個引物，以cDNA文庫為模板，再配合文庫中載體上的引物M13(-20)Forward Primer進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的產物并克隆進T-Easy載體，再使用通用引物M13Reverse Primer進行測序，從而得到對應標簽的基因片段。
本發明使用SAGE技術由極端模式生物鹽藻(Dunaliella viridis)中得到8個與鹽脅迫相關的基因標簽，通過PCR獲得對應標簽的基因片段，經RT-PCR驗證這8個分別在低滲和高滲脅迫條件下表達水平呈現極大差異的基因片段SEQ ID NO9～16，確實與鹽脅迫相關基因，為進一步研究鹽藻耐鹽分子機制奠定了基礎。

圖1是鹽藻在0.5M NaCl和3.0M NaCl脅迫環境下的總RNA。其中泳道1為0.5MNaCl，泳道2為3.0M NaCl。
圖2是處于0.5M NaCl和3M NaCl環境下鹽藻細胞內4個與低鹽脅迫相關的基因表達情況。泳道1，3，5，7分別是4個受低鹽誘導基因在低鹽環境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8分別是4個受低鹽誘導基因在高鹽環境下的RT-PCR。
圖3是處于0.5M NaCl和3M NaCl環境下鹽藻細胞4個與高鹽脅迫相關的基因表達情況。泳道1，3，5，7分別是4個受高鹽誘導基因在低鹽環境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8分別是4個受高鹽誘導基因在高鹽環境下的RT-PCR。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次從鹽藻(Dunaliella viridis)中，利用基因表達系列分析方法結合生物信息學方法從極端耐鹽的模式生物鹽藻中克隆到8個與鹽脅迫相關的基因標簽。根據這8個標簽克隆到對應的基因片斷，通過RT-PCR對這8個基因在細胞內的表達水平進行驗證。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件和Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology-ALaboratory Manual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一1.與鹽脅迫相關的基因標簽的分離為了分離鹽藻中與鹽脅迫相關的基因標簽，在含有0.5mol/LNaCl和3mol/LNaCl的DM培養基(Sun Y.等，2005)中穩定培養的鹽藻培養至107細胞/ml，5,000g，4℃離心10分鐘收集細胞，提取總RNA(Trizol kit，Invitrogen)，總RNA經變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析和定量。以總RNA為模板，利用基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)建立SAGE文庫，采用通用引物M13Reverse Primer，雙脫氧法(DYEnamic ET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析儀(MegaBACE 4500)對文庫進行測序。所得到序列經軟件SAGE2000v45等分析，分別得到4個在低鹽環境下高表達和4個在高鹽條件下高表達的標簽。
2.與鹽脅迫相關的基因片斷的分離根據8個標簽各設計一個引物，L SEQ ID NO1CATGCATCAAATGCACATACAL SEQ ID NO2AGTTTCACGCAGGAACCCATGL SEQ ID NO3AGCAGGCCTGTGGCTACATGL SEQ ID NO4GTTGTTTGTGCCTGCATCATH SEQ ID NO5CATGCTTAGGCGACCATTAGCH SEQ ID NO6CTGTTGATCTGCCTCAGCATGH SEQ ID NO7TTCTCACA GAAGAAGGCATGH SEQ ID NO8CATGAAATGTACAAGAGTAGA
以cDNA文庫(λ噬菌體文庫)為模板，再配合文庫中載體上的通用引物M13(-20)Forward Primer進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的產物并克隆進T-Easy載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布含有氨卞青霉素的LB平板，37℃，培養14小時，挑取單克隆，液體培養14小時，37℃，250rpm，減法抽提質粒，酚抽提純化，再使用通用引物M13 Reverse Primer雙脫氧法(DYEnamicET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析儀(MegaBACE 4500)進行測序。
實施例二RT-PCR驗證基因表達分別以0.5M NaCl和3.0M NaCl脅迫環境下總RNA為模板，Oligo(dT)16作引物進行反轉錄。根據上述8個基因片段的序列分別設計一對引物以稀釋至1/20的反轉錄產物作模板進行PCR，PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳分析，證明了SEQ ID NO9～12所代表的4個基因在低鹽滲透環境下高水平表達，而SEQID NO13～16所代表的4個基因在高鹽滲透脅迫條件下高水平表達，這個結果與SAGE文庫結果顯示的一致。
實施例三tBLASTx比對基因片段分離出的4個在低鹽滲透脅迫環境下呈高表達的鹽藻基因片段，除了SEQ IDNO10編碼了一個已知的葉綠素a/b結合蛋白(chlorophyll a/b binding protein)，SEQ IDNO12與水稻中有同源基因，但功能目前未知，其余2個基因在Genbank中無同源序列發現，可能是新的基因。
分離出的4個在高鹽滲透脅迫條件下呈現高水平表的的鹽藻基因片段，除了SEQID NO13編碼了一種新型的類胡蘿卜素結合蛋白(novel carotenoid-binding protein)，SEQ ID NO14與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中磷轉運蛋白(putativePi-transporter homologue B1)同源，其余2個基因在Genbank中無同源序列發現，可能是新的基因(表1)。
表1在低滲和高滲條件下呈現大差異的8個標簽所對應的基因

序列表<110>上海大學<120>在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達的標簽、基因片段及其克隆方法<160>16<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>1catgcatcaa atgcacatac a21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2agtttcacgc aggaacccat g21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3agcaggcctg tggctacatg 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gttgtttgtg cctgcatcat g21<210>5
<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5catgcttagg cgaccattag c21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>7ttctcacacg aagaaggcat g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>8catgaaatgt acaagaagtag a 21<210>9<211>742<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>9ggagatctac taccctggag gaacccccga ggacactggc ctggagtctg agcaaatcgt gagcagcatt ttcaacaacactgctgcccc tgagccgggc tccaggaagc tgctggccgt gaaccgcaac ctttacgaca gcagtggccc tggtgcgtacggcagcacga ctgactttgg cacttttgag tccgctgtct cggactcagg cttccagtca tcatcagaca caggtgatgatggggcagcc cagggtctga gggctggcct gctgtcaggt gtggcagctg ttttcctgtc tttctttttc ctgtctgggatcagtctgtg agcagtgaat tgttcttgat ggttgatatg agcttgagag cggtccttgg cgttagccat tcatgatgacctggacggag cgacctctta attcattctc aaagctgcat ttaatttggt ttatgcctgg atttcattta ttacttccgtggaactctgg acctactaat gtcccataat tgtcttgatt gtaccattga tgctgctgaa aagttgcatt cattaattaataaatgctac cattgatgtt acaaagttcg catttataca ttttaactga ttgttttgag cttaattgct gaccaggtgcttcattgttg cggcaataat tcattattct ttatttatat taatttcctg ggctttcttt cactggcttg gtttttattgatgtatgtgc atttgatgca tg 742<210>10<211>812<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>10cctgagctac tgggcaaggc cggcatcatc cccgagtcca ctggcctgac ctggtttgag gcaggtggcc tggacagctctaagagtctg atcgctgtgc ccttcaccag cgacatcccc ttccagtact ggaccgacaa gtacacccta ctgttcaccatgcacgctgc catgggattt gcggagttca ggcgctggca ggagtacaag gagcctggat ccgtccaaaa gcagtggttcctcggcctgg agagctttac accctcctct ggtgcccagc ctgcttaccc cggaggcggc ttcttcaact ttgcaggctttggaaaggag ggagaggaga agatgttcga acttaagacc aaggagatca ggaacggccg gctggcaatg
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1.鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3，其特征在于該基因具有SEQ NO 1所示的堿基序列。
2.根據權利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的編碼蛋白，其特征在于該基因具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
3.根據權利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2為引物，采用PCR方法從鹽藻的BAC文庫中篩選出一個不同于已知碳酸酐酶的鹽藻基因組BAC克隆，該BAC克隆的大小為60kb；b.將上述BAC克隆隨機打斷為2～4kb的小片段，裝入測序載體，構建了該BAC克隆的鳥槍文庫；c.大通量提取鳥槍文庫的質粒DNA，在MegaBACE 4500上進行序列的測定；每個鳥槍質粒利用M13正反向引物，進行雙向測序；d.在RedHat Linux平臺的并聯計算機群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構建亞克隆并測序以填補出現在序列之中的缺口，最終得到鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全長序列。
4.根據權利要求3所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的篩選BAC克隆的PCR方法的程序為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30 cycles；72℃ 10min；引物序列DCA3(+)-2 ACG GTT GTT GGT GAT GGC AGDCA3(-)-2 TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。
全文摘要
本發明涉及在低鹽和高鹽滲透脅迫下杜氏鹽藻(Dunlaliella virids)差異表達基因片段及其分離方法。本發明使用SAGE技術由極端模式生物鹽藻(Dunaliellaviridis)中得到8個與鹽脅迫相關的基因標簽，通過PCR獲得對應標簽的基因片段，經RT－PCR驗證這8個受鹽脅迫誘導表達的基因片段SEQ ID NO9～16，確實與鹽脅迫相關基因。其中，SEQ ID NO9～12所代表的4個基因在低鹽滲透環境下高水平表達，在高鹽滲透環境呈低水平表達；而SEQ ID NO13～16所代表的4個基因在高鹽滲透脅迫條件下高水平表達，低鹽滲透脅迫條件下呈低水平表達。為進一步研究鹽藻耐鹽分子機制奠定了基礎。
文檔編號C12N15/10GK1920042SQ200610029210
公開日2007年2月28日申請日期2006年7月21日優先權日2006年7月21日
發明者宋任濤, 許政暟, 張雨申請人:上海大學

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